海洋生物技术 第二章 海洋动物细胞工程
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胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞 间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单 个细胞。
（三）核移植技术
动物核移植是将动物的一个细
胞的细胞核，移入一个已经去掉 细胞核的卵母细胞中。使其重组
并发育成一个新的胚胎，这个新
的胚胎最终发育为动物个体。
黑面绵羊去 核卵细胞
白面绵羊乳 腺细胞核
克 隆 羊 培 育 过 程
第一节 概
一、细胞工程的概念
述
应用细胞生物学、遗传学、发育生物学和分
子生物学的理论和方法，按照人们的设计和 需要，通过细胞融合、核质移植、染色体或 基因移植，以及组织、细胞培养等方法，在 细胞整体水平或细胞器水平改变细胞内的遗 传物质或获得细胞产品，甚至培养出新物种 的一门综合性生物工程技术科学。
动物组织细胞培养技术的建立
1907年，美国胚胎学家R. Harrison将蛙的胚神经 组织移植到蛙的淋巴液凝块中，首创体外组织培养 法。 1912年，Carrel发现了鸡胚浸出液对某些细胞的生 长具有很强的促进效应，并把无菌技术引入组织培 养技术中，在不含抗菌素的培养条件下使鸡胚心脏 细胞维持生存了34年，先后继代3400次，证明动物 细胞有可能在体外无限地生长。
优点:分泌胞外、纯化方便、翻译 后修饰糖基化，与天然产品一致。
第三节 生产用动物细胞系的 要求和获得
一、生产用动物细胞的要求:
原代细胞 二倍体细胞系 连续细胞系（转化细胞系） 重组细胞系
二、生产用动物细胞的获得
⒈原代细胞
是直接取自动物组织器官,经过粉碎消
化而获得的细胞悬液（109/g）。
需要大量动物，费钱费劳力。
二、细胞工程技术
细胞融合技术 细胞培养技术 细胞器移植技术
染色体工程
组织培养技术（干细胞工程）
（一）细胞融合技术
细胞融合，又称细胞杂交，是指两个或两个以上的 细胞融合成一个细胞的现象。 正常人体内也有细胞融合现象，如两性生殖细胞结 合而成受精卵，多个巨噬细胞融合成一个体积很大的 多核异物巨细胞。
有关概念:
原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为
原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内
的细胞称为原代细胞培养。
传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配
制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的
培养瓶中继续培养，称为传代培养。
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生
长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存
G1期：4～6h， 合成 DNA聚合酶，RNA 合成； S期：6～8h ，DNA 合成； G2期：2～5h DNA量 加倍,RNA合成； M期：分裂期，0.5～ 1h 染色体分裂
⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。
⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。
原代培养物经首次传代成功后即为细胞 系， 由原先存在于原代培养物中的细胞世系 所组成。如果不能继续传代，或传代次数有 限， 可称为有限细胞系， 如可以连续培养， 则称为连续细胞系(无限细胞系)， 培养50代 以上并无限培养下去。
第二章 海洋动物细胞工程
目 录
一 概 述 二 动物细胞的形态结构和生理特点
三 生产用动物细胞系的要求和获得
四 动物细胞的培养条件和培养基 五 动物细胞培养的基本方法 六 动物细胞培养方法和操作方式 七 动物细胞生物反应器
八 动物细胞产品的纯化方法和质量要求
九 动物细胞工程的实例 十 细胞工程在海洋动物中的应用
受精作用
两个细胞正在融合
细胞融合现象的发现
19世纪30年代，Muller, Schwann, Virchow 等相继在 肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核 细胞现象。 1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在。
1855年～1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织 及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。
素等。
原因？
⒌动物细胞对培养基要求高。 必需氨基酸、维生素、无机盐、
微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、
贴壁因子等。
⒍动物细胞蛋白质的合成途径和修 饰功能与细菌不同。
动物细胞蛋白质的合成部位为
游离核糖体和粗面内质网的核糖体，
有糖基化修饰，且多为分泌胞外蛋
白。
动物细胞培养：
缺点:培养条件高、成本贵、产量低。
[A]贴壁细胞：去除培养基---胰蛋白酶消化---加入 培养液，形成细胞悬液---稀释---培养 [B]悬浮细胞：收集细胞悬液---离心搜集细胞---用 培养液稀释---培养
⒉二倍体细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆， 从多种细胞成分的组织中，挑
选并纯化出具有一定特征的细胞 株。
二倍体细胞有正常细胞的特点：
细胞融合技术是细胞遗传学、细胞免疫 学、病毒学、肿瘤学等研究的一种重要手 段； 如将受抗原刺激后的小鼠脾淋巴细胞分 离出来，与已建成的小鼠骨髓瘤（浆细胞 瘤）细胞融合，筛选出的杂交瘤细胞可长 期存活和增殖，成为制备单克隆抗体的细 胞株。
（二）动物细胞培养技术 1.动物细胞培养的概念：
动物细胞培养 就是从动物有机体 中取出相关的组织, 将它分散成单个细 胞,然后,放在适宜 的培养基中,让这 些细胞生长和增殖.
1859年，A. Barli研究发现某些黏虫存在着由单个细 胞核融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为 多核细胞是由单个细胞融合而成。
细胞融合的过程：细胞在促融因子的作用下，出现 凝集现象，然后，细胞之间的质膜发生粘连，细胞 开始融合，然后在培养过程中，进而发生核融合， 形成杂种细胞。
体外用人工方法使两种细胞融合，制成一种新 品系的杂交细胞，筛选出的杂交细胞有很强的 生命力，增殖也很旺盛。常用的细胞融合诱导 物是仙台病毒和聚乙烯丙醇（PEG）。 细胞A
7 0年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的
安全性，WI-38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗
的二倍体细胞系。
二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明
显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，
一般可传代培养50代，且无致瘤性； 现在传代细胞系已被广泛用于人用治疗性药物的 生产，但仍不是理想的生产细胞系。
⒉悬浮细胞
生长不依赖支持物表面，在培养液 中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。 生长不严格依赖支持物。如中国地 鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。
⒊兼性贴壁细胞
二、动物细胞的生理特点
⒈ 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为12～48h， 细胞的分裂周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2）， 分裂期（M）
物理法 化学法
细胞B
仙台病毒
灭活的病毒
wk.baidu.com
疱疹病毒
新城鸡瘟病毒
杂种细胞
用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程
病毒颗粒 细胞核
细胞核
思考讨论： 为什么使用 的病毒需要 灭活？不灭 活行吗？
因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细 胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。
细胞工程的主要技术及其应用
细胞与组织培养技术
细 胞 工 程
作物改良、花卉林木繁殖、产前 诊断、遗传病防止 名贵药物、其他生物药品
细胞大批培养技术
细胞融合技术 染色体工程技术
细胞器移植技术 体外受精和胚胎移植 技术 DNA重组技术 外源基因导入技术 物理化学技术
创造新植物、生产单克隆抗体、 培育高产新菌种 创造作物新类型
活到40～50代，这种传代细胞为细胞株。
细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生
长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的
改变，使其在培养条件下可以无限制传代，
这种传代细胞为细胞系。
细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物
质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，
容易传代培养。
⒋动物细胞对周围环境十分敏感; 对理化因素敏感，如：渗透压、 pH、离子浓度、剪切力、微量元
①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制；
③可传代培养50代；
④无致瘤性。
二倍体细胞的培养意义
二倍体细胞保留着在位组织正常的细胞性状。
（1）可用于生产疫苗、尿激酶、干扰素等药 物的生产。 （2）也可用于细胞遗传学、细胞分化及衰老 的研究、以及药物的细胞毒性、环境污染的 细胞学检测。
二倍体细胞的来源
1940年，Earle建立了可无限传代的一个C3H小鼠的 结缔组织细胞系。1951年，开发了能促进动物细胞 体外培养的人工培养液。
2.动物细胞培养过程：
动物胚胎或幼龄动 胰蛋白酶 单个细胞 细胞 制成 悬浮 物的组织、器官 剪碎 液 细胞系 原 细 细胞株 代
部分细胞“癌 变”，无限传代 培 养
胞 贴 壁
加培养液
细胞 动物细胞培养不能 最终培养成动物体
50代细胞
剥离、分瓶 传代培养
10代 细胞
动物细胞的培养过程
幼龄动物 取动物器官 和组织 剪碎组织
胰蛋白酶处理 单个细胞 细胞培养
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
思考讨论：在动物细胞培养过程中，
为什么要用胰蛋白酶对取出的动物 组织进行处理？
②物理分散法：将组织小块通过加压过筛的方法进 行机械分散，形成单个细胞和细胞团块。 ③酶消化与物理分散结合法：动物组织先经过酶消 化，再用电磁搅拌进行物理分散。
（2）传代培养
定义：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培 养瓶消化、收集、稀释后转至新的培养瓶的过程。 注意：原代细胞类型不一，需要不同的消化时间和 消化液。 步骤：
⒊转化细胞系（无限细胞系） 通过某个转化过程形成的，常由于
染色体断裂变成异倍体，失去正常
细胞特点，而获得无限增殖能力。
转化过程可以是自发的或人工的，
从肿瘤组织中分离。
4.融合细胞系
仙台病毒融合法 聚乙二醇融合法 电融合法
5.基因工程细胞系 利用基因工程技术改造编码蛋白
质的基因并转化到新宿主细胞内进
生产用最多的鸡胚细胞、原代兔肾细胞、
鼠肾细胞、淋巴细胞。
（1）原代培养
定义：从新鲜供体取得组织 细胞后在体外进行首次培养， 一般持续1～4周。 步骤：取材---组织分离--培养 方法：组织块培养法、分离 细胞培养法
动物组织块培养法
将动物组织切成直径为1
～ 2mm的小块、并 且进行培养的方法称为动物组织块培养法。 有些动物组织如人的皮肤细胞，由于分散成 细胞十分困难，因此常常采用组织块培养法。
创造动植物新品种 动植物改良、人类优生 动植物改良、基因治疗
第二节 动物细胞的形态结构 和生理特点
一、动物细胞的形态与结构 适应功能,形态各异。
离体培养细胞分三类： 贴壁细胞；悬浮细胞；贴壁-悬浮
⒈贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面， 自身分泌 或培养基中提供的贴附因子才能在该表面 上生长。 两种形态： 成纤维细胞型（细长） 上皮细胞型（圆形、多角形或放射形）
细胞核移植
重组细胞 电脉冲刺激 早期胚胎 胚胎移植
另一头绵羊的子宫
妊娠、出生
克隆羊多利
1997年2月，英国科学家 Wilmut等在世界权威杂志 《Nature》上首例报道了世界 第一只克隆羊的诞生。它的贡 献在于：证明了哺乳动物高度 分化的细胞同样含有全套遗传 信息，亦能在一定条件下发育 成动物个体，进一步证明了动 物细胞的全能性。 1998年，Thomason 成功建立 人胚胎干细胞系。
行表达。这些利用基因工程技术构
建的细胞系成为基因工程细胞系。
三、常用生产用动物细胞 的特性(了解)
W1-38
MRC-5
CHO-K1 BHK-21 Vero Namalwa
四、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立 两个细胞库： ①原始细胞库 ②生产用细胞库
来源于3-4个月的胚胎肺组织。 目前已获得了多种人胚肺二倍体细胞，如：
W1-38 MRC-5 MRC-9
IMR-90
LS-7
2BS
KBM-13
二倍体细胞的培养特征
影响二倍体细胞培养的因素有：
①分种率。一般不超过1：8，细胞密度应大于 104个/平方厘米，否则死亡率大，细胞难以 成层。
②继代寿命。细胞培养中需及时进行继代培养， 否则细胞容易退化、衰老和死亡。 ③PH值。应大于7.2，最好通过CO2培养箱和有 机缓冲液如HEPES来稳定培养液的PH值。
动物组织块固着之后，加培养液，于37℃、
CO2培养箱中、通入含5%CO2的空气进行培养， 即可在组织块周围长出新的细胞单层。动物 组织培养过程中，进行旋转或者振荡，培养 效果更好。
组织块分散成单细胞
消化分散组织块的方法分为三种：
①酶消化法：将组织块切成1～2mm的立方小块，置 蛋白酶溶液中进行消化分散，离心收集细胞，经 过平衡盐溶液洗涤，加培养基后于4℃条件下贮存 备用。
（三）核移植技术
动物核移植是将动物的一个细
胞的细胞核，移入一个已经去掉 细胞核的卵母细胞中。使其重组
并发育成一个新的胚胎，这个新
的胚胎最终发育为动物个体。
黑面绵羊去 核卵细胞
白面绵羊乳 腺细胞核
克 隆 羊 培 育 过 程
第一节 概
一、细胞工程的概念
述
应用细胞生物学、遗传学、发育生物学和分
子生物学的理论和方法，按照人们的设计和 需要，通过细胞融合、核质移植、染色体或 基因移植，以及组织、细胞培养等方法，在 细胞整体水平或细胞器水平改变细胞内的遗 传物质或获得细胞产品，甚至培养出新物种 的一门综合性生物工程技术科学。
动物组织细胞培养技术的建立
1907年，美国胚胎学家R. Harrison将蛙的胚神经 组织移植到蛙的淋巴液凝块中，首创体外组织培养 法。 1912年，Carrel发现了鸡胚浸出液对某些细胞的生 长具有很强的促进效应，并把无菌技术引入组织培 养技术中，在不含抗菌素的培养条件下使鸡胚心脏 细胞维持生存了34年，先后继代3400次，证明动物 细胞有可能在体外无限地生长。
优点:分泌胞外、纯化方便、翻译 后修饰糖基化，与天然产品一致。
第三节 生产用动物细胞系的 要求和获得
一、生产用动物细胞的要求:
原代细胞 二倍体细胞系 连续细胞系（转化细胞系） 重组细胞系
二、生产用动物细胞的获得
⒈原代细胞
是直接取自动物组织器官,经过粉碎消
化而获得的细胞悬液（109/g）。
需要大量动物，费钱费劳力。
二、细胞工程技术
细胞融合技术 细胞培养技术 细胞器移植技术
染色体工程
组织培养技术（干细胞工程）
（一）细胞融合技术
细胞融合，又称细胞杂交，是指两个或两个以上的 细胞融合成一个细胞的现象。 正常人体内也有细胞融合现象，如两性生殖细胞结 合而成受精卵，多个巨噬细胞融合成一个体积很大的 多核异物巨细胞。
有关概念:
原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为
原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内
的细胞称为原代细胞培养。
传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配
制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的
培养瓶中继续培养，称为传代培养。
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生
长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存
G1期：4～6h， 合成 DNA聚合酶，RNA 合成； S期：6～8h ，DNA 合成； G2期：2～5h DNA量 加倍,RNA合成； M期：分裂期，0.5～ 1h 染色体分裂
⒉细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。
⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。
原代培养物经首次传代成功后即为细胞 系， 由原先存在于原代培养物中的细胞世系 所组成。如果不能继续传代，或传代次数有 限， 可称为有限细胞系， 如可以连续培养， 则称为连续细胞系(无限细胞系)， 培养50代 以上并无限培养下去。
第二章 海洋动物细胞工程
目 录
一 概 述 二 动物细胞的形态结构和生理特点
三 生产用动物细胞系的要求和获得
四 动物细胞的培养条件和培养基 五 动物细胞培养的基本方法 六 动物细胞培养方法和操作方式 七 动物细胞生物反应器
八 动物细胞产品的纯化方法和质量要求
九 动物细胞工程的实例 十 细胞工程在海洋动物中的应用
受精作用
两个细胞正在融合
细胞融合现象的发现
19世纪30年代，Muller, Schwann, Virchow 等相继在 肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核 细胞现象。 1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在。
1855年～1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织 及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。
素等。
原因？
⒌动物细胞对培养基要求高。 必需氨基酸、维生素、无机盐、
微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、
贴壁因子等。
⒍动物细胞蛋白质的合成途径和修 饰功能与细菌不同。
动物细胞蛋白质的合成部位为
游离核糖体和粗面内质网的核糖体，
有糖基化修饰，且多为分泌胞外蛋
白。
动物细胞培养：
缺点:培养条件高、成本贵、产量低。
[A]贴壁细胞：去除培养基---胰蛋白酶消化---加入 培养液，形成细胞悬液---稀释---培养 [B]悬浮细胞：收集细胞悬液---离心搜集细胞---用 培养液稀释---培养
⒉二倍体细胞系 原代细胞经过传代、筛选、克隆， 从多种细胞成分的组织中，挑
选并纯化出具有一定特征的细胞 株。
二倍体细胞有正常细胞的特点：
细胞融合技术是细胞遗传学、细胞免疫 学、病毒学、肿瘤学等研究的一种重要手 段； 如将受抗原刺激后的小鼠脾淋巴细胞分 离出来，与已建成的小鼠骨髓瘤（浆细胞 瘤）细胞融合，筛选出的杂交瘤细胞可长 期存活和增殖，成为制备单克隆抗体的细 胞株。
（二）动物细胞培养技术 1.动物细胞培养的概念：
动物细胞培养 就是从动物有机体 中取出相关的组织, 将它分散成单个细 胞,然后,放在适宜 的培养基中,让这 些细胞生长和增殖.
1859年，A. Barli研究发现某些黏虫存在着由单个细 胞核融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为 多核细胞是由单个细胞融合而成。
细胞融合的过程：细胞在促融因子的作用下，出现 凝集现象，然后，细胞之间的质膜发生粘连，细胞 开始融合，然后在培养过程中，进而发生核融合， 形成杂种细胞。
体外用人工方法使两种细胞融合，制成一种新 品系的杂交细胞，筛选出的杂交细胞有很强的 生命力，增殖也很旺盛。常用的细胞融合诱导 物是仙台病毒和聚乙烯丙醇（PEG）。 细胞A
7 0年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的
安全性，WI-38是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗
的二倍体细胞系。
二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明
显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，
一般可传代培养50代，且无致瘤性； 现在传代细胞系已被广泛用于人用治疗性药物的 生产，但仍不是理想的生产细胞系。
⒉悬浮细胞
生长不依赖支持物表面，在培养液 中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。 生长不严格依赖支持物。如中国地 鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。
⒊兼性贴壁细胞
二、动物细胞的生理特点
⒈ 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为12～48h， 细胞的分裂周期=间期+分裂期 间期（G1+S+G2）， 分裂期（M）
物理法 化学法
细胞B
仙台病毒
灭活的病毒
wk.baidu.com
疱疹病毒
新城鸡瘟病毒
杂种细胞
用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程
病毒颗粒 细胞核
细胞核
思考讨论： 为什么使用 的病毒需要 灭活？不灭 活行吗？
因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细 胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。
细胞工程的主要技术及其应用
细胞与组织培养技术
细 胞 工 程
作物改良、花卉林木繁殖、产前 诊断、遗传病防止 名贵药物、其他生物药品
细胞大批培养技术
细胞融合技术 染色体工程技术
细胞器移植技术 体外受精和胚胎移植 技术 DNA重组技术 外源基因导入技术 物理化学技术
创造新植物、生产单克隆抗体、 培育高产新菌种 创造作物新类型
活到40～50代，这种传代细胞为细胞株。
细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生
长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的
改变，使其在培养条件下可以无限制传代，
这种传代细胞为细胞系。
细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物
质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，
容易传代培养。
⒋动物细胞对周围环境十分敏感; 对理化因素敏感，如：渗透压、 pH、离子浓度、剪切力、微量元
①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制；
③可传代培养50代；
④无致瘤性。
二倍体细胞的培养意义
二倍体细胞保留着在位组织正常的细胞性状。
（1）可用于生产疫苗、尿激酶、干扰素等药 物的生产。 （2）也可用于细胞遗传学、细胞分化及衰老 的研究、以及药物的细胞毒性、环境污染的 细胞学检测。
二倍体细胞的来源
1940年，Earle建立了可无限传代的一个C3H小鼠的 结缔组织细胞系。1951年，开发了能促进动物细胞 体外培养的人工培养液。
2.动物细胞培养过程：
动物胚胎或幼龄动 胰蛋白酶 单个细胞 细胞 制成 悬浮 物的组织、器官 剪碎 液 细胞系 原 细 细胞株 代
部分细胞“癌 变”，无限传代 培 养
胞 贴 壁
加培养液
细胞 动物细胞培养不能 最终培养成动物体
50代细胞
剥离、分瓶 传代培养
10代 细胞
动物细胞的培养过程
幼龄动物 取动物器官 和组织 剪碎组织
胰蛋白酶处理 单个细胞 细胞培养
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。
思考讨论：在动物细胞培养过程中，
为什么要用胰蛋白酶对取出的动物 组织进行处理？
②物理分散法：将组织小块通过加压过筛的方法进 行机械分散，形成单个细胞和细胞团块。 ③酶消化与物理分散结合法：动物组织先经过酶消 化，再用电磁搅拌进行物理分散。
（2）传代培养
定义：当原代培养的细胞相互汇合时，细胞由原培 养瓶消化、收集、稀释后转至新的培养瓶的过程。 注意：原代细胞类型不一，需要不同的消化时间和 消化液。 步骤：
⒊转化细胞系（无限细胞系） 通过某个转化过程形成的，常由于
染色体断裂变成异倍体，失去正常
细胞特点，而获得无限增殖能力。
转化过程可以是自发的或人工的，
从肿瘤组织中分离。
4.融合细胞系
仙台病毒融合法 聚乙二醇融合法 电融合法
5.基因工程细胞系 利用基因工程技术改造编码蛋白
质的基因并转化到新宿主细胞内进
生产用最多的鸡胚细胞、原代兔肾细胞、
鼠肾细胞、淋巴细胞。
（1）原代培养
定义：从新鲜供体取得组织 细胞后在体外进行首次培养， 一般持续1～4周。 步骤：取材---组织分离--培养 方法：组织块培养法、分离 细胞培养法
动物组织块培养法
将动物组织切成直径为1
～ 2mm的小块、并 且进行培养的方法称为动物组织块培养法。 有些动物组织如人的皮肤细胞，由于分散成 细胞十分困难，因此常常采用组织块培养法。
创造动植物新品种 动植物改良、人类优生 动植物改良、基因治疗
第二节 动物细胞的形态结构 和生理特点
一、动物细胞的形态与结构 适应功能,形态各异。
离体培养细胞分三类： 贴壁细胞；悬浮细胞；贴壁-悬浮
⒈贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面， 自身分泌 或培养基中提供的贴附因子才能在该表面 上生长。 两种形态： 成纤维细胞型（细长） 上皮细胞型（圆形、多角形或放射形）
细胞核移植
重组细胞 电脉冲刺激 早期胚胎 胚胎移植
另一头绵羊的子宫
妊娠、出生
克隆羊多利
1997年2月，英国科学家 Wilmut等在世界权威杂志 《Nature》上首例报道了世界 第一只克隆羊的诞生。它的贡 献在于：证明了哺乳动物高度 分化的细胞同样含有全套遗传 信息，亦能在一定条件下发育 成动物个体，进一步证明了动 物细胞的全能性。 1998年，Thomason 成功建立 人胚胎干细胞系。
行表达。这些利用基因工程技术构
建的细胞系成为基因工程细胞系。
三、常用生产用动物细胞 的特性(了解)
W1-38
MRC-5
CHO-K1 BHK-21 Vero Namalwa
四、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立 两个细胞库： ①原始细胞库 ②生产用细胞库
来源于3-4个月的胚胎肺组织。 目前已获得了多种人胚肺二倍体细胞，如：
W1-38 MRC-5 MRC-9
IMR-90
LS-7
2BS
KBM-13
二倍体细胞的培养特征
影响二倍体细胞培养的因素有：
①分种率。一般不超过1：8，细胞密度应大于 104个/平方厘米，否则死亡率大，细胞难以 成层。
②继代寿命。细胞培养中需及时进行继代培养， 否则细胞容易退化、衰老和死亡。 ③PH值。应大于7.2，最好通过CO2培养箱和有 机缓冲液如HEPES来稳定培养液的PH值。
动物组织块固着之后，加培养液，于37℃、
CO2培养箱中、通入含5%CO2的空气进行培养， 即可在组织块周围长出新的细胞单层。动物 组织培养过程中，进行旋转或者振荡，培养 效果更好。
组织块分散成单细胞
消化分散组织块的方法分为三种：
①酶消化法：将组织块切成1～2mm的立方小块，置 蛋白酶溶液中进行消化分散，离心收集细胞，经 过平衡盐溶液洗涤，加培养基后于4℃条件下贮存 备用。