免疫磁珠富集与荧光定量PCR技术联合检测丙型肝炎病毒
荧光定量PCR联合ELISA检测丙型肝炎病毒的临床应用研究
例 临 床 已 确 诊 为 丙 型 肝 炎 患 者 的 血 清 ， 同 时 检 测 血 清 并 ＡＬ Ｔ。探 索 能 够 提 高 丙 型 肝 炎 病 毒 检 出 率 的 方 法 ， 临 床 诊 为 断丙 型 病 毒 肝 炎 ， 断 病 情 和疗 效 提 供 参 考 依 据 。 判
ｌ 对 象 和 方 法 １ ｌ 对 象 ＿
检 验 ， ＜ ００ Ｐ ． ５为 差 异 有 显 著 性 。
２ 结果
诊 和 住 院患 者 １７例 ， ６ 例 ， ５ １ 男 ７ 女 Ｏ例 ， 龄 ｌ ～７ 岁 ， 均 年 ４ ３ 平 ４ ． 岁 。 全部 病 例 均 为 已确 诊慢 性 丙 型 肝 炎 患 者 ， 除 其 它 ５０ 排
以 （ ｚ士 ｓ ）表 示 ， 间 比较 用 ｔ 验 ， Ｈ Ｖ —Ｒ 组 检 对 Ｃ ＮＡ 含 量 的
选 取 佳 木 斯 大 学 附 属 第 一 医 院 ２ Ｏ 一 Ｏ ～ ２ Ｏ一 Ｏ Ｏ ６ ｌ Ｏ ７ ８门
对 数 值 与 ＡＬ 含 量 进 行 线 性 相 关 关 系 分 析 和 相 关 性 显 著 性 Ｔ
关键词 ： 丙型 肝 炎病 毒 核 酸 ； 丙型 肝 炎病 毒 抗体 ； 荧光 定 量 逆 转 录聚 合 酶 链 反 应 ； 联 免 疫 吸 附试 验 ； 酶 丙氨 酸 氨 基 转 移 酶
中 图分 类 号 ： ４ ； １ ． ３ 文 献 标 识 码 ： Ｒ４ ６ Ｒ５ ２ ３ Ｂ 文 章 编 号 ： ０ ８ １ ４ ２ ０ ） ３ ０ １ 一Ｏ ｌ ０ —０ ０ （ ０ ８ ０ — ０ ７ ２
率 ∞ ］耽 误 了一 部 分 患 者 疾 病 的 治 疗 和 引 起 输 血 后 ＨＣ 感 “， Ｖ
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高灵敏荧光定量检测HCV-RNA在丙肝诊疗中的应用研究
2021年2月第11卷第3期CHINA MEDICINE AND PHARMACY Vol.11 No.3 February 2021175·检验医学·高灵敏荧光定量检测HCV-RNA在丙肝诊疗中的应用研究吴嘉锐 王 军 梁连辉 邓纪望 李淑丽 何 娟 蔡常辉广东省中山市第二人民医院检验中心，广东中山 528447[摘要]目的 观察评价分析高灵敏荧光定量检测丙型病毒性肝炎病毒核酸（HCV-RNA）在丙型病毒性肝炎诊疗中的应用效果。
方法 选择2018年2月至2019年2月中山市第二人民医院肝病门诊及戒毒所体检可疑感染丙肝的患者临床血清样本126例，分别采用HCV 磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA 水平。
结果 磁珠法试剂检测126例样本中有54例阳性，72例阴性；对照试剂检测126例临床样本中有44例阳性，82例阴性，磁珠法试剂定量检测血清中RNA 水平阳性率42.86%高于对照试剂34.92%（χ2=1.670，P =0.196）；磁珠法试剂和对照试剂的阳性样本具较好的一致性（P =0.0000），磁珠法试剂与对照试剂的定量检测结果具有线性相关(r =0.947，P ＜0.05)。
结论 磁珠法高灵敏荧光定量检测丙型肝炎病毒核酸（HCV-RNA）具有更高的灵敏度，是一种比较理想的HCV-RNA 定量检测试剂，值得临床大力推广应用。
[关键词] 丙型病毒性肝炎；丙型病毒性肝炎病毒核酸；高灵敏荧光定量；磁珠法[中图分类号] R473.71 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2021）03-0175-04Application research of highly sensitive fluorescence quantitativedetection of HCV-RNA in diagnosis and treatment of hepatitis CWU Jiarui WANG Jun LIANG Lianhui DENG Jiwang LI Shuli HE Juan CAI ChanghuiInspection Center, Zhongshan Second People's Hospital, Guangdong, Zhongshan 528447, China[Abstract] Objective To observe, evaluate and analyze the application efficacy of highly sensitive fluorescence quantitative detection of HCV-RNA in diagnosis and treatment of hepatitis C. Methods A total of 126 clinical serum samples of patients suspected to be infected with hepatitis C through physical examination in hepatic disease clinic and drug rehabilitation center of Zhongshan Second People's Hospital from February 2018 to February 2019 were selected. Meanwhile, the RNA level in serum was detected by the HCV magnetic bead method reagent and the control reagent respectively. Results Among 126 samples detected by magnetic bead method, 54 cases were positive, and 72 cases were negative, 44 cases were positive, and 82 cases were negative in 126 clinical samples detected by the control reagent. The positive rate of serum RNA level in serum detected by magnetic bead method was 42.86%, which was higher than 34.92% of the control reagent (χ2= 1.670, P = 0.196). The positive samples of magnetic bead reagent and control reagent had good consistency (P = 0.0000). There was a linear correlation between the results of quantitative detection between magnetic bead reagent and control reagent (r = 0.947, P ＜ 0.05). Conclusion The magnetic bead method is an ideal reagent for quantitative detection of hepatitis C virus nucleic acid (HCV-RNA) with higher sensitivity, and it is worthy of promotion and application in clinic.[Key words] Viral hepatitis C; Hepatitis C virus nucleic acid; Highly sensitive fluorescence quantification; Magnetic bead method丙型病毒性肝炎（hepatitis C virus，HCV 简称“丙肝”）是较常见的一种肝脏疾病传染性疾病，呈全球流行，不同性别、年龄、种族人群均对HCV 易感，HCV 的感染具有隐匿性，丙型肝炎病毒也是导致肝硬化和肝细胞癌的主要危险因素[1-2]。
丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒说明书
丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒（PCR-荧光法）说明书【产品名称】通用名：丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒（PCR-荧光法）英文名：PCR-Fluorescence Detection Kit for Hepatitis C Virus RNA汉语拼音：Bingxing Ganyan Bingdu Hesuan Dingliang Ceding Shijihe （PCR -Yingguang fa）【包装规格】 32人份/盒【预期用途】本试剂盒用于丙型肝炎的辅助诊断及疗程监控。
【原理和应用】本试剂盒利用一对丙型肝炎病毒（HCV）的特异性引物，一条特异性荧光探针，采用逆转录酶、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种单体核苷酸（dNTPs）等成分，并应用RT-PCR 技术实现对HCV RNA保守基因的扩增，同时通过外标的方法实现对血清或血浆中的丙型肝炎病毒进行定量检测。
本试剂盒可作为丙型肝炎的辅助诊断及疗程监控。
【试剂盒组成】*【储存条件及有效期】裂解液为黄色液体，保存于4℃；其他试剂目测为透明液体，保存于-20℃，不宜反复冻融，使用前应在室温下完全融化，并充分振荡混匀后稍事离心；所有试剂应避光保存；有效期十二个月。
【自备物品】1. 自备试剂（分析纯）氯仿、异丙醇（-20℃预冷）、75%乙醇（用不含Rnase和Dnase的水配制，-20℃预冷）2. 自备仪器高速台式冷冻离心机、移液枪、一次性耗材（无酶吸头、离心管、手套、帽子等）、专用工作服、工作鞋、办公用品等。
【适用仪器】PE-5700，PE-7000，PE-7300，PE-7700，Icycler定量荧光PCR仪【样本要求】1. 样本种类：血清或血浆血清以新鲜采集分离为好，采血6小时内必须分离、收集血清，并将血清转移至一次性使用无RNA酶的无菌微量离心管中。
血浆不能用肝素作抗凝剂。
2. 样本储存：待测样本在2-8℃保存不应超过24hr，-20℃保存不应超过三个月，-70℃以下可长期保存。
丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书
丙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书1.目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的丙型肝炎病毒核酸的定性检测，适用于丙型肝炎病毒感染的辅助诊断。
2.范围适用于丙型肝炎病毒核酸定量检测。
3. 职责3.1 操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。
3.2 专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。
3.3 实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。
4. 原理采用荧光PCR技术，以丙型肝炎病毒基因编码区的高度保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，进行一步法RT-PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT)实现对未知样本的检测。
另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。
5. 样本要求5.1 适用标本类型：血清5.2 标本采集用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2 ml，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min；吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。
5.3 标本保存和运送所采集的标本可立即用于测试或长期保存于-70℃，也可保存于-20℃待测，保存期为3个月，标本应避免反复冻融。
标本运送采用干冰（或者冰袋）保持低温，运输时间不应超过4天。
5.4 拒收标本：拒绝重度溶血样本、肝素抗凝的血浆。
6. 仪器和试剂6.1 设备AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。
6.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司产品标准批号：YZB/国7271-2013最低检出量：最低检出量为500 IU/ml试剂各组分见表1：表1 试剂盒组分表7. 操作步骤7.1试剂准备（试剂储存和准备区）7.1.1 进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面，并在检验流程记录表上做相应记录。
ELISA联合荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒的临床应用研究
ELISA联合荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒的临床应用研究发表时间：2011-06-23T10:53:21.613Z 来源：《中国健康月刊（学术版）》2011年第4期供稿作者：骆海涛毛齐学何宁刘大鹏房丹丹[导读] 探讨酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-PCR）、联合检测丙型肝炎病毒的临床意义。
骆海涛毛齐学何宁刘大鹏房丹丹【摘要】目的：探讨酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-PCR）、联合检测丙型肝炎病毒的临床意义。
方法：用ELISA方法联合FQ-PCR检测156例临床已确诊为丙型肝炎患者的血清，同时检测它们的丙氨酸氨基转移酶（AAT）。
结果：①抗-HCV阳性率随着HCV-RNA含量的升高而增高，其阳性率与HCV-RNA含量呈正相关。
②119例HCV-RNA阳性标本中，有78例ALT异常，其异常率随着HCV-RNA含量的升高而增高，ALT异常率与HCV-RNA含量呈正相关，ALT水平和HCV-RNA含量之间呈正相关。
③ELISA法检测敏感性为80.1%（125/156），漏检率为19.9%（31/156）。
FQ-PCR检测敏感性为76.3%(119/156)，漏检率为23.7%（37/156）。
两种方法联合检测敏感性为94.9%(148/156)，漏检率为5.1%（8/156）。
结论：两种方法联合检测，大大提高了丙型肝炎病毒的检出率，为临床早期，准确诊断丙型病毒肝炎、监测病情、观察疗效提供了有力的依据，为献血人员筛选和临床输血的血制品安全提供了有力保障。
【关键词】：酶联免疫吸附试验；丙型肝炎病毒抗体；荧光定量逆转录聚合酶链反应；丙型肝炎病毒核酸；丙氨酸氨基转移酶【中图分类号】R564【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)04-0047-01 我国一般人群抗-HCV阳性率为3.2％［1］，急性丙型肝炎绝大多数都将形成慢性丙型肝炎，是形成肝硬化和肝癌的重要原因。
2024丙型肝炎病毒感染的实验室检测方法及策略
2024丙型肝炎病毒感染的实验室检测方法及策略丙型肝炎病毒（HCV）是一种嗜肝性RNA病毒，可引起进行性肝损害，进而可能导致肝硬化和肝细胞癌。
据世界卫生组织（WHO）统计，截至2019年全球约有5 800万人患有慢性丙型肝炎，其中仅21%的慢性丙型肝炎患者得到诊断。
为消除作为公共卫生威胁的病毒性肝炎，我国在2021年发布了《消除丙型肝炎公共卫生危害行动工作方案（2021—2030年）》，要求加大丙型肝炎检测力度，提高检测发现率，实现HCV抗体阳性者核酸检测全覆盖。
WHO在2016年发布的《2016—2021年全球卫生部门病毒性肝炎战略》中提出“到2030年消除作为主要公共卫生危害的病毒性肝炎”的目标，旨在2030年90%以上的HCV感染者得到诊断。
为早日实现该目标，近年来HCV感染检测新技术和新策略不断出现并逐步推广应用。
此外，随着直接抗病毒药物（DAA）的不断发展，大部分丙型肝炎患者可以得到治愈，简化的HCV感染检测和诊断流程可以缩短从就诊至治疗的周转时间，使丙型肝炎患者尽快得到治疗。
本文参考了国内外HCV 感染检测的最新指导文件和研究进展，对HCV感染的实验室检测方法及策略进行综述。
1HCV感染的检测标志物HCV可引起急性和慢性感染。
急性HCV感染是指在接触和感染HCV后6个月内出现HCV感染的检测标志物，按照HCV感染的自然过程，暴露于HCV后1～2周可在外周血中检测到HCV RNA，随后依次出现HCV核心抗原（HCV cAg）p22和HCV抗体。
在未接受治疗的情况下，一部分HCV感染者在感染后6个月内可自发清除HCV感染，其他感染者则转为慢性HCV感染。
HCV感染检测标志物的动态变化如图1所示。
注：a，自限性HCV感染；b，慢性HCV感染。
图1 外周血中HCV感染检测标志物的动态变化2HCV感染的实验室检测方法依据《丙型肝炎诊断（WS213—2018）》，HCV感染的实验室诊断主要依赖HCV抗体和HCV RNA检测。
荧光定量PCR检测HCV RNA两种核酸提取法
荧光定量PCR检测HCV RNA两种核酸提取法叶明奇（厦门安普利生物工程有限公司，福建厦门 343，技术工程部）【摘要】目的探讨实时荧光PCR检测技术在丙型肝炎病原诊断中固相吸附法与磁珠分离技术法运用在临床中提取HCV RNA核酸的提取率与去干扰物效果的比对。
并通过对提取的RNA用于RT—PCR荧光定量检测，从灵敏度及抗干扰能力方面进行评价：去除标本中常含有蛋白和脂类等干扰核酸扩增的物质，特别是Rnast,因为RNase对 RNA 具有强烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温，不易失活。
因此在提取 RNA 时，如何避免 RNase 对标本的污染及防止RNase对提取的 RNA 的降解，所以对临床基因扩增检验中的标本进行核酸提取是核酸扩增前不可或缺的一个步骤。
采用简单而又高效的核酸提取方法对敏感的基因扩增检测技术的广泛应用有重要意义。
结果：固相吸附法和磁珠分离技术法检测的敏感度和特异度可达99% 。
结论:采用固相吸附法和磁珠分离技术法提取血清HCV RNA具有较高的敏感度，在操作运用上：固相吸附法更适用于标本量不多的手工核酸提取，磁珠分离技术法可运用于批量的标本自动对核酸的提取，该两种方法在实时荧光定量PCR法检测中具有重要的临床价值。
【关键词】实时荧光定量PCR；丙型肝炎；固相吸附法；磁珠分离技术；HCV RNA；Detection of HCV RNA by fluorescence quantitative PCR in two kinds of nucleic acid extraction methodYe Mingqi(Xiamen Amplly Biological Engineering Company Limited, Fujian Xiamen 343, the Engineering Department)[Abstract] technology of real-time fluorescence PCR detection of solid phase adsorption method and magnetic bead separation technique in the pathogenic diagnosis of hepatitis C in clinical use in extracting ratio on extraction rate of HCV RNA nucleic and to interference effect.And through the extraction of RNA for RT - PCR Fluorescence quantitative detection,evauation the sensitivity and the ability of anti-interference: the removal of samples of the contain protein and lipids interfering nucleic acid amplification substances, especially Rnast, because RNase has a strong role in the degradation of RNA RNase, while RNase is high temperature resistant, not easy to inactivation.Therefore in the extraction of RNA, how to avoid the pollution of specimen RNase and prevent the degradation of RNase on the extraction of RNA, so the nucleic acid extraction of clinical gene amplification test specimen is a nucleic acid amplification of an indispensable step.There is important significance in extensive application of sensitive PCR technique using nucleic acid extraction method is simple and efficient.Results: the solid phase adsorption and magnetic separation method of the sensitivity and the specificity can reach 99%.Conclusion: serum HCV RNA has a higher extraction using solid phase adsorption and magnetic separation method of sensitivity, In operation: more suitable for the specimen were not much manual extraction of nucleic acid solid phase adsorption method, magnetic bead separation method can be used in batch samples automatic extraction of nucleic acids .it has important clinical value in the real-time fluorescence quantitative PCR detection.[keyword]Real-time fluorescent quantitative PCR; hepatitis C; solid phase adsorption method; magnetic separation technology;HCV RNA丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）是呈球形，直径小于80nm (在肝细胞中为36—40nm，在血液中为36～62nm)，为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。
《乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(1+2型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)操作规程》
乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）操作规程1.目的规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。
2.原理2.1 汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。
2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。
试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。
标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。
加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。
洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。
纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。
2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。
在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。
通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。
选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。
在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。
UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。
2.4 质量控制原理为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。
2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。
实时荧光定量聚合酶链反应在丙型肝炎检测中的临床应用价值
实时荧光定量聚合酶链反应在丙型肝炎检测中的临床应用价值分析汪圣强1，穆会君2(1.无锡出入境检验检疫局，江苏 无锡 214101；2.无锡市人民医院，江苏 无锡 214023)摘要:目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)在检测丙型肝炎病毒(HCV)方面的差异。
方法 采用随机抽样分组方法，在2011年6月-2012年6月于我院就诊的HCV患者与同期在我局进行健康体检的正常人群中，各抽取90例，分为HCV组(A组)与正常对照组(B组)。
对每一组样本，分别采用FQ-PCR和ELISA法，进行HCV-RNA和抗-HCV检测。
结果 A组90例HC患者中，FQ-PCR和ELlSA分别检出阳性82例和73例，阳性率分别为91.1%和81.1%；B组90例健康对照组样本中，FQ-PCR和ELISA 分别检出阴性90例和87例，阴性率分别为100%和96.7%。
结论 在检测HCV 方面，FQ-PCR比ELISA 更具灵敏性和特异性，其临床应用价值更高，但ELISA也有操作简便，费用与耗时均较低的优点，在实际应用中可考虑两种方法联合检测，在提高了出入境人员和患者HCV的诊断准确率的同时，又可以减轻患者经济负担。
关键词:荧光定量聚合酶链反应；酶联免疫吸附试验；丙型肝炎病毒；联合检测中图分类号:R 512.6+3 文献标识码:B丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)在1989年被美国研究人员首次发现，于1991年被国际病毒命名委员会(ICTV)将其归为黄病毒科丙型肝炎病毒属。
HCV是单股正链RNA病毒，其基因组全长9419bp，主要经血源感染。
尽管丙型肝炎(HC)不如甲、乙型肝炎常常被人提及，但它却是引起慢性肝脏疾病的一个主要病因，其最大特征就是高度慢性化。
据统计，在全球受HCV感染的1.7亿人群中，约有20%会在10年内发展为肝硬化，而这些肝硬化患者，每年又有近3%进展为肝细胞癌，对患者的健康和生命造成严重危害[1]。
《乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(1+2型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法)操作规程》
乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）操作规程1.目的规范核酸检测试验操作，确保检测结果的准确性。
2.原理2.1 汇集：吸取8份（或以下）样品到指定的汇集管。
2.2提取：病毒核酸提取的方法为磁珠法。
试剂盒提供之内对照(IC)为不具感染性的假病毒，在进行样品核酸提取前加入样品中，监控提取、扩增和分析的全过程。
标本经裂解液处理后会将病毒外鞘膜破坏，蛋白质变形，使病毒裂解释放出病毒基因组核酸。
加入表面包被有二氧化硅的磁珠颗粒，在高盐环境下带负电荷的核酸吸附到带正电荷的的磁珠颗粒表面。
洗液可以洗去未结合的物质，如变性的蛋白、细胞碎片、PCR抑制物等并降低盐浓度。
纯化的病毒在特定的环境下从磁珠颗粒表面洗脱下来成为扩增的模板。
2.3扩增：采用PCR扩增TaqMan荧光探针标定技术同时对HBV（DNA）、HCV（RNA）、HIV（RNA）进行检测。
在反转录酶的作用下HCVRNA、HIVRNA反转录成cDNA，再与HBVDNA一同通过TaqDNA聚合酶的作用扩增病毒核酸的保守区域，TaqDNA聚合酶5`—3`外切酶活性切割反应系统中带荧光标记的TaqMan探针，随着PCR的进行，荧光信号不断积累。
通过PCR仪的检测血液标本达到和超过荧光阈值的信号给出样品的阴阳性结果。
选择性PCR扩增：采用UNG-dUTP抗污染系统。
在PCR扩增系统中采用UTP代替TTP，产生大量U-DNA片段。
UNG酶特异识别U-DNA片段中含UTP的位点并进行切割，U-DNA被降解后不能作为再次扩增的模板，系统选择性的扩增天然的核酸分子，从而防止了PCR扩增产物的污染。
2.4 质量控制原理为监控实验进行，保证实验结果的准确，在每次检测过程依靠阳性、阴性质控品以及内标进行监测。
2.4.1阴性质控品监控系统性假阳性，如果阴性质控品检测结果为阳性，说明实验存在假阳性的风险，因此实验中的阳性结果需复查。
免疫磁珠分离联合荧光定量聚合酶链式反应快速检测阪崎肠杆菌的试验研究
收稿日期：2018-05-27作者简介：姚骅珊（1983-），女，江苏徐州人，博士，苏州健雄职业技术学院医药科技学院教师，研究方向为诊断与检测试剂。
基金项目：太仓市应用基础研究计划（编号TC2013YY03）；江苏省自然科学基金（编号SBK201340091）。
江苏工程职业技术学院学报（综合版）Journal of Jiangsu College of Engineering and TechnologyVol.18，No.2Jun .2018第18卷第2期2018年6月DOI ：10.19315/j.issn.2096-0425.2018.02.001摘要：建立免疫磁珠分离（Immunomagnetic Separation ，简称“IMS ”）联合荧光定量聚合酶链式反应PCR （Polymerase Chain Reaction ，简称“PCR ”）快速检测阪崎肠杆菌的方法。
制备以生物素介导偶联的链霉亲和素免疫磁珠，优化偶联和捕获条件。
合成阪崎肠杆菌ITS （Internal Transcribed Spacer 简称“ITS ”）靶基因序列的引物和探针，同时构建内参质粒（Internal Amplification Control ，简称“IAC ”），建立能够实时监控反应过程的荧光定量PCR 反应体系。
在1mL 体系中添加粒径为80nm 的链霉亲和素免疫磁珠0.3mg ，孵育30min ，可获得80.5%以上的捕获效率。
建立的基于内参的荧光PCR 体系针对质粒检测时，Ct 值(Cycle threshold ，简称“Ct 值”)与模板拷贝数有着良好的线性关系（R 2=0.998），IMS-PCR 检测体系对阪崎肠杆菌菌液的检测灵敏度为33.3CFU/mL ，可在3h 内完成。
针对4株阪崎肠杆菌标准菌株和5株非阪崎肠杆菌菌株的检测也显示出较好的特异性和稳定性，人工模拟样品的检测结果与采用国标法检测的结果完全一致，可用于快速检测样品中的阪崎肠杆菌和疾病预防。
研究ELISA联合荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒的效果
DOI：10.19368/ki.2096-1782.2024.02.079研究ELISA联合荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒的效果刘波1，陈昌兰21.滕州市疾病预防控制中心卫生监督科，山东滕州277599；2.滕州市疾病预防控制中心检验科，山东滕州277599[摘要]目的评估丙型肝炎病毒检测应用酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）联合荧光定量聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）检测的应用价值。
方法选取2022年8月—2023年8月滕州市疾病预防控制中心接诊的90例疑似丙型肝炎病毒患者为研究对象，采用ELISA联合荧光定量PCR检测，以丙型肝炎病毒（Hepatitis Virus C, HCV）RNA检测结果作为“金标准”，分析检测方式的应用价值。
结果 HCV RNA检测结果显示，阳性率为47.78%，ELISA检测的阳性率40.00%，荧光定量PCR检测发现阳性量率42.22%，联合检测的阳性率46.67%。
ELISA检测与荧光定量PCR检测在灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值以及阴性预测值方面比较，差异无统计学意义（P均>0.05）。
联合检测的灵敏度为93.02%、准确度为94.44%、阳性预测值为95.24%以及阴性预测值为93.75%，显著高于ELISA检测的67.44%、76.67%、80.56%、74.07%，联合检测的灵敏度、准确度显著高于荧光定量PCR检测（76.74%、83.33%），差异有统计学意义（P均<0.05）。
结论丙型肝炎病毒检测应用ELISA联合荧光定量PCR检测检出率高。
[关键词]酶联免疫吸附试验；联合检测；荧光定量聚合酶链式反应；丙型肝炎病毒[中图分类号]R4 [文献标识码]A [文章编号]2096-1782（2024）01(b)-0079-04Study of ELISA Combined with Fluorescent Quantitative PCR for Detec⁃tion of Hepatitis C VirusLIU Bo1, CHEN Changlan21.Department of Health Supervision, Tengzhou Center for Disease Control and Prevention, Tengzhou, Shandong Prov‐ince 277599 China;2.Department of Laboratory, Tengzhou Center for Disease Control and Prevention, Tengzhou, Shan‐dong Province, 277599 China[Abstract] Objective To evaluate the application value of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) combined with fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) for hepatitis C virus detection. Methods 90 suspected hepatitis C virus patients treated by Tengzhou Center for Disease Control and Prevention from August 2022 to August 2023 were selected as the research objects. ELISA combined with fluorescence quantitative PCR test was used, and hepatitis virus C (HCV) RNA test results were taken as the "gold standard" to analyze the application value of the de‐tection method. Results The HCV RNA test results showed that the positive rate was 47.78%, the positive rate of the ELISA test was 40.00%, the Quantitative fluorescence PCR found a 42.22% positive rate, the positive rate of the com‐bined test was 46.67%. The differences between ELISA and quantitative PCR in sensitivity, specificity, accuracy, posi‐tive and negative predictive value were not statistically significant (all P>0.05). The sensitivity of the combined test was 93.02%, with an accuracy of 94.44%, a positive predictive value of 95.24% and a negative predictor of 93.75%, which were significantly higher than the 67.44%, 76.67%, 80.56%, 74.07% detected by ELISA; the sensitivity and ac‐[作者简介] 刘波（1973-），男，本科，副主任技师，研究方向为卫生检验。
丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR-荧光探针法）（北京纳捷诊断说明书2018年）
丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR-荧光探针法）（北京纳捷诊断说明书2018年）丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书【产品名称】通用名称：丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR–荧光探针法）【包装规格】 48人份/盒【预期用途】本试剂盒用于体外定量测定血清样本中的丙型肝炎病毒（HCV）核酸（RNA），适用于需要进行HCV感染检测的患者和接受抗病毒治疗的丙型肝炎患者。
本试剂盒可以检测HCV 1~6型临床常见型别，主要通过对丙型肝炎患者血液中HCV RNA含量及变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果。
该检测不得作为患者病情评价的唯一指标，必须结合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行综合评价。
本试剂盒不得用于HCV的血源筛查。
【检验原理】本试剂盒在PCR扩增管内用含磁珠的裂解液提取血清样本中HCV RNA，并在同一管中进行扩增，HCV RNA在逆转录酶作用下反转录成HCV cDNA，然后在DNA聚合酶的作用下，应用TaqMan探针技术扩增HCV cDNA并进行实时荧光定量检测。
本试剂盒校准品和质控品为含有丙型肝炎病毒的临床血清样本（已灭活）。
本试剂盒通过检测内标来监测样本中是否有PCR抑制物，避免假阴性。
【主要组成成分】丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR–荧光探针法）序号产品组成主要成分规格与装量RLB 核酸提取试剂HCV裂解液（含磁珠）氢氧化钠、氯化钾、Tris碱、构象磁珠7.5ml×1瓶RWB HCV漂洗液氯化钾、乙酸钠25.0ml×1瓶1 PCR扩增试剂HCV RT-PCR 反应液引物、探针、脱氧核糖核苷三磷酸、镁离子0.95ml×2管2 HCV酶混合液M-MLV逆转录酶、DNA聚合酶100μl×1管3校准品HCV校准品①（1.0～3.0）×106IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.35 ml×1管4 HCV校准品②（1.0～3.0）×105IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.35 ml×1管5 HCV校准品③（1.0～3.0）×104IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.35 ml×1管6 HCV校准品④（1.0～3.0）×103IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.35 ml×1管7质控品HCV强阳性质控品（0.5～5.0）×104IU/ml HCV阳性混合血清样本（已灭活）0.35 ml×1管8 HCV弱阳性质控品（100～700）IU/ml HCV阳性混合血清样本（已灭活）0.35 ml×1管9 HCV 阴性质控品HCV阴性混合血清样本（已灭活）0.35 ml×1管10 内标HCV内标内标核酸模板60μl×1管备注：a.校准品①～④的参数和强阳、弱阳性质控品的定值存在批间差异（均在以上范围内）。
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２ ０ １ ６ 年 第 ５期 Ｖ ｏ １ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ． ２ ６ Ｎ ｏ ． ５
检 验检 疫学 刊 Ｊ Ｏ Ｕ Ｒ Ｎ Ａ Ｌ ＯＦ Ｉ Ｎ Ｓ Ｐ Ｅ Ｃ Ｔ Ｉ Ｏ Ｎ Ａ Ｎ Ｄ Ｑ Ｕ Ａ Ｒ Ａ Ｎ Ｔ Ｉ Ｎ Ｅ
免疫磁珠 富集 与荧光定量 Ｐ Ｃ Ｒ技术 联合检测丙 型肝炎病毒
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曹姗姗 张 文玲 。 王 瑾 周 鲁林 １ 刘 留２ 吴 燕２ 肖利 力 １
（ １ ． 北 京 国际 旅 行 卫 生 保 健 中 心 北 京 １ ０ ０ ０ ８ ８ ； ２ ． 重庆 大 学 ）
摘要 建 立 一种 免疫磁 珠 与荧 光定 量 Ｐ Ｃ Ｒ技 术联 合检 测 丙型肝 炎病 毒 的方法 。 将 丙型肝 炎病 毒抗 体 与 羧基 修饰 磁珠 偶联 ， 制备 出特 异 性丙 型肝 炎病 毒 免疫磁 珠 ， 并检 测活 化磁珠 富集 病 毒 的效 率 。结果 表 明 １ ｍｇ 免疫 磁珠 与 ７ ５ Ｉ ｚ ｇ丙 型肝 炎病毒 单 克 隆抗 体偶 联 时 ， 具 有最 高抗 体偶 联 量 ， 该 偶 联 后 的磁 珠 富集丙 型肝 炎病 毒 的效 率是 ９ ４ ． ５ ０ ％； 同时检测 出丙型肝 炎病 毒 高拷 贝和 低拷 贝 样 品 的重复 性 良好 。本研 究探 索 的免疫磁 珠
ｉ ｍｍｕ ｎ ｏ ｍａ ｇ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｂ ｅ ａ ｄ ｓ ａ ｎ ｄ ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ｑ ｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｐ ＣＲ ｈ ａ ｓ ｈ ｉ ｇ ｈ ｓ ｅ ｎ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ， ｓ ｔ ｒ ｏ ｎ ｇ ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ｉ ｆ ｃ ｉ ｙ， ｔ ｓ ｉ ｍｐ ｌ ｅ ａ ｎ ｄ ｆ ａ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ｈ Ｊ ｉ ｇ ｈ ｒ ｅ ｌ ｉ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｙ ａ ｔ ｄ ｖ ａ ｎ ｔ ａ ｇ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ ｆ ａ ｖ ｏ ｒ ａ ｂ ｌ ｅ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ ｕ ｐ ｐ ｏ ｒ ｔ ｉ ｓ ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｄ ｅ ｄ ｆ ｏ ｒ ｔ ｈ ｅ ｔ ｅ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ
－
９荧 光定 量 Ｐ Ｃ Ｒ技 术 的结合 具 有灵敏 性 高 、 特 异 性强 、 简便 快捷 以及 可 信度 高 的优 点 ． 为丙 型肝 炎病 毒 检验 关键词 丙 型肝炎 病毒 ； 免 疫磁珠 ； 荧光定 量
中图分 类 号 Ｑ７ ８ ９
与评 价提 供 了有利 的技 术支 持 。
（ １ ． Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｉ ｎ ｔ ｅ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ Ｔ ｒ ａ ｖ ｅ ｌ Ｈ ｅ ａ ｌ ｔ ｈ ｃ ａ ｒ ｅ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ，Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ ，１ ０ ０ ０ ８ ８ ；２ ． Ｃ ｈ ｏ ｎ ｇ ｑ ｉ ｎ ｇ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ）