流式细胞凋亡分析-文档资料
流式测凋亡原理步骤和结果判断
流式双染测凋亡原理、步骤和结果判断一、原理：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC）标记，以标记了荧光素（FITC）的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够穿透细胞膜而使细胞核红染，所以PI主要检测坏死或中晚期调亡细胞（二者的膜都发生了破裂）。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将早期凋亡细胞和中晚期以及坏死细胞区分开来。
二、步骤：1、无菌条件下获取新鲜的肝组织，置于事先消毒好的200目不锈钢细胞筛网上，下接50ml小烧杯。
用眼科剪把组织剪成小块，眼科镊去除小血管及结缔组织，用玻璃棒轻轻研磨组织，使细胞脱落。
待研磨充分后，用5％预冷的RPMI-1640液冲洗，收集小烧杯中单细胞悬液，随后以500-1000r/min离心5min ,弃上清。
重悬、离心洗涤2次 ,以获得较纯化的肝细胞。
将肝细胞悬液取样在光镜下用血细胞计数板计数，调节细胞数目至1×106 ∕ml。
2、取1ml单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤两次，然后加入1×结合缓冲液1ml重悬细胞。
3、取100ul加入到5ml的培养管中，加入5ulFITC标记的Annexin-V和5ul PI，混匀后室温下避光孵育15min，然后再加入400ul的1×结合缓冲液。
整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
4、反应完毕后尽快在一小时内上机检测，用FL1通道检测FITC- Annexin V荧光，FL2通道检测PI荧光。
流式细胞仪检测凋亡
流式细胞仪检测凋亡细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。
由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。
因此，具有其它方法无可比拟的优越性。
本文主要结合我室的一些实际经验，力图简单明了的介绍流式在检测凋亡方面的应用。
下面是一幅凋亡过程图。
在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f－1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。
在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，我室曾经检测过的方法包括：1线粒体功能2DNA Cycle3 Caspases4Annexin V Assay6DNA Fragmentation Assays基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。
线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。
其检测主要采用阳离子型荧光染料。
原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。
可以在荧光显微镜下，或流式检测。
采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。
整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。
Caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。
即使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。
在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。
在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。
Annexin－V是一种35－36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。
细胞凋亡 流式
细胞凋亡流式导言细胞凋亡（Apoptosis）是细胞程序性死亡的一种形式，被认为是生命发展中非常重要的一环。
细胞凋亡通过一系列精确的信号传导和分子机制来调控，以保持细胞内外环境的平衡。
流式细胞术（Flow cytometry）是一种高效的技术手段，可以用于检测和分析细胞凋亡。
细胞凋亡的定义与特征细胞凋亡是一种高度保守的细胞死亡方式，与其他形式的细胞死亡如坏死和自噬有明显的区别。
细胞凋亡的特征包括细胞体积减小、细胞核形态变化、染色体DNA切割以及胞外囊泡的形成等。
细胞体积减小细胞凋亡过程中，细胞体积逐渐减小是一个显著特征。
通常细胞凋亡前期，细胞体积较正常时期减小约20%至30%。
细胞核形态变化在细胞凋亡过程中，细胞核也经历一系列形态上的变化。
最早期细胞凋亡的特征之一是染色质浓缩沉积，出现核固缩现象，此时核仁消失。
后期细胞凋亡的特点是细胞核膨胀，染色质进一步凝缩，核质交界明显。
DNA切割和胞外囊泡的形成细胞凋亡进程中，细胞核DNA会出现明显的切割现象，形成特定的DNA片段。
这一片段长度通常为200bp的倍数，紧接着凋亡细胞进行DNA的固缩和包裹形成胞外囊泡。
细胞凋亡的信号传导机制细胞凋亡的调控包括许多信号传导分子和途径的参与，其中最关键是细胞凋亡信号通路的激活和效应基因的表达调控。
以下是细胞凋亡信号传导机制的一些重要组分。
细胞凋亡信号通路细胞凋亡信号通路主要包括内源性和外源性两类通路。
内源性通路通过一系列激活因子（如细胞因子、激素）调控细胞凋亡。
外源性通路主要是通过细胞外因素（如放射线、化学药物）诱导细胞凋亡。
Bcl-2家族蛋白Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡过程中的一类重要调控因子。
Bcl-2家族蛋白包括抑制性成员和促进性成员，通过调节线粒体膜电位和细胞色素c释放等机制参与细胞凋亡。
单独凋亡信号通路除了Bcl-2家族蛋白，细胞凋亡信号通路中还有许多其他独立的分子机制参与调控。
例如，肿瘤坏死因子受体（TNFR）信号通路和热休克蛋白（HSP）信号通路等。
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度。
凋亡是一种正常的细胞死亡形式，它在维持机体内细胞平衡中起着重要的调节作用。
在流式细胞凋亡结果解读中，我们通常会关注两个参数：细胞凋亡率和凋亡程度。
细胞凋亡率是指在一定细胞总数中凋亡细胞数量所占的比例。
常用的流式细胞仪会使用特定的荧光探针，如Annexin V和PI，以区分细胞的生死状态。
Annexin V可以结合在凋亡细胞表面的磷脂，而PI则能够进入已损伤的细胞。
通过流式细胞仪的检测和分析，我们可以确定细胞的凋亡率。
凋亡程度是指凋亡细胞中发生的具体变化。
在凋亡过程中，细胞会发生DNA 断裂和染色质凝固，体积也会减小。
通过流式细胞仪可以进一步评估这些变化。
例如，可以使用荧光染料如Hoechst 33342染色核酸，以观察DNA断裂。
同时，还可以使用其他荧光探针或标记特定蛋白来检测凋亡相关的分子信号途径。
通过准确评估细胞凋亡率和凋亡程度，我们可以了解细胞对于各种刺激的响应和机体内细胞死亡的调节情况。
这对于研究疾病的发生机制、药物研发以及评估治疗效果都具有重要意义。
总之，流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度和凋亡细胞比例。
这种评估可以为我们研究细胞死亡的机制和判断治疗效果提供重要的参考。
细胞凋亡流式检测实验方案
细胞凋亡流式检测实验方案掌握细胞凋亡的检测方法，了解细胞凋亡的发生机制。
二、实验原理细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡过程，是正常细胞生长、发育和组织维持的重要机制。
细胞凋亡的发生涉及许多生物化学过程，包括蛋白酶的激活、蛋白磷酸化、核酸降解等。
目前，常用的细胞凋亡检测方法有DNA损伤、凋亡相关蛋白（如Caspase）的活性检测、Annexin V染色体外膜表面的磷脂酰胆碱变化等。
三、实验材料1. 细胞培养基、PBS缓冲液；2. Annexin V-PE/7-AAD染色试剂盒；3. 离心管、试管、离心机等。
四、实验步骤1. 将细胞接种于96孔或24孔板中，待细胞生长到适当密度后，按照不同处理方式分为不同组。
2. 处理细胞，如加入药物、病毒等，切换培养基等。
3. 用PBS缓冲液洗涤一次细胞，加入含Annexin V-PE/7-AAD染色试剂的PBS缓冲液，室温下酒暗处理15分钟。
4. 加入PBS缓冲液洗涤一次细胞，加入PBS缓冲液悬浮细胞，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度。
五、实验结果分析1. Annexin V染色阳性、7-AAD染色阴性：表明细胞凋亡早期，细胞膜磷脂酰胆碱翻转，但细胞核仍完整无损。
2. Annexin V染色阳性、7-AAD染色阳性：表明细胞凋亡晚期，细胞膜磷脂酰胆碱翻转，细胞核已经破裂，DNA释放。
3. Annexin V染色阴性、7-AAD染色阴性：表明细胞无凋亡现象。
4. Annexin V染色阴性、7-AAD染色阳性：表明细胞处于坏死状态，细胞膜破裂，7-AAD染料可以进入细胞核结合DNA。
六、注意事项1. 实验过程中要注意无菌操作；2. 实验前要将所有实验材料消毒；3. 实验过程中要加强个人防护，穿戴实验室专用实验服、手套、口罩等；4. 实验结果分析时要注意对比组间差异明显性，结果分析应结合其他指标进行综合分析。
流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤
流式细胞仪检测细胞凋亡实验步骤流式细胞仪是一种用于检测和分析细胞的仪器，可以通过测量细胞的荧光和散射特性来了解细胞的生理状态和功能。
在细胞生物学研究中，流式细胞仪广泛应用于细胞凋亡实验。
细胞凋亡是一种重要的细胞程序性死亡方式，正常情况下是一种维持生态平衡的重要机制，而在疾病发生时，细胞凋亡的失控会导致一系列疾病的发生。
因此，对细胞凋亡的检测和研究具有重要意义。
本文将介绍流式细胞仪检测细胞凋亡的实验步骤。
实验材料和仪器流式细胞仪细胞培养物凋亡诱导剂PBS缓冲液1×绑定缓冲液1×洗涤缓冲液荧光标记的抗体PI（胰岛素脱羧酶）Annexin V-FITC套装实验步骤1.细胞处理首先，将培养好的细胞分到不同的培养皿中，添加凋亡诱导剂，以诱导细胞凋亡。
凋亡诱导剂的种类和浓度应根据实验的需要来确定。
通常可选择小分子化合物、放射线等方式来诱导细胞凋亡。
2.收集细胞处理好的细胞经过一定时间的培养后，使用离心机将细胞沉淀下来，并用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和凋亡诱导剂等杂质。
然后使用1×绑定缓冲液将细胞重悬。
3.细胞计数将细胞悬液加入细胞计数板中，用显微镜或自动细胞计数器计算细胞密度，并将细胞密度调整到合适的浓度。
4.细胞染色将调整好浓度的细胞悬液分到不同的离心管中，添加荧光标记的抗体和PI荧光染料。
荧光标记的抗体通常选择Annexin V-FITC，它可以与凋亡细胞膜表面磷脂酰丝氨酸结合，从而可以用于检测凋亡细胞；PI荧光染料用于检测坏死细胞。
5.混匀和孵育将离心管中的细胞悬液混匀均匀，然后在室温下孵育一定时间，通常为15-30分钟。
期间可以轻轻摇晃管子以保证充分的染色反应。
6.流式细胞仪检测染色反应结束后，将细胞悬液加入流式细胞仪的样品管中，通过流式细胞仪的激光和光电探测器，可以分辨出细胞的荧光和散射信号，从而获得细胞凋亡的信息。
使用流式细胞仪之前需要对仪器进行标定和调试，以确保获得准确和可靠的数据。
流式检测细胞凋亡
流式检测凋亡的讨论2010-07-15 14:28 来源：丁香园点击次数：15397 关键词：流式检测凋亡关于凋亡的流式检测wanhood一、PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1.细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2.光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器PBS溶液（配制方法见附录）；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1.收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
凋亡流式检测步骤
凋亡流式检测步骤引言：凋亡流式检测是一种用于检测细胞凋亡的分析方法，通过检测细胞内凋亡标志物的变化来评估细胞是否处于凋亡状态。
本文将介绍凋亡流式检测的步骤，并详细解释每个步骤的操作原理和注意事项。
一、样本制备在进行凋亡流式检测之前，需要准备细胞样本。
首先，将需要检测的细胞分离并洗涤，去除外部污染物。
然后，将细胞悬浮液转移至离心管中，并进行离心，去除上清液。
最后，重新悬浮细胞并加入合适的缓冲液，使细胞适应流式细胞仪的操作条件。
二、细胞固定将悬浮的细胞样本进行固定，以保持细胞的形态和结构。
常用的固定方法包括用乙醇或甲醛进行固定。
将固定液加入细胞悬液中，充分混合后静置一段时间，使细胞得到固定。
三、膜破损为了使细胞内的凋亡标志物暴露在细胞外，需要对细胞进行膜破损。
常用的方法是使用洗脱缓冲液，将固定的细胞进行洗涤，去除固定液中的残留物质。
四、孔隙形成在凋亡流式检测中，需要使用荧光标记的抗体或荧光探针来检测凋亡标志物。
为了使这些荧光标记的物质能够进入细胞内，需要在细胞膜上形成孔隙。
孔隙形成的方法有多种，如使用洗脱缓冲液中的成分或特定的酶。
五、荧光标记在细胞凋亡检测中，常用的荧光标记物有PI、Annexin V等。
将荧光标记物添加到细胞悬液中，与凋亡标志物结合。
不同的荧光标记物对应不同的凋亡标志物，根据需要选择合适的标记物进行检测。
六、流式细胞仪检测将荧光标记过的细胞样本装入流式细胞仪，通过激光束的照射，荧光标记物会发出特定波长的荧光信号。
流式细胞仪会对这些荧光信号进行检测和记录，并生成相应的数据。
七、数据分析通过流式细胞仪检测得到的数据可以进行进一步的分析。
可以通过设置荧光信号的阈值来划分细胞的凋亡状态，将细胞分为未凋亡、早期凋亡和晚期凋亡三个亚群。
也可以通过计算荧光信号的强度来评估细胞凋亡的程度。
八、结果解读根据数据分析的结果，可以判断细胞样本中凋亡细胞的比例和凋亡程度。
通过与对照组的比较，可以进一步评估样本中的异常情况。
流式检测凋亡的讨论
流式检测凋亡的讨论关于凋亡的流式检测wanhood一PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器PBS溶液（配制方法见附录）；PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇400目筛网流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
流式检测细胞凋亡
流式凋亡检测：A549 铺板 12孔板 1mL 10万cells / 孔 20-24h 细胞生长对数期进行加药。
计划24h ,48h 观察细胞状态上机检测。
1. 用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃离心5 min收集细胞。
胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性；2. 用4℃预冷的PBS (含2%FBS) 洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5 min。
收集1-5×105细胞；3. 加入500μL的Binding buffer 悬浮细胞，分装到流式管中4. 加入Annexin V-APC涡旋混匀，避光15min；加入7-AAD染色10min。
正常细胞组；阴性对照（双标）；阳性（APC单标）；阳性（7-AAD）单标；实验组（双标）上机检测：开机，连接仪器，画散点图，设置坐标，门等参数，开始检测，通过调节电压将正常细胞群分布在左下角象限，阳性（单标）调补偿，检测阴性（双标）作为对照，检测实验组。
1.细胞对数期铺板，细胞板可先用PBS润洗，计数10万cells /孔（1ml 12孔板）,待细胞贴壁后饥饿处理（用不含FBS的培养液）过夜。
2.加药干预；3.PBS清洗，胰酶消化，PBS洗两次 200g , 5min 75%乙醇（4℃）固定 4℃过夜；4.加入PBS重悬离心200g , 5 min ；5.RNA酶37℃孵育30min；5ul (10mg/mL)6.然后加5uL PI 4℃孵育30min；（终浓度50ug／mL）7.上机检测。
画散点图，FSC/SSC ; FL2-W/FL2-H ; 单标图：FL2-A调节参数：Threshold (閾值)FL2-H 即 DNA含量为閾值，设定值 24 以去除气泡与细胞碎片等低阶信号Detectors/AmpsFSC,SSC,FL2-H, FL2-W, FL2-A 倍增模式(Mode)：Lin上样检测调节电压（SSC）细胞分布在一团，设门获取细胞；调节FL2-H 电压(一般在400 左右)，观察图的改变，注意FL2-W/FL2-A 散点图上 G0/G1细胞群的位置，使它们的 FL2-A 信号落在200 左右。
流式细胞凋亡分析
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
目前已发现15个caspase家族成员分别 命名为caspase-1～15并根据其功能特点 分成两类即启动caspasecaspase-2、8、 9、10和效应caspasecaspase3、6、7
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
细胞凋亡的特征
生化特征： 2 核酸内切酶的激活：
细胞凋亡的特征
生化特征：
3 线粒体的变化：
线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱 导因子使线粒体通透性升高膜上巨型通道开 放使线粒体蛋白进入细胞液中线粒体膜两侧 质子不对称性消失线粒体膜电位迅速下降电 子传递与呼吸链解偶联
细胞凋亡的特征
生化特征：
3 线粒体的变化：
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
其中半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要作 用它具有一段携带活化位点的保守氨基酸序 列可以特异性识别、切割天冬氨酸转氨甲酰 酶残基由于这些蛋白酶具有相同的结构和功 能特性而被称为caspase
细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
caspase可能在凋亡细胞的形态变化中 起了主导作用Caspase通常是以酶原形式 存在通过其自身诱发的蛋白水解而转化为有 活性的酶活化的caspase进一步激活其他的 caspase前体形成了级联放大切割过程裂解 重要的大分子物质导致凋亡
概念
细胞凋亡的作用主要包括以下几方面：
清除无功能的细胞； 控制细胞数量； 清除病态的或有害的细胞； 清除多余的细胞；
细胞凋亡的特征
形态学特征：
光镜下凋亡细胞最突出的形态学特征是 细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱缩而 细胞膜保持完整其中胞核变化尤为突出染色 质的浓集可能是由于凋亡细胞核双链DNA 发生裂解所致细胞凋Leabharlann 与疾病细胞凋亡与免疫系统疾病：
流式检测细胞凋亡的原理
流式检测细胞凋亡的原理细胞凋亡，简称细胞死亡，是指由程序性细胞死亡，是生物体正常生长发育过程中必须的一环。
细胞从生长到级别最高的有机体，都将涉及到细胞凋亡这个过程，否则生物体将无法完成正常生长发育。
流式检测细胞凋亡是常见的生物学试验之一，它可以对细胞进行快速、准确的检测，为后续实验研究提供便利。
下面将主要介绍流式检测细胞凋亡的原理和步骤。
一、细胞的凋亡过程细胞凋亡是一种生物化学过程，它的主要过程是细胞凋亡重要调节因子激活细胞衰弱程序，导致细胞内分子分解代谢剩余物质的过程。
在这个过程中，会发生细胞内蛋白质降解、DNA碎片形成等一系列现象，最终导致整个细胞的死亡。
二、流式检测细胞凋亡的原理流式细胞术是一种常用的细胞学分析技术，其主要原理是应用光学探测技术，通过单极性离子、核糖体染色剂、荧光染料等特殊化学试剂，将暴露在细胞表面的遗传信息和表面分子等特征，转化为光信号进行检测和分析。
流式检测细胞凋亡实质上是采用流式细胞术技术，基于不同的信息特征分析细胞内外的化学变化，在细胞凋亡过程中，有一些化学变化可以被检测。
- 流式细胞术的样品准备。
首先需要将待测细胞减少到相同的浓度范围，对于稀缺细胞或者活细胞，可以使用双空室离心管，在离心管内使用半鸟嘴型腔吸管反复冲洗，接着加入抗体或者荧光染料等化学试剂处理5-10分钟。
接下来，用含有凝血剂的PBS洗液洗涤细胞。
- 流式细胞术的检测参数选择。
检测细胞凋亡的重要参数可以是DNA含量、细胞膜透性变化以及染色体结构的改变等，但细胞膜透性变化用EthD-1可以更好的达到。
- 流式细胞术中细胞的检测。
将细胞样品通过荧光素与流动细胞术相结合后，开始对细胞悬液进行检测，检测细胞表面分子的化学信息和代谢分解活性。
细胞在流动中遇到光束时，根据不同的荧光信号输出，流式细胞术将其区分为不同的类型，以便进行进一步分析和研究。
三、流式检测细胞凋亡的步骤1. 细胞培养和收集。
首先要将细胞置于适宜的培养基中，促进其生长和细胞凋亡。
202X年流式细胞凋亡分析-PPT文档(1)
细胞(xìbāo)凋亡与疾病
细胞(xìbāo)凋亡与肿瘤： 凋亡还可能与胃癌的血管生成有关。凋亡指数
与肿瘤内部微血管密度成负相关，并与胃癌的组 织类型有关。
第三十四页，共一百零六页。
细胞(xìbāo)凋亡与疾病
细胞凋亡与免疫系统疾病： 许多以免疫功能(gōngnéng)异常为主要特征的疾病
第二十七页，共一百零六页。
细胞凋亡(diāo wánɡ)的基因调控
常见的凋亡基因及其蛋白：
1 bcl-2 是研究最早的与凋亡有关的基因。 bcl-2 基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用的癌基因。 它是阻止细胞死亡的最后途径，而对细胞周期无明 显影响。它能抑制由许多因子，如化疗药物、某些 (mǒu xiē)病毒、p53、c-myc及生长因子等激发的凋 亡。
第十五页，共一百零六页。
细胞凋亡 的特征 (diāo wánɡ)
生化特征： 1 caspase蛋白酶：
启动caspase作用于凋亡信号触发后上游的不可 逆位点。效应caspase由启动胱冬肽酶激活，作用 于下游的执行位点，裂解细胞成凋亡小体。分子结 构相互联系(liánxì)的这两部分影响线粒体，通过线粒 体方式执行凋亡的信号。bcl-2家族成员能调节执行 位点的进程。
第十六页，共一百零六页。
细胞(xìbāo)凋亡的特征
生化特征(tèzhēng)： 1 caspase蛋白酶：
caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为 17kD和12kD亚单位组成的异二聚体。活化 的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其他 caspase、相关的胞质靶位点（细胞因子18， CK18)和细胞核靶位点。Caspase-3切割 CK18是凋亡过程中caspase切割发生的早期 指示因子。
流式细胞凋亡原理
流式细胞凋亡原理
细胞凋亡是一种由细胞内部调控的程序性死亡过程，它在生物体的正常发育过程中起到重要的作用。
在这个过程中，细胞通过一系列的生物化学反应，自我分解并最终死亡。
流式细胞凋亡分析是一种常用的方法，用于检测细胞凋亡的程度和特征。
流式细胞凋亡分析的基本原理是利用流式细胞仪对细胞进行分析。
通常，细胞凋亡会引起细胞中DNA的断裂和核蛋白的降解。
在实验中，细胞被染色剂如荧光素一亚胺（propidium iodide，PI）等染色，这种染色剂只能进入破损的细胞核，并与DNA结合。
通过流式细胞仪的激光器激发这些染色剂，然后根据细胞核中DNA的含量，可以将细胞分为不同的群体。
正常细胞的DNA含量通常是稳定的，而凋亡细胞的DNA会出现不同程度的断裂。
因此，通过分析细胞在不同区域的分布情况，可以推断细胞中凋亡的程度。
常用的方法是使用峰值计数，即测量细胞在不同区域的峰值数量，并将其与正常细胞进行比较。
此外，还可以使用其他标记物如ANNEXIN V等来检测细胞的凋亡程度。
流式细胞凋亡分析具有高通量、高准确性和高灵敏度的特点，因此在基础研究和临床诊断中得到了广泛应用。
它可以用于检测细胞凋亡的发生机制、筛选药物的活性以及评估治疗效果。
同时，流式细胞凋亡分析还可以与其他技术如细胞培养和基因表达分析等相结合，为细胞凋亡的研究提供更全面的信息。
流式细胞仪检测细胞凋亡Annexin VPI双染色法
流式细胞仪检测细胞凋亡——Annexin V/PI双染色法
实验步骤
1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106，/mL 500~1000r/min离心5min，弃去培养液。
2. 用孵育缓冲液洗涤1次，500~1000r/min离心5min。
3. 用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10~15min。
4. 500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。
5. 加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。
6. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm 的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
7. 结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。
正常活细胞与此相似。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
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细胞凋亡的特征
形态学特征：
电镜下，细胞核内可见高电子密度区， 这是核DNA在核小体连接处断裂成核小体 后，在异染色质区聚集形成的染色质浓缩 块。染色质聚集区以外的低电子密度区为 透明区，是由于核孔变大导致其通透性增 加，细胞质中水分不断渗入而造成。线粒 体增殖，呈空泡化。内质网腔扩大，为凋 亡细胞形成自噬体提供包裹膜。细胞骨架 变得致密、紊乱。
caspase可能在凋亡细胞的形态变化中 起了主导作用。Caspase通常是以酶原形 式存在，通过其自身诱发的蛋白水解而转 化为有活性的酶，活化的caspase进一步激 活其他的caspase前体，形成了级联放大切 割过程，裂解重要的大分子物质，导致凋 亡。
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细胞凋亡的特征
生化特征： 1 caspase蛋白酶：
并非所有凋亡细胞都能检测到这种典型的
19
生化特征。
细胞凋亡的特征
生化特征： 2 核酸内切酶的激活：
20
细胞凋亡的特征
生化特征： 3 线粒体的变化：
线粒体发生的重要改变之一就是凋亡诱 导因子使线粒体通透性升高，膜上巨型通 道开放，使线粒体蛋白进入细胞液中，线 粒体膜两侧质子不对称性消失，线粒体膜 电位迅速下降，电子传递与呼吸链解偶联。
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细胞凋亡的特征
生化特征：
2 核酸内切酶的激活：
细胞凋亡时，内源性核酸内切酶被激活，
将核小体间连接DNA降解，形成长度主要
为180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，组
蛋白和其他核内蛋白质不降解，核基质也
不改变。在DNA凝胶电泳分析中呈现出特
征性“梯状”条带，而细胞坏死时，DNA
片断大小不一，无“梯状”条带出现。但
流式细胞凋亡分析
1
概念
细胞凋亡（apoptosis）是指有核细胞 在一定条件下通过启动其内部自身机制， 主要是通过内源性DNA内切酶的激活而发 生的细胞死亡过程。细胞凋亡是受基因控 制的一种主动性细胞自杀过程，是生物体 中一种普遍存在的现象。
2
概念
细胞凋亡是维持人体正常生理过程和功 能活动所必需的，是多细胞生物生命活动 过程中不可缺少的组成内容，是其藉以存 活的需要，贯穿了生物全部生命周期中。
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细胞凋亡的特征
形态学特征： 凋亡细胞另一个形态特征通过总DNA提
取，DNA凝胶电泳分析，可呈现出梯状图 谱，可见清晰的DNA〝梯子〞(ladder)。
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细胞凋亡的特征
生化特征： 1 caspase蛋白酶：
细胞凋亡的发生和发展过程也可能是水 解酶级联切割的过程，它将大分子结构的 物质如DNA、细胞骨架水解变性成小分子 碎片，致使细胞发生凋亡。
制细胞凋亡。
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细胞凋亡的特征
生化特征： 4 胞质Ca2+和pH的变化：
细胞内Ca2+和H+浓度的稳定对维持生命 活动至关重要。胞内Ca2+库的释放，胞质 Ca2+与细胞凋亡关系密切。胞外Ca2+内流 促使胞质Ca2+持续升高，作为凋亡信号启 动凋亡发生。
23
细胞凋亡的特征
3
概念
细胞凋亡与细胞坏死（necrosis）是细 胞死亡的两种模式，但两者有明显的区别。 后者是由于细胞受到严重损伤或或大剂量 细胞毒药物作用后发生的被动分解过程， 并可导致周围组织的炎症反应。
4
概念
细胞凋亡的作用主要包括以下几方面： 清除无功能的细胞； 控制细胞数量； 清除病态的或有害的细胞； 清除多余的细胞；
目前已发现15个caspase家族成员，分 别命名为caspase-1～15，并根据其功能 特点分成两类，即启动caspase(caspase2、8、9、10）和效应caspase(caspase3、 6、7）。
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细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
启动caspase作用于凋亡信号触发后上 游的不可逆位点。效应caspase由启动胱冬 肽酶激活，作用于下游的执行位点，裂解 细胞成凋亡小体。分子结构相互联系的这 两部分影响线粒体，通过线粒体方式执行 凋亡的信号。bcl-2家族成员能调节执行位 点的进程。
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细胞凋亡的特征
形态学特征： 光镜下，凋亡细胞最突出的形态学特征
是细胞核固缩、染色质浓集、细胞变圆皱 缩而细胞膜保持完整，其中胞核变化尤为 突出。染色质的浓集可能是由于凋亡细胞 核双链DNA发生裂解所致。
6
细胞凋亡的特征
形态学特征：
DNA降解后，形成长度主要为180200bp的DNA片断，随后细胞裂解成许多 有膜包被的小体，称为凋亡小体 （apoptotic bodies),最后被巨噬细胞吞 噬，但不会引起周围组织的炎症反应。凋 亡小体是凋亡细胞特征性的标志。如在显 微镜下观察到凋亡小体，则可确认为细胞 发生了凋亡。
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细胞凋亡的特征
形态学特征：
9
细胞凋亡的特征
形态学特征：
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细胞凋亡的特征
形态学特征： 共聚焦显微镜观察，凋亡细胞膜电位和
线粒体膜电位下降，膜流动性降低。细胞 膜上新出现了一些生物大分子如磷脂酰丝 氨酸（phosphatidylserine,ps)和凝血酶 敏感蛋白等，这些分子的出现与凋亡细胞 的清除有关。
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细胞凋亡的特征
生化特征：
3 线粒体的变化：
线粒体膜电位的变化发生在细胞凋亡的
早期。线粒体膜电位是由于其内膜两侧质
子和其他离子分布不对称造成的。线粒体
参与了凋亡的调控和实施。与凋亡密切相
关的bcl-2家族分布在细胞内膜系统，其中
线粒体外膜上分布最多，bcl-2具有抑制线
粒体通透性变化的能力，并通过此途径抑
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细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：
caspase-3是最重要的指示蛋白酶，为 17kD和12kD亚单位组成的异二聚体。活 化的caspase-3可以蛋白水解切割和激活其 他caspase、相关的胞质靶位点（细胞因子 18，CK18)和细胞核靶位点。Caspase-3 切割CK18是凋亡过程中caspase切割发生 的早期指示因子。
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细胞凋亡的特征
生化特征： 1 caspase蛋白酶：
其中，半胱氨酸蛋白酶家族发挥了重要 作用。它具有一段携带活化位点的保守氨 基酸序列，可以特异性识别、切割天冬氨 酸转氨甲酰酶残基。由于这些蛋白酶具有 相同的结构和功能特性而被称为caspase。
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细胞凋亡的特征
生化特征：
1 caspase蛋白酶：