南农生物分离工程生物分离7亲和
南农细胞生物学7详解
南农细胞生物学7详解第九章核糖体第一节核糖体的类型与结构核糖体是合成蛋白质的细胞器，其唯一的功能是按照mRNA的指令由氨基酸高效且精确地合成多肽链。
1953年，Robinsin和Brown 用电镜观察植物细胞时发现了这种颗粒结构。
1955年Palade在动物细胞中也观察到类似的结构。
1958年Roberts建议把这种颗粒结构命名为核糖核蛋白体(ribosome)，简称核蛋白体或核糖体。
核糖体几乎存在于一切细胞内，不论是原核细胞还是真核细胞，均含有大量的核糖体。
即使最小最简单的细胞支原体，也至少含有数以百计的核糖体。
线粒体和叶绿体中也含有核糖体。
目前，仅发现在哺乳动物成熟的红细胞等极个别高度分化的细胞内没有核糖体。
因此可以说核糖体是细胞最基本的不可缺少的结构。
核糖体是一种颗粒状的结构，没有被膜包裹，其直径为25 nm，主要成分是蛋白质与RNA。
核糖体RNA称为rRNA，蛋白质称r蛋白，蛋白质含量约占 40％，RNA约占60％。
r蛋白分子主要分布在核糖体的表面，而rRNA则位于内部，二者靠非共价键结合在一起。
在真核细胞中很多核糖体附着在内质网的膜表面，称为附着核糖体，它与内质网形成复合细胞器，即糙面内质网。
在原核细胞的质膜内侧也常有附着核糖体。
还有一些核糖体不附着在膜上，而呈游离状态，分布在细胞质基质内，称游离核糖体。
附着核糖体与游离核糖体所合成的蛋白质种类不同，但核糖体的结构与化学组成是完全相同的。
核糖体常常分布在细胞内蛋白质合成旺盛的区域，其数量与蛋白质合成程度有关。
处在指数生长期的细菌中，每个细胞内大约有数以万计的核糖体，其含量可达细胞干重的40％。
而在培养的饥饿状态的细胞内，仅有几百个核糖体。
在体外培养的HeLa细胞中，核糖体的数目约为5X106～1X107个。
从核糖体发现至今近50年的时间，对核糖体的结构、成分与功能的研究，积累了丰富的材料，特别是近几年对rRNA的研究取得了重要的进展。
精细的生物化学分析，分子生物学、免疫学及其与电子显微镜技术的配合是取得这些成果的重要实验基础。
最新南农生物分离工程生物分离1
预处理→细胞分离→细胞破壁→碎片分离→提取→ 精制 → 成品制作
加热 过滤
匀浆法 离心 沉淀 (重)结晶 浓缩
调 pH 离心
研磨法 双水相 吸附 离子交换 干燥
絮凝 膜分离 酶解法 膜分离 萃取 色谱分离 无菌过滤
超滤
图1-1 生化分离工程一般工艺过程
A. 不溶物的去除
• *filtration（过滤） • *centrifugation（离心） • *cell disruption （细胞破碎）
1.3 生物技术下游加工过程的特点
• 生物技术产品以粗料发酵为主，粗原料
增加了下游操作成本，包括发酵废液的 处理成本，其中清液（精料）发酵将是 一个方向。
• 目前发酵或培养大多是分批操作，各批
发酵液产物浓度和其他物性会出现差异， 实际生产中也会出现染菌的发酵液，因 而需要技术的适应面宽，操作弹性大。
1.1 生化分离工程的研究对象
定义
• 对于由生物界自然产生的或由微生物菌
体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶 反应等各种生物工业生产过程获得的生 物原料，经提取分离、加工并精制目的 成分，最终使其成为产品的技术。
1.2 生化分离工程的重要性
• 生物技术产品一般存在于一个复杂的多
相体系中。唯有经过分离和纯化等下游 加工过程，才能制得符合使用要求的产 品。因此产品的分离纯化是生物技术工 业化的必需手段。
products Antibiotics Amino acids
Ethanol Organic acids
Enzymes r-DNA protein
in
Concentration g/l 25 100 100 100 20 10
生物工程的主要特点是生物制品多种多样， 产品的多样性导致分离方法的多样性
生物分离工程
生物分离工程名词解释1、错流过流：料液流动方向与过滤介质平行的过滤属于错流过滤。
其常用的过滤介质为微孔滤膜或超滤膜。
2生物分离工程：指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液中分离、纯化生物产品的过程。
3. 盐析：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象4、沉淀：是指在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体从溶液中析出的过程。
5、等电点沉淀：指利用蛋白质在PH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分离的方法。
6、萃取：萃取是利用溶质在互不相溶的溶剂里的溶解度不同，用一种溶剂把溶质从它与另一种溶剂所组成的溶液（原料）中提取出来的方法。
7、带溶剂：是指易溶于溶剂中并能够和溶质形成复合物且此复合物在一定条件下又容易分解的物质，也称为化学萃取剂。
8、细胞破碎：是指利用各种方法去破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物有效的释放出来。
9、包含体：包含体是聚集蛋白形成的浓密颗粒，呈无定形或类晶体。
10、乳化现象：是一种液体分散在另一种不相混合的液体中的现象。
11、超临界流体：是温度和压力同时高于临界值的流体，亦即压缩到具有接近液体密度的气体。
12、超临界流体萃取：是指利用超临界流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性成分，以达到分离和纯化的目的。
13、蒸发浓缩：是利用加热的方法使溶液中的一部分溶剂（通常为水）汽化后除去，得到含较高浓度溶质的一种操作过程。
14、结晶：是溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体的过程。
15、双水相萃取：利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。
16、分离：是利用混合物中各组分在物理性质或化学性质上的差异，通过适当的装置和方法，使各组分分配至不同的空间区域或者在不同的时间依次分配至同一区域的过程。
17、亲和沉淀：亲和沉淀是利用蛋白质与特定分子（配基、基质、辅酶）之间高度专一作用而设计的一种特殊选择性的分离技术。
18、重结晶：第一章1、生物分离工程主要目标产品类型：直接产物，即由发酵直接生产，分离过程从发酵罐流出物开始间接产物：即由发酵过程得到细胞或酶，再经转化和修饰得到产品。
生物分离工程题库
《生物分离工程》题库一、填充题1. 生物产品的分离包括R ，I ，P 和P ；2. 发酵液常用的固液分离方法有和等；3. 离心设备从形式上可分为，，等型式；4. 膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为，，和；5. 多糖基离子交换剂包括和两大类；6. 工业上常用的超滤装置有，，和；7. 影响吸附的主要因素有，，，，和；8. 离子交换树脂由，和组成。
9. 电泳用凝胶制备时，过硫酸铵的作用是；甲叉双丙烯酰胺的作用是；TEMED的作用是；10 影响盐析的因素有，，和；11.在结晶操作中，工业上常用的起晶方法有，和；12.简单地说，离子交换过程实际上只有，和三步；13.在生物制品进行吸附或离子交换分离时，通常遵循Langmuir吸附方程，其形式为；14.反相高效液相色谱的固定相是的，而流动相是的；常用的固定相有和；常用的流动相有和；15.超临界流体的特点是与气体有相似的，与液体有相似的；16.离子交换树脂的合成方法有和两大类；17.常用的化学细胞破碎方法有，，，，和；18.等电聚焦电泳法分离不同蛋白质的原理是依据其的不同；19.离子交换分离操作中，常用的洗脱方法有和；20.晶体质量主要指，和三个方面；21.亲和吸附原理包括，和三步；22.根据分离机理的不同，色谱法可分为，，和；23.盐析实验中用于关联溶质溶解度与盐浓度的Cohn方程为；当称为Ks盐析法；当称为β盐析法；24.蛋白质分离常用的色谱法有，，和；25.S DS PAGE电泳制胶时，加入十二烷基磺酸钠（SDS）的目的是消除各种待分离蛋白的和差异，而将作为分离的依据；26.常用的蛋白质沉析方法有，和；27.常用的工业絮凝剂有和两大类；28.典型的工业过滤设备有、和；29.常用离心设备可分为和两大类；30.根据物化理论，萃取达到平衡时，溶质在萃取相和萃余相中的相等；31.根据吸附剂与吸附质之间存在的吸附力性质的不同，可将吸附分为、、和吸附；32.影响亲和吸附的因素有、、、和；33.阳离子交换树脂按照活性基团分类，可分为、和；其典型的活性基团分别有、、；34.阴离子交换树脂按照活性基团分类，可分为、和；其典型的活性基团分别有、、；35.DEAE Sepharose是离子交换树脂，其活性基团是；36.CM Sepharose是离子交换树脂，其活性基团是；37.影响离子交换选择性的因素有、、、、、和；38.离子交换操作一般分为和两种；39.蛋白质等生物大分子，在溶液中呈稳定的分散状态，其原因是由于和；40.盐析用盐的选择需考虑、、、等几个方面的因素；41.影响有机溶剂沉淀的因素有、、、和；42.常用的超滤装置有、、和；43.依据电泳原理，现有电泳分离系统可分为、和；44.依据建立pH梯度的原理不同，等电聚焦（IEF）可分为和；45.双相电泳中，第一相是；第二相是；46.结晶包括三个过程、和；47.过饱和溶液的形成方法有、、、和；48.晶核自动形成时，体系总的吉布斯自由能的改变ΔG由和组成；49.物料中所含水分可分为、和三种；50.根据干燥曲线，物料干燥可分为和两个阶段；51.工业生产中常用的助滤剂有和；52.液－液萃取从机理上分析可分为和两类；53.基本的离子交换过程由、、和组成；54.吸附包括，，和四个过程组成；55.大孔网状吸附剂有，和三种主要类型；56.亲和吸附剂表面连接的“手臂链”的作用是；57.根据修饰基团的不同，离子交换树脂可分为，，和等四大类；58.根据聚合方法，离子交换树脂的合成方法可分为和两类；59.根据聚合单体，离子交换树脂的合成方法可分为和两类；60.影响离子交换速度的因素有、、、、、和；61.分配色谱的基本构成要素有、和；62.反相色谱常用的流动相有和等；63.反相色谱常用的固定相有和等；64.Sepharose系列的离子交换树脂的载体是；65.分子筛色谱（凝胶色谱）的主要应用是、；66.影响有机溶剂沉析的主要因素有、、、、和；67.根据膜材料的不同，常用的膜可分为和两类；68.根据膜结构的不同，常用的膜可分为、和三类；69.强制膜分离过程是指和过程；70.电泳系统的基本组成有、、、、、、和；71.电泳后，样品的主要染色方法有和；72.SDS－PAGE电泳中，SDS的加入是为了消除不同样品分子间和的差异；加入二硫叔糖醇的目的是；73.电泳过程中，加入溴酚兰的目的是；74.固体可分为和两种状态；75.结晶过程包括、和三个过程；76.结晶的前提是；结晶的推动力是；77.根据晶体生长扩散学说，晶体的生长包括、和三个过程；78.影响晶体生长的主要因素有、和；二. 讨论题1.请结合图示简述凝胶排阻色谱（分子筛）的分离原理；2.绘制结晶过程中饱和曲线和过饱和曲线图，并简述其意义；3.何谓亲和吸附，有何特点？4.简述结晶过程中晶体形成的条件；5.试比较常规聚丙稀酰胺凝胶电泳与SDS PAGE的分离原理；6.简述生物分离过程的特点；7.试比较凝聚和絮凝两过程的异同；8.简述超临界流体萃取的原理及其特点；9.何谓反微团，反微团萃取？其特点有哪些？10.何谓色谱的理论塔板数，如何计算？11.简述疏水层析的原理，并说明基本操作步骤；12.简述等电点层析的基本原理；13.简述有机溶剂沉析的原理；14.简述盐析原理；15.结合SDS PAGE电泳的分离原理说明未知蛋白质分子量的测定方法；16.请说明在进行SDS PAGE电泳之前，样品的处理方法，并解释其原因；17.简述载体两性电介质梯度等电聚焦（IEF）的分离原理；18.何谓反渗透膜分离，其特点是什么？19.结晶的必备条件是什么？20.请绘制典型的物料干燥速率曲线简图，并说明恒速干燥阶段及降速干燥阶段的特点；三.计算题1、用醋酸戊酯从发酵液中萃取青霉素，已知发酵液中青霉素浓度为0.2Kg/m3，萃取平衡常数为K=40，处理能力为H=0.5m3/h，萃取溶剂流量为L=0.03m3/h，若要产品收率达96%，试计算理论上所需萃取级数。
生物分离工程总结课后思考题
⽣物分离⼯程总结课后思考题⽣物分离⼯程思考题第⼀章⼀、凝聚、絮凝的概念凝聚作⽤：向胶体悬浮液中加某种电解质，使胶粒双电层电位降低，排斥作⽤降低，使胶体体系不稳定，胶体间相互碰撞产⽣凝聚的现象。
特点是凝聚体的颗粒⽐较⼩絮凝作⽤：当⼀个⾼分⼦聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶体表⾯上，产⽣架桥联接，形成较⼤絮凝团的过程，特点是可形成粗⼤的絮凝体⼆、影响过滤速度的因素有哪些？如何提⾼过滤速度？过滤操作⼀般以压⼒差为透过推动⼒，只靠重⼒很难达到⾜够⼤的透过速度透过速度:()L m c dV A Pdt R Rµ=+过滤速度与过滤⾯积，介质两侧压⼒差，滤液粘度，介质和滤饼阻⼒有关，适当增加过滤⾯积，提⾼介质两侧压⼒差，加⼊助滤剂均可提⾼过滤速度三、什么是分离因素？据此离⼼机可以分为哪⼏类？影响分离速度的因素还有哪些？离⼼设备所能达到的离⼼⼒与重⼒的⽐值称为分离因素分离因素：224N r Zgπ=根据分离因素可将离⼼机分为低速离⼼机，⾼速离⼼机和超⾼速离⼼机三类分离速度:()2218P S LsLd rVρρωµ-=与颗粒直径、颗粒密度、液体密度和液体粘度有关密度差越⼤，分离速度越⼤；密度差存在时，固体颗粒尺⼨越⼤，越容易离⼼；粘度增⼤时，不容易离⼼；颗粒密度与液体密度差异⼩，固体颗粒不⼤，粘度很⼤时，增加离⼼⼒能提⾼离⼼速率细胞破碎思考题⼀、试述微⽣物细胞壁的组成和结构特点？⾰兰⽒阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层组成，细胞壁较厚，约15-50nm，肽聚糖含量占40%-90%⾰兰⽒阴性菌的细胞壁在肽聚糖层的外侧还有分别有脂蛋⽩和脂多糖及磷脂构成的两层外壁层，肽聚糖层约1.5-2.0nm，外壁层约8-10nm，肽聚糖含量占5%-10%酵母的细胞壁由葡聚糖（30%-40%），⽢露聚糖（30%）和蛋⽩质组成，⽐⾰兰⽒阳性菌的细胞壁厚霉菌由多聚糖（⼏丁质+葡聚糖）（80%-90%）构成破碎难度霉菌＞酵母＞⾰兰⽒阳性菌＞⾰兰⽒阴性菌⼆、常⽤微⽣物细胞破碎的⽅法有哪些？机械法：珠磨法、X-Press法、超声破碎法和⾼压匀浆法⾮机械法：溶酶法、化学法、渗透压法和冻结融化法三、选择细胞破碎法的原则⼀般原则（1）、仅破坏或破碎⽬标产物的位置周围，当⽬标产物存在于细胞膜附近时，可采⽤较温和的⽅法，如酶溶法（包括⾃溶法），渗透压冲击法和冻结融化发等，当⽬标产物存在于细胞质内时，则需采⽤强烈的机械破碎法（2）、选择性溶解⽬标产物，当⽬标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液pH值，离⼦强度或添加与⽬标产物具有亲和性的试剂如螯合剂，表⾯活性剂等，使⽬标产物容易溶解释放，同时，溶液性质应使其他杂质不易溶出，另外，机械法和化学法并⽤可使操作条件更温和，在相同的⽬标产物释放率的情况下，降低细胞的破碎程度。
生物分离工程名词解释
膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。
或者：利用具有一定选择性透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化。
离子交换: 在吸附剂与溶液间发生离子交换，即吸附剂吸附离子后，它同时要放出等当量的离子于溶液中。
亲和层析：是利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。
过滤：是在外力作用下，利用过滤介质使悬浮液中的液体通过，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的一种单元操作。
或者：利用薄片形多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。
重结晶：是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。
分辨率：也称分离度。
它是指相邻两色谱保留值之差与两峰底宽平均值之比。
晶体：形成新相（固体）需要一定的表面自由能。
因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。
溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。
初级分离：指从菌体发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。
截留率：表示膜对溶质的截留能力，可用小数或百分数表示。
（真实截留率和表观截留率）自溶：通过调节温度、PH值或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶的方法，也是一种酶溶法。
：指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相保留体积VR体积。
：指色谱柱内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的死体积VM空间以及检测器的空间的总和，当后两项很小而可忽略不计时，V M可由t m与流动相体积流速F0(ml/min)的乘积计算。
理论塔板高度：单位理论塔板的长度称为理论塔板高度。
它等于色谱柱长度除以理论塔板数。
用理论塔板数与板高表示柱效率时是等价的。
生物分离工程题库
《生物分离工程》题库一、名词解释凝聚：在中性盐的作用下，由于胶体离子之间双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。
过滤：利用多孔性介质截流悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的过程。
离心：在离心作用下，利用固液和液体之间密度差达到沉降分离目的。
中性盐的饱和度：在一定的温度、一定的质量的水里所溶解盐的最大质量。
萃取：萃取是利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化方法。
乳化：水或有机溶剂以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象。
胶束：将表面活性剂融入水中，当表面活性剂的浓度超过一定的数值时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起形成聚集体，成为胶束。
膜分离：用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离、分级、提纯和浓缩的方法，统称为膜分离。
截留率：指混合物中被膜截留的某物质占原料中该物质总量的比率。
反渗透：是利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂(通常是水)的性质，对溶液施加压力，克服溶剂的渗透压，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。
吸附剂：吸附操作所使用的固体材料一般为多孔微粒或多孔膜，具有很大的比表面积，称为吸附剂或吸附介质。
表面添加剂：指那些具有很强的表面活性，能使液体的表面张力显著下降的物质。
离子交换：通常将基于离子交换原理的吸附操作称为离子交换或离子交换吸附。
吸附作用力为静电引力，所用吸附剂为离子交换剂，通过静电引力吸附带有相反电荷的离子，吸附过程发生电荷转移。
凝胶色谱：以凝胶为固定相，根据各物质分子大小不同而进行分离的层析技术，所以又叫分子筛层析，空间排阻层析或尺寸排阻层析。
（PPT和课本192页）等电聚焦电泳：当将pH调到等电点的大小，则大部分的蛋白质将会沉淀，这种达到分离蛋白质混合物的目的的方法称为等电聚焦电泳。
亲和分离技术：利用生物分子之间的专一识别性或特定的相互作用进行分离的技术，称为亲和分离技术。
亲和沉淀：是将生物专一性识别与沉淀分离相结合的分离纯化技术。
生物分离工程期末复习题
填空题1.为了提高最终产品的回收率一是（提高每步分离效率），二是（减少分离步骤）。
2.评价一个分离过程效率的三个主要标准是：（浓缩率），（分离系数）和（产品回收程度）3.生物产品的分离过程包括发酵液的预处理和（液固分离）,（产品的提取），（产品的精制）和（产品的加工处理）。
4.生化反应所起的作用是产生目的产物，指标是（产率）和（转化率），而生物分离解决的是如何从反应液中获取这些物质，涉及的是（收率）和（纯度）。
5.生物分离的主要任务：从发酵液和细胞培养液中以（最高的效率），（理想的纯度）和（最小的能耗）把目的产物分离出来。
6.生物分离过程的特点包括：（生物分离过程的体系特殊），（生物分离过程的工艺流程特殊），（生物分离过程的成本特殊）。
7.物质分离的本质是识别混合物中不同溶质间（物理），（化学）和（生物）性质的差别利用能识别这些差别的（分离介质）和扩大这些差别的（分离设备）8.性质不同的溶质在分离操作中具有不同的（传质速率）和或（平衡状态）9.平衡分离是根据溶质在两相间（分配平衡）的差异实现分离；溶质达到分配。
平衡为扩散传质过程，推动力仅取决于系统的（热力学性质）。
10.差速分离是利用外力驱动溶质迁移产生的（速度差）进行分离的方法。
1.在细胞分离中，细胞的密度越（大），细胞培养液的密度越（小），则细胞沉降2.区带离心包括（差速）区带离心和（等密度）区带离心。
3.为使过滤进行的顺利通常要加入（惰性助滤剂）。
4.发酵液常用的固液分离方法有（离心）和（过滤）等。
5.常用离心设备可分为（离心沉降）和（离心过滤）两大类；6.常用的工业絮凝剂有（无机絮凝剂）和（有机絮凝剂）两大类。
7.工业生产中常用的助滤剂有（硅藻土）和（珍珠岩粉）。
8.重力沉降过程中，固体颗粒受到（重力），（浮力），（摩擦阻力）的作用，固体匀速下降时，三个力的关系（重力=浮力+摩擦阻力）。
9.发酵液预处理的方法包括：（凝集），（絮凝），（加热法）；（调节pH法），（加水稀释法），加入（助滤剂）和（吸附剂）。
南农 生物分离工程 生物分离7 亲和
5. 辅酶和磷酸腺苷 脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。 辅 酶 主 要 有 NAD （ nicotinamide adenine dinucleotide）、 NADP（NAD phosphate） 和ATP（adenosine triphosphate）等。这些 辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。 AMP （ adenosine 5'-monophosphate ） 、 ADP（adenosine 2'，5'-diphosphate）的腺苷 部分与上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的 亲和配基。
亲和层析
生物亲和作用
生物亲和作用的本质 影响亲和作用的因素 亲和作用体系
生物亲和作用的本质
生物分子间的特异性相互作用称为生物亲和作 用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理 进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化 （affinity purification）。 亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞细胞。
亲和作用体系
将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联， 可特异性结合另一种分子（目标产物） ，使其 从混合物中高选择性地分离纯化。 一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配 基（ligand），用L表示。
Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～ 108 L/mol，最高可达到1015 L/mol 。
常用载体
1. 纤维素 活化后带电荷，非特异性吸附强，结构紧密， 小分子配基亲和位阻大, 分离与核酸有关的物质（oligo)dT- mRNA 2. 琼脂糖凝胶 Sepharose 4B最佳，活性基团多，孔径大， 几乎无带电基团，交联后稳定性↑
《生物分离工程》题库2
《生物分离工程》题库一、填充题1. 生物产品的分离包括R ，I ，P 和P ；2. 发酵液常用的固液分离方法有和等；3. 过滤前物料的预处理的方式有、和等；4. 影响絮凝效果的因素有、、、和。
5. 过滤设备按推动力的不同可分为、、和。
6. 离心设备从形式上可分为，，等型式；7. 常用的过滤介质有、和等；8. 常用的工业絮凝剂有和两大类；9. 典型的工业过滤设备有、和；10.常用离心设备可分为和两大类；11.离心沉降设备从型式上可分为、、等型式；13.膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为，，和；14.多糖基离子交换剂包括和两大类；15.工业上常用的超滤装置有，，和；16.影响吸附的主要因素有，，，，和；17.离子交换树脂由，和组成。
18.电泳用凝胶制备时，过硫酸铵的作用是；甲叉双丙烯酰胺的作用是；TEMED的作用是；19.影响盐析的因素有，，和；20.在结晶操作中，工业上常用的起晶方法有，和；21.简单地说，离子交换过程实际上只有，和三步；22.在生物制品进行吸附或离子交换分离时，通常遵循Langmuir吸附方程，其形式为；23.反相高效液相色谱的固定相是的，而流动相是的；常用的固定相有和；常用的流动相有和；24.超临界流体的特点是与气体有相似的，与液体有相似的；25.离子交换树脂的合成方法有和两大类；26.常用的化学细胞破碎方法有，，，，和；27.等电聚焦电泳法分离不同蛋白质的原理是依据其的不同；28.离子交换分离操作中，常用的洗脱方法有和；29.晶体质量主要指，和三个方面；30.亲和吸附原理包括，和三步；31.根据分离机理的不同，色谱法可分为，，和；32.盐析实验中用于关联溶质溶解度与盐浓度的Cohn方程为；当称为Ks盐析法；当称为β盐析法；33.蛋白质分离常用的色谱法有，，和；34.S DS PAGE电泳制胶时，加入十二烷基磺酸钠（SDS）的目的是消除各种待分离蛋白的和差异，而将作为分离的依据；35.常用的蛋白质沉析方法有，和；36.根据物化理论，萃取达到平衡时，溶质在萃取相和萃余相中的相等；37.根据吸附剂与吸附质之间存在的吸附力性质的不同，可将吸附分为、、和吸附；38.影响亲和吸附力的因素有、、、和；39.阳离子交换树脂按照活性基团分类，可分为、和；其典型的活性基团分别有、、；40.阴离子交换树脂按照活性基团分类，可分为、和；其典型的活性基团分别有、、；41.DEAE Sepharose是离子交换树脂，其活性基团是；42.CM Sepharose是离子交换树脂，其活性基团是；43.影响离子交换选择性的因素有、、、、、和；44.离子交换操作一般分为和两种；45.蛋白质等生物大分子，在溶液中呈稳定的分散状态，其原因是由于和；46.盐析用盐的选择需考虑、、、等几个方面的因素；47.影响有机溶剂沉淀的因素有、、、和；48.常用的超滤装置有、、和；49.依据电泳原理，现有电泳分离系统可分为、和；50.依据建立pH梯度的原理不同，等电聚焦（IEF）可分为和；51.双相电泳中，第一相是；第二相是；52.结晶包括三个过程、和；53.过饱和溶液的形成方法有、、、和；54.晶核自动形成时，体系总的吉布斯自由能的改变ΔG由和组成；55.物料中所含水分可分为、和三种；56.根据干燥曲线，物料干燥可分为和两个阶段；57.描述溶解度与温度、分散度之间定量关系的凯尔文公式的形式为。
生物分离工程思考题
《分离》PPT思考题及部分答案分离概述1 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？生物下游加工过程特点：<1>：发酵液组成复杂，固液分离困难——这是生物分离过程中的薄弱环节<2>：原料中目标产物含量低，有时甚至是极微量——从酒精的1/10到抗菌素1/100，酶1/100万左右，成本高。
<3>：原料液中常伴有降解目标产物的杂质——各种蛋白酶降解基因工程蛋白产物，应快速分离。
<4>：原料液中常伴有与目标产物性质非常相近的杂质——高效纯化技术进行分离。
<5>：生物产品稳定性差——严格限制操作条件，保证产物活性。
<6>：分离过程常需要多步骤操作，收率低，分离成本高——提高每一步的产物收得率，尽可能减少操作步骤。
<7>：各批次反应液性质有所差异——分离技术具有一定的弹性。
2 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？(1)产品的性质（2）成本（3）工艺步骤（4）操作程序（5）生产方式（6）生产规模（7）产品稳定性（8）环保和安全3 初步纯化与高度纯化分离效果有何不同？（1）初步纯化是将目标物和与其性质有较大差异的杂质分开，使产物的浓度有较大幅度的提高，可采用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作.（2）高度纯化主要是除去与目标物性质相近的杂质，是产品的精制过程，可采用层析（柱层析和薄层层析）、离子交换、亲和色谱、吸附色谱、电色谱.4 如何除去蛋白质溶液中的热原质？（1）生产过程无菌（2）所有层析介质无菌（3）所用溶液无菌（4）亲和层析（多粘菌素）5 生物分离为何主张采用集成化技术？6 纯化生物产品的得率是如何计算的？若每一步纯化产物得率为90%，共6步纯化得到符合要求产品，其总收率是多少？得率=产品中目标产物总量/原料中目标产物总量总收率=（90%）6 =53.1441%发酵液预处理1 发酵液为何需要预处理？处理方法有哪些？1、发酵产物浓度较低，大多为1%—10%，悬浮液中大部分是水；2、悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；3、固体粒子可压缩性大（细胞在很大程度上属于可压缩的粘稠物料）；4、液相粘度大，大多为非牛顿型流体；5、性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白质酶水解等作用的影响。
生物分离考研课件第8章 亲和分离
2. 亲和层析的洗脱方式
• 特异性洗脱 采用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用 的小分子化合物的溶液为洗脱剂 通过与亲和配基或目标产物竞争性结合洗脱目标产 物。 特异性洗脱条件一般比较温和，有利于保护目标 产物的生物活性
•
非特异性洗脱 通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温 度等理化性质降低目标产物吸附作用的洗脱方法。
IMAC的吸附条件: 在pH值为6.0-9.0吸附 IMAC的解吸附： ①将pH降低到3.0-4.0进行洗脱 ②竟争性洗脱，采用能与金属离子发生作用的物质如咪唑、 组氨酸等进行洗脱 解吸后需要对层析柱进行再生，再生一般采用EDTA。 EDTA不但可以解吸蛋白质，而且将所有结合在层析介质 上的金属离子也一起接洗脱下来。
3. 常用的亲和层析方式 • 核苷酸及辅酶亲和层析 以核苷酸（或辅酶）作为亲和配基，用于纯 化各种脱氢酶和激酶。
常用的辅酶：NAD、NADP、ATP AMP、ADP的腺苷部分与辅酶的结构类似， 同样可作为脱氢酶和激酶的亲和配基。
蛋白质的洗脱一般用辅酶或核苷酸进行洗 脱，如采用NADH梯度洗脱3-磷酸脱氢酶和乳 酸脱氢酶。
亲和作用分子对中被固定的分子称为配基(ligand) 结合常数越大，亲和作用越强
合适 104～108L/mol 生物素(biotin)－亲和素(avidin) 1015L/mol 不可逆
8.2 亲和色谱
利用偶联有亲和配基的层析介质为固定相，根 据生物分子之间的亲和作用进行物质分离的液相 色谱方法。
• 染料亲和层析
三嗪类色素是一类含有三嗪环的活性染料。 这类染料的结构和NAD的结构相似，能与以 NAD为辅酶的脱氢酶和激酶结合。 最常用的活性染料为 Cibacron Blue F 3GA。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 配基的浓度
亲和势较低（ KL ≥ 10-4mol/L），增加配基浓度或 增加柱长 大分子配基浓度过高，活性中心相互掩盖， 吸附强，非专一性吸附↑ 理想配基浓度1-10µmol/L，2 µmol/L凝胶
• 配基分子大小
首选大分子或插入“手臂”
• 偶联位置
e结合有效，偶联位置导致 亲和力差异，可吸附不同配体
亲和层析
生物亲和作用
• 生物亲和作用的本质 • 影响亲和作用的因素 • 亲和作用体系
生物亲和作用的本质
• 生物分子间的特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。 • 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化（a
• AMP（adenosine 5'-monophosphate）、 ADP（adenosine 2'，5'-diphosphate）的腺苷部分 与上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的亲和配基。
6. 三嗪类色素 • 利用色素为配基的亲和色谱法又称色素亲和色谱（Dye-ligand affinity chromatography）。 • Triazine dyes是一类分子内含有三嗪环的合成染料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模
ffinity purification）。 • 亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细
胞。
配基固定化、吸附样品、样品解吸 “亲和吸附剂”：载体与固定化配基的总称
• 具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔” 的空间结构关系。 • 亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合： • 静电作用 • 氢键 • 疏水相互作用 • 配位键 • 弱共价键
拟色素（biomimetic dye）。除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白蛋白、 干扰素、核酸酶和糖解酶 等具有很高的亲和力。 • Cibacron Blue F3GA ：
7. 过渡金属离子
• Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（TE D）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用做亲和吸附蛋白质的配基。
• 这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为金属螯合色谱（metal chelate chromatography ）或固定化金属离子亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）。
特异性 高特异性
群特异性
常用的亲和作用体系
亲和作用体系 抗原----单克隆抗体 荷尔蒙----受体蛋白 核酸----互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶----底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白----A蛋白、G蛋白 酶----辅酶 凝集素----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质----肝素 酶、蛋白质----活性色素（染料） 酶、蛋白质----过度金属离子 酶、蛋白质----氨基酸（组氨酸等）
• A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免 疫复合体。
4. 凝集素
• 凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称。
• 伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A。
• 利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。
3. A蛋白
• protein A为分子量约42 kD的蛋白质，与IgG具有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc 片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。
• 不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结 合常数有所不同。
图5-1 蛋白质的结合部位及各种结合作用
亲和作用体系
• 将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子（目标产物） ，使 其从混合物中高选择性地分离纯化。
• 一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基（ligand），用L表示。
• Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～108 L/mol，最高可达到1015 L/mol 。
• 亲和配基 1. 酶的抑制剂 • 小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸等。
底物，亲和力＜抑制剂，专一性较差， 转变为产物，用不适pH，缺少辅因子
辅酶：专一性不强
2. 抗体
• 利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱（immunoaffinity chromatography） 。抗体与抗原之间的Keq一般为107～1012 L/mol。
亲和色谱
• 亲和色谱的特点 选择性高、特异性极强,
以胰岛素提取胰岛素受体，一步纯化8000倍 分离精度高：可用于分离含量极低，结构相近的化合物 • 亲和色谱的局限性 ①通用性差，洗脱条件苛刻 ②费用高
亲和色谱填料
• 亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的，需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定 相粒子，制备所需的亲和吸附介质。
• 少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴刀豆球蛋白A（一种植物凝集素）。 • 在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的
需要，有必要自制亲和吸附介质。
亲和配基
• 配基的选择
足够大亲和力
结合专一 牛胰蛋白酶抑制剂: 除与牛胰蛋白酶, 还与胰凝乳 蛋白酶、激肽释放酶有亲和作用
• pH＜5.6时con A为二聚体，分子量为52 kD；pH＞5.6时为四聚体，分子量为102 kD，两个 亚基（subunit）之间通过二硫键结合。
• 在利用con A为配基的亲和色谱操作中，操作条件应当适宜。
5. 辅酶和磷酸腺苷
• 脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有NAD（nicotinamide adenine dinucle otide）、 NADP（NAD phosphate）和ATP（adenosine triphosphate）等。这些辅酶可用做 脱氢酶和激酶的亲和配基。