培训讲义-修改后

培训讲义-修改后
一、植物叶片总DNA的大量提取
【实验原理】
CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。

通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解在液相中；
CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

【实验目的】
利用CTAB法从植物叶片组织中提取高质量DNA。

【要紧试剂】
CTAB提取缓冲液：1.4M NaCl，100mM Tris pH 8.0，2% CTAB，2 0mM EDTA，0.5% NaHSO3，2% β-巯基乙醇。

室温储存，五年有效。

氯仿：室温储存，五年有效。

无水乙醇：-20℃储存，五年有效。

70%乙醇溶液：将无水乙醇和H2O按7:3混合。

室温储存，五年有效。

TE 缓冲液（250ml）：2.5ml 1 M Tris-HCl，pH8.0（10mM）；0.5ml 0. 5M EDTA，pH8.0（1mM）；加H2O至250ml。

室温储存，五年有效。

【操作步骤】
在液氮中将叶片研磨粉碎，取1-4克样品于合适的离心管中（初始样品为1克，用13ml管；初始样品>1克，用50ml管）。

每1克样品加入5ml CTAB提取缓冲液和25-50ug RNase A（可选），颠倒混匀，60-70℃水浴孵育40-50min，期间混匀2-3次。

从水浴中取出样品，冷却至室温。

可选：20-25℃，3000g离心3min，转移上清液到新管中。

每1克样品加入5ml氯仿。

颠倒混匀2-3min。

20-25℃，10300g离心8-10min，转移上清液到新管中。

加入等体积氯仿，重复步骤4和5。

可选：步骤4和5可重复多次，直到获得澄清的上清液。

加入等体积的无水乙醇，轻缓颠倒混匀，直到沉淀显现。

沉淀DNA。

方法1：钩出DNA。

用接种环钩出DNA（可选：1000g离心1min，富集DNA）。

将DNA（可将多个样品的DNA合并成一管）加入70%乙醇溶液中。

初始样品为1ml，加入装有1-1.5ml 70%乙醇的1.5ml离心管；初始样品>1 ml，加入装有10-12ml 70%乙醇的50ml离心管。

20-25℃，13000rpm（1.5ml管）或5100g（50ml管）离心5-7min，弃上清。

可选：用上述相同体积的70%乙醇重复洗涤DNA沉淀1次。

可选：接步骤（3），以相同速度离心1-2min，用吸头吸尽乙醇。

方法2：离心沉淀DNA。

（1）20-25℃，5100g离心5-7min，弃上清。

（2）加入5-6ml（13ml管）或10-12ml（50ml管）70%乙醇溶液洗涤DNA沉淀，20-25℃，5100g离心5-7min，弃上清。

可选：重复步骤（2）1次。

可选：接步骤（2），以相同速度离心1-2min，用吸头吸尽乙醇。

干燥DNA。

真空干燥≤10min，空气干燥≤1h（30min左右），DNA过度干燥会导致难以溶解。

每1ml样品加入100-250ul TE缓冲液溶解DNA。

也可适当增加TE缓冲液用量，或将DNA溶液置于70℃孵育1-4h，促进DNA溶解。

相同样品可合并。

可4℃过夜溶解。

DNA溶解完全后，将溶液转入1.5ml离心管。

测定DNA浓度后，按照需要，将DNA溶液分装（每管分装1个酶切体系所需DNA量，10ug/管），储存于4℃、-20℃或-80℃冰箱。

DNA样品应有唯独性编号，并与原始样品相对应。

跑0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度，ND1000分光光度计测量DNA浓度。

OD230/OD260 >0.4 ～0.5讲明有盐残留
OD260/OD280 =1.7～1.9讲明纯度专门好
OD260/OD280 < 1.7讲明有有蛋白质污染
OD260/OD280 > 2.0讲明有有RNA污染
【注意事项】
研磨前，研钵、离心管、药勺等物品均需用液氮预冷完全，研磨过程应保证样品不融解，研磨应足够细。

提取过程中，应采纳颠倒混匀方式，而不能涡旋混匀，所有过程保证离心管盖盖好，防止液体漏出。

CTAB缓冲液裂解温度一样为65℃，孵育终止后，应完全冷却至室温，该步骤可连续1-2h。

加入氯仿后，应完全混匀2-3min。

钩出DNA时，动作要轻缓，洗涤后要除尽乙醇。

TE缓冲液适用于基因组DNA、质粒DNA长期储存，ddH2O适用于短期储存。

DNA溶解后，轻缓晃动离心管，若溶液中有气泡，表明DNA浓度过高，需再加入适量TE缓冲液。

测定DNA溶液浓度前，应用吸头混匀溶液。

ND1000分光光度计测量DNA浓度，重复两次。

若样品DNA浓度为2 -100ng/ul，两次重复差值≤±2ng/ul；若样品DNA浓度>100ng/ul，两次重复差值≤2%。

【参考电泳图片】
完整度好时电泳带型：单一无拖尾，点样孔无残留杂质如下图：
提取成效不行如下图：
蛋白残留
拖尾降解
RNA残留
二、植物叶片总RNA的大量提取
【实验原理】
植物细胞内的RNA要紧是rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RN A（占10～15％）和mRNA（占1～5％）。

rRNA含量最丰富，由25S、18 S和5S几类组成。

mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在3’端都有一个polyA尾巴，因此，可按照此特性用寡聚脱氧胸苷(Oligo-dT)层析柱从总RNA中将mRNA分离出来。

一样情形下，提取的总RNA也可用于Northern blot试验。

已有多种较为成熟的分离总R NA的方法，常用的有3种。

（1）苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase 活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA；（2）盐酸胍法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和β-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀；（3）氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA缺失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。

采纳Trizol 试剂盒提取总RNA，其原理是依据盐酸胍法。

Trizol法适用于动物、植物和微生物组织，样品量从几十毫克至几克。

用Trizol 法提取的总RNA绝无蛋白和DNA 污染。

R NA可直截了当用于Northern分析，Poly（A）分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆等。

异硫氢酸胍：有效地RNAse抑制剂。

既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离，又对RNA酶有强烈的变性作用。

β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，幸免褐变，使酚容易去除；
NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少RNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于集合沉淀。

酸酚使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与核酸联结键已断,蛋白分子表面又含有专门多极性基团与
苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而核酸溶于水相。

使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。

缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。

2.不能完全抑制RNa se的活性。

氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。

【实验目的】
从植物叶片组织中提取高质量RNA。

【要紧试剂】
1、4M GT溶液：
4M GT异硫氢酸胍（Guanidine thiocyanate），
25m M 柠檬酸钠（Sodium citrate），
0.5%(w/v) 十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)，
高压灭菌之后，加入巯基乙醇到0.1M（体积比大约为：1.0%）
2、2M NaAC（ph值4.9-5.2）
3、3M NaAC
4、4M LiCL
5、DEPC H2O
{v/v 0.1% DEPC处理的ddH2O（37℃处理12h以上，处理过程要持续搅拌，高温高压灭菌去除残留）} 或TE。

【操作步骤】
植物组织1g，液氮研磨；
倒入50ml离心管中（管中事先放3ml的4M GT，冰浴），震荡混匀；
加入0.3ml 2M 的NaAC，震荡混匀；
加入3ml酸酚（水饱和酚＋抗氧化剂0.1%(w/v)δ-羟基喹啉δ-Hydrox yquinoline），震荡混匀；
加入1ml氯仿，震荡混匀，6000rpm，13min，取上清；
加入2倍体积的乙醇，-20度过夜（几小时也能够，产量可能会低）；6 000rpm，离心10min，弃上清，留沉淀；
加入1ml 4M的LiCL（放1.5ml离心管中）；13000rpm，10-15min，留沉淀；
加入0.4mlDEPC处理的水，溶解；
加入1/2体积的酸酚和1/2的氯仿，震荡混匀；
13000rpm，离心5min，取上清液；
加入1倍体积的氯仿；13000rpm，离心5min，取上清液；
加入0.1倍体积的3M NaAC和2倍体积乙醇；震荡混匀，-20度过夜；
13000rpm，离心5min，留沉淀；
沉淀RNA晾干，DEPC水或TE溶解（40—60ul）。

注：RNA溶解时不要晾太干，会导致难以溶解。

【RNA甲醛电泳】
1、试剂配制
5X甲醛凝胶电泳缓冲液：
0.1mol/L MOPS （pH—7.0）
40mmol/L 乙酸钠
5mmol/L EDTA （pH—8.0）
注：将20.6g MOPS溶于800ml经用DEPC处理的50mmol/L乙酸钠溶液（用DEPC处理）用氢氧化钠将溶液的ph值调至7.0，加入10ml经用D EPC处理的0.5mmol/LEDTA（pH—8.0）再加经用DEPC处理的水至溶液总体积为1L。

高压灭菌，室温储存于棕色瓶子中（光照或高压灭菌后溶液逐步变黄，淡黄色的缓冲液可正常使用，而深黄色缓冲液则不然）。

甲醛凝胶加样缓冲液：
50%甘油
1mmol/L EDTA（pH—8.0）
0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
2、电泳方法
注：所有用于配制与RNA接触的溶液的水需预先经DEPC处理。

凝胶制备RNA甲醛变性凝胶浓度通常为1—1.5%。

现配制1.2%凝胶2 8ml：
（1）称取0.21g 琼脂糖，17.5ml DEPC水，微波炉熔化；
（2）冷却至50—60℃，加入37%甲醛5.0ml，5X甲醛电泳缓冲液5.5 ml，EB 2ul（用于转膜能够不加），混匀；
倒胶，室温放置30min以上，使胶完全凝固；
（4）RNA变性体系
RNA 4.5ul
5X 甲醛凝胶电泳缓冲液 2.0ul
甲醛 3.5ul
甲酰胺10.0ul
混匀，65℃15分钟，迅速冰浴5分钟，稍离心。

加入甲醛凝胶加样缓冲液2ul。

（5）电泳过程
A. 先将凝胶放入1X 甲醛凝胶电泳液中100V预电泳5—30分钟；
B. 点样，100V电泳45—60分钟；
C. 照相。

D.纯度（OD260/OD280）：紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释10倍左右；溶液裂解法稀释40－50倍）
OD260/OD280 < 1.9 ～2.1讲明有DNA污染；
OD260/OD280 =1.9 ～2.1讲明纯度专门好；
OD260/OD280 > 1.9～2.1讲明有部分降解；
浓度：用ND1000分光光度计测量，重复两次。

【注意事项】
所有药品都应用DEPC水来配制。

所需要的离心管、枪头等都需要用1%的DEPC水处理过夜，然后高压灭菌。

做试验的非塑料器皿用具需要160-180℃烘干4-8小时。

做试验的桌面要用1N/L的HCl擦拭，后再用70%乙醇擦拭晾干。

提取过程尽量带手套和口罩。

DEPC水的配置：须在通风厨里带手套操作。

【参考电泳图片】
Marker（天根Marker III）：200，500，800，1200，2000，3000，450 0，红色箭头是28s片段，白色箭头是18s片段。

如果提取的RNA完整度好，28S亮度应该是18S的两倍以上，这两条带清晰，带的边缘可见。

实验二细菌实验
一、大肠杆菌细胞的活化
【实验步骤】
配制LB培养基（液体和固体）高温灭菌（120℃灭菌20min）。

配制实验中所使用的各种抗生素（0.22um抽滤灭菌），将玻璃培养皿或可灭菌的塑料培养皿高温灭菌（同上）。

倒LB培养基平板。

将所用物品放入超净台中超净工作台灭菌（打开紫外灯，照耀15 min，完毕后打开风机吹5min）。

融解已灭好菌的LB固体培养基，室温凉至50~60℃，按照质粒及菌种的特性加入相应的抗生素（如：Amp、Kan、Spe、Rif等），摇匀。

倒入玻璃或可高温灭菌的塑料平板中。

温度与速度都专门重要，因为高温使抗生素失效，且培养基中琼脂含量较高，易凝固而无法使抗生素混匀，且不易全部倒出。

划线。

使用接种环（或枪头）在冻存管中粘取菌液，左手将倒好的LB 平板在酒精灯火焰旁打开，接种环（或枪头）在平板表面至少作三次“之”
字形划线。

每次划线后要烧接种环（或更换枪头），再从上一次划痕的尾部拉出后划下一区。

将画好线的平板于37℃恒温培养箱中，倒置培养过夜（12hr以上）。

【要紧试剂】
1、LB（250mL）
液体培养基：固体培养基（添加琼脂）
NaCl 2.5g NaCl 2.5g
胰蛋白胨 2.5g 胰蛋白胨 2.5g
酵母提取物 1.25g 酵母提取物1.25g
琼脂 4.0g
120℃灭菌20min。

Amp50（50mg/ml）
称取5g氨苄青霉素，溶于100ml水中。

0.22um抽滤灭菌，分装于离心管中，-20℃储存。

Kan50（50mg/ml）
称取5g卡纳霉素，溶于100ml水中。

0.22um抽滤灭菌，分装于离心管中，-20℃储存。

Rif50（50mg/ml）
称取5g利福平，溶于100ml水中。

0.22um抽滤灭菌，分装于离心管中，-20℃储存。

Spe50（50mg/ml）
称取5g壮观霉素，溶于100ml水中。

0.22um抽滤灭菌，分装于离心管中，-20℃储存。

二、大肠杆菌感受态细胞的制备
【实验步骤】
挑取一个单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃/200rpm 培养过夜。

取500ul过夜培养的菌液加入50mlLB培养基（按照1:100的比例），3 7℃/200rpm培养3-4hr,经分光光度计测量，OD值在0.3~0.4之间。

将菌液倒入50mL离心管中，冰浴10min（同时冰浴CaCl2溶液）。

4℃，4000rpm离心10min，回收细胞，弃上清（倒去液体）。

将离心管倒置于滤纸上1min。

每管用冰冷的0.1M CaCl2 溶液10mL悬浮沉淀，冰浴30min。

4℃，4000rpm 离心10min，回收细胞，弃上清。

用冰冷的0.1M CaCl 2（含甘油）溶液1mL悬浮细胞。

分装细胞，每100μL一份倒入1.5mL离心管中，此细胞即为感受态细胞，可直截了当转化或-70℃储存。

【要紧试剂】
1、0.1M CaCl2
称取1.2g CaCl2溶解于80ml蒸馏水中，加蒸馏水定容至100ml，高温灭菌。

2、0.1M CaCl2（含甘油）
称取1.2g CaCl2溶解于80ml蒸馏水中，再添加15ml甘油，最后加蒸馏水定容至100ml，高温灭菌。

三、质粒DNA转化大肠杆菌
【实验步骤】
从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞，加入1~20ul质粒（或连接产物），冰浴30min。

质粒一样1ul足以，连接产物为5~10ul，最都不要超过20ul
否则反而阻碍转化成效。

42℃热击90s（注：应在冰浴时先打开水浴锅，使温度升到42℃）。

赶忙将离心管转移至冰浴2min，该过程尽量不要摇动离心管。

加500μL LB液体培养基，37℃，180rpm 培养60min。

按照质粒抗性情形，吸取50~200ul菌液涂布于添加了对应抗生素的平板上。

如果浓度不是专门高时，能够先4000rpm离心收集菌体再涂到平板上。

（注：涂菌器沾酒精反复烧三次，以消毒灭菌）
37℃倒置过夜。

四、菌落PCR检测
【实验步骤】
按如下表所示向离心管中添加药品：
挑取半个单菌落，加入到25uL的反应体系中，做PCR检测，并做标记。

反应条件设置为：94℃预变性10min，94℃变性60s，55℃退火30s，7 4℃延伸2min，共30循环，最后72℃延伸10min。

扩增产物于含荧光染料的1%琼脂糖凝胶电泳。

五、电泳
【实验步骤】
配制TBE电泳缓冲液0.5x TBE（10x TBE 缓冲液50mL 加水至1L）；
称取0.2g琼脂糖于20mL 0.5x TBE中，加热混匀，配成1%琼脂糖凝胶；
粘胶带，插梳子；
凝胶冷却至60℃，加0.2uL荧光染料，摇匀后倒入电泳槽。

20分钟左右可凝固。

双手均衡用力取下梳子，动作要慢；
将0.5x TBE 倒入电泳槽中，约超过胶面1cm（开始可略少，以便于点样）；
取一块封口膜，将溴酚蓝点于其上，取5uL待点样品同溴酚蓝混匀。

逐个点样，两边分别点Marker。

连接电源。

正极（+）接远离点样孔一端，负极（-）接近点样孔一端；
待溴酚蓝跑至凝胶2/3处，关闭电源，紫外观看，照相储存。

【要紧试剂】
1．10x TBE 电泳缓冲液
0.45mol/L Tris碱，0.45mol/L 硼酸，20mL 0.5mol/L EDTA（PH8.0），加水定容至100mL
2．6x 上样缓冲液
0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，15%聚蔗糖水溶液，室温储存。

六、质粒DNA提取（碱裂解法—小量）
【实验步骤】
挑取一个含重组质粒的单菌落接种于5mL 含对应抗生素的LB液体培养基的大试管中，37℃，180rpm震荡培养过夜。

也可将菌种按照1:100的比例进行接种。

将1~4mL菌液移入离心管中，4000rpm离心2min。

吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

（离心2次，弃上清，倒置于滤纸上）
将细胞沉淀悬浮于100μL溶液I（冰预冷）中，充分混匀，室温放置10min。

（上下颠倒混匀，可稍用力轻弹，现在配溶液II，并冰浴溶液III）加200μL溶液II（新奇配制），盖紧管口，混匀内容物，冰上放置至澄清，该过程不能超过5min。

（溶液II需要新奇配制，两种溶液使用前预混。

该过程动作务必轻柔。

）
加入150μL冰冷的溶液III，盖紧管口，现在显现白色絮状，颠倒数次使混匀，冰上放置3min~5min。

4℃/12000rpm 离心5min，取上清移至另一离心管中。

向上清中加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，4℃/12 000rpm 离心5min，吸取上清移至另一离心管中。

向上清中加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的3M NaAc（pH 5.2），混匀后，冰浴10分钟，4℃/12000rpm 离心5min，弃上清，倒置离心管于滤纸上。

（上清和乙醇总体积的1/10为NaAc体积）
用1mL 70%乙醇洗涤质粒沉淀（在沉淀的另一侧加乙醇，不要将沉淀冲起来），振荡并离心，倒去上清液。

待酒精挥发洁净后，加20μL TE缓冲液，其中含有20μg/mL的胰R NA酶，放在37℃水浴中保温1h，使DNA完全溶解，-20℃储存。

【要紧试剂】
1. 1M Tris·Cl缓冲液（1L）pH 8.0
称取121.1g Tris溶于800mL水中，搅拌条件下加入浓盐酸（pH 7.4
约使用浓HCl 70mL；pH 7.6约使用60mL，pH 8.0约使用42mL），溶液冷却至室温，用盐酸准确调pH值至8.0，加入重蒸水至总体积1L，分装，高压灭菌。

Tris·Cl溶液的pH值随温度变化而变化，温度每升高1℃，pH 值约降低0.03单位，配置及使用时需注意。

2. 0.5M EDTA缓冲液（1L）pH 8.0
称取EDTA-Na2·2H2O 186.1g，加入800mL重蒸水，磁力搅拌器搅拌，加入NaOH调至pH 8.0，用重蒸水定容至1L。

（注：只有在pH值接近8.0时，EDTA- Na2·2H2O才能完全溶解。

调pH值时能够用固体NaO H，大约使用20g左右，也能够用10mol/L的NaOH溶液，大约使用70mL，待EDTA- Na2·2H2O完全溶解后再用稀NaOH准确调至8.0。

）
3. I号液（100mL）
葡萄糖0.98g 、2.5mL 1M Tris·Cl、2mL 0.5M EDTA 2.0，加ddH2 O定容至100mL。

4. II号液（不灭菌）
0.4M NaOH（100mL）和2%SDS等体积混合，新奇配制。

A、0.4M NaOH（100mL）：称取1.6g NaOH，dH2O定容至100mL。

B、2%SDS（50mL）：称取2g SDS，dH2O定容至100mL。

5. III号液（100mL，pH 4.8）
先配100mL KAc（49.07g KAc定容至100mL）取60mL，冰乙酸11. 5mL（pH 4.8），用dH2O定容至100mL。

6. 10mg/mL 溶菌酶
0.01g溶菌酶+ 1mL无菌水+ 10μL 1M Tris·Cl
7. TE（100mL）
1M Tris·Cl 1mL + 0.5M EDTA 0.2mL，加dH2O定容至100mL。

8. 3M NaAc（100mL）pH 5.2或pH 7.0
称取40.8g NaAc·3H2O溶于80mL dH2O中，用稀乙酸调pH至5.2（7.0），定容100ml，高压灭菌。

9. 10mg/mL 溶菌酶
0.01g溶菌酶+ 1mL无菌水+ 10μL Tris·Cl
10. 胰RNA酶（20μg/mL）
2μL胰RNA酶原液+ 1mL TE，分装
七、质粒的酶切鉴定
【实验步骤】
按如下表所示向离心管中添加药品：
37℃（或其他酶的最适温度）孵育1-4小时。

电泳检测酶切结果。

实验三植物组织培养有关操作
【有关名词】
1、外植体：在组织培养中培养对象的起始材料。

2、培养基：在组织培养中用于给植物提供营养、固定植株的材料和试剂。

3、无菌操作：在整个操作的进行过程中，材料所处的环境、所使用的试剂、器皿、器具差不多上无菌的，如此的操作过程称为无菌操作。

4、接种：把培养材料放到培养基中或插到培养基上的操作。

5、继代培养：把培养材料接种到新的培养基上连续培养。

6、表面消毒：用消毒液把植物材料表面的微生物杀死，防止组织培养中污染的过程。

【植物材料】
紫花苜蓿无菌苗。

烟草无菌苗。

温室栽培的紫薯。

【仪器、器具、器皿及其他】
仪器：电子秤、pH计、磁力搅拌器（带搅拌子）、高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌器、超净工作台。

器具：移液器（吸头）、镊子、手术剪、手术刀（刀柄、刀片）。

器皿：量筒、塑料培养皿、塑料培养瓶、三角烧瓶、玻璃培养皿、称量皿。

其他：封口膜、酒精棉、滤纸等。

【试剂配制】
培养基
MSO培养基：
称取4.74g MS培养基粉末和30g 蔗糖，加入装有900ml 蒸馏水的1L 三角烧瓶中，加入搅拌子，在磁力搅拌器上搅拌。

待其溶解后，定容到1L，并用1N NaOH和1N HCl将pH值调到5.8。

调好pH值后，加入8g 琼脂粉，用封口膜封号瓶口，等待灭菌。

MB培养基：
称取4.74g MS培养基粉末和30g 蔗糖，加入装有900ml 蒸馏水的1L 三角烧瓶中，加入搅拌子，在磁力搅拌器上搅拌。

待其溶解后，加入1ml B5有机母液、NAA、6-BA并定容到1L，并用1N NaOH和1N HCl将pH 值调到5.8。

调好pH值后，加入8g 琼脂粉，用封口膜封号瓶口，等待灭菌。

消毒液
70%酒精：
用量筒量取700ml 95%医用酒精，加入200ml 蒸馏水，混合平均即成。

0.1% HgCl2：
称取1g HgCl2，在三角烧瓶内溶于1L 蒸馏水中，用封口膜封号瓶口，等待灭菌。

无菌水：
装1L蒸馏水于三角烧瓶中，用封口膜封号瓶口，等待灭菌。

【操作步骤】
培养基预备
培养基灭菌
把高压蒸汽灭菌锅电源接通，确认锅内的水处于高水位；把培养基以及所有需要灭菌的试剂放入锅内，盖上锅盖，设定灭菌时刻（20min）、温度（121℃），打开气阀，开始灭菌。

待锅内温度升到102℃以上，将气阀关闭，连续灭菌。

灭菌时刻到后，小心打开气阀，缓慢放气。

待锅内热气排尽后，打开锅盖，把物品移到超净工作台中。

超净工作台消毒
把超净工作台内的干热灭菌器电源打开（如果不用，则不用打开），把培养瓶/皿（或培养基）放入超净台内，打开超净台紫外灯，消毒20~30mi n。

之后关掉紫外灯，打开风机和照明灯备用。

注意：以下的操作（除紫薯藤条的冲洗外）均为无菌操作，在超净工作台内操作前，应先用酒精棉把手擦净，进行表面消毒后方可进行。

培养基分装
待培养基冷却到50~60℃左右，把培养基平均地分装到培养瓶或者培养皿中，并在瓶、皿上做好标记。

每升培养基能够倒20瓶/皿。

紫花苜蓿的继代培养
把干热灭菌器中的手术剪和镊子取出，晾凉备用；用少量无菌水玻璃培养皿的滤纸潮湿备用。

把装有紫花苜蓿无菌苗的培养瓶的外部用酒精棉擦净，打开盖子，用剪刀把紫花苜蓿齐根部剪断，用镊子取出，放到润湿的滤纸上。

用剪刀剪去叶子，并把去掉叶子后的茎剪成段，每段留一个腋芽；用镊子把茎段接到塑料培养瓶内的MSO培养基上（生理下端插入培养基内），盖上瓶盖。

每瓶接种4~6段。

新接种的瓶子做好标记，放到光照培养室中培养。

烟草叶片的再生诱导
把干热灭菌器中的手术剪、镊子和手术刀取出，晾凉备用；用少量无菌水玻璃培养皿的滤纸潮湿备用。

把装有烟草无菌苗的培养瓶的外部用酒精棉擦净，打开盖子，选长势好、比较嫩的叶片用剪刀从叶柄剪下，用镊子取出背面朝上放在润湿的滤纸上。

用镊子固定住叶片，用手术刀小心把主叶脉去除。

去除主叶脉的叶片，用手术刀切成3mm╳3mm的小片，背面朝下，放在培养皿内的MB培养基上，用封口膜封住培养皿，做好标记。

放到光照培养室中培养。

紫薯藤条的表面消毒和接种、培养
把干热灭菌器中的手术剪和镊子取出，晾凉备用；用少量无菌水玻璃培养皿的滤纸潮湿备用。

紫薯藤条的表面消毒：将温室中剪下的紫薯藤条用自来水洗净，并用吸水纸吸干（超净工作台外操作）。

洗净的紫薯藤条剪成每段约3~5个腋芽的茎段，弃去叶子，放入烧杯中，倒入70%酒精直至藤条被完全浸没，消毒30sec，期间用镊子把藤条稍作晃动。

倒掉酒精，加入0.1% HgCl2溶液
至浸没，消毒8min，期间镊子把藤条晃动数次。

倒掉HgCl2溶液，加入无菌水，剧烈晃动，漂洗3分钟。

重复漂洗三次。

紫薯藤条的接种、培养：漂洗好的藤条放到事先预备好的用无菌水润湿的滤纸上，用剪刀剪去藤条两端受损害的部分，把中间部分剪成数段，每段一个腋芽。

用镊子把茎段接到塑料培养瓶内的MSO培养基上（生理下端插入培养基内），盖上瓶盖。

每瓶接种4~6段。

新接种的瓶子做好标记，放到光照培养室中培养。