结构生物学介绍及进展

结构在现代生物学里的中心地位
• 在分子生物学中，结构是非常重要的内容。
• 只有在获得相应分子的结构后才能深入地 研究其功能和生化过程。
举例
• 酶蛋白：只有在了解了酶的活性中心的结 构以及如何与底物的结合后，才能真正了 解这种酶的作用机理；
• 对肌肉中的肌动蛋白和肌球蛋白的结构有 了详细的了解，才能说明肌肉收缩和非肌 肉细胞运动的机理。
蛋白质结构测定的流程
靶标 克隆 15272 14866
表达 可溶 6408 1474
2008.6.16
纯化 843
结构 80
各种生 物基因 组和功 能基因 组数据
基因 克隆
蛋白制备
样品制备
结构测定
结构测定
蛋白结构
获得生物大分子结构的主要技术
实验耗时
分辨率低
灵敏度低
单晶难以获得
相位解析需要特殊单晶
• 实验相对简单快速，提供了原位研究动态过 程的可能性。
小角散射（1D） 衍射（3D）
1条谱线 结构信息（3D）
上万个衍射点
图片来自 8 .
小角散射的缺点
• 小角散射得到的信息量很少，要得到三维 的结构信息是很困难的。只能得到一些比 较粗略、低分辨的信息，如生物大分子的 大小、形状等。
• 衍射可以获得非常多的衍射点强度，能够 解析出三维的结构来。
• 相对于晶体学衍射，小角散射的理论还不 够成熟。
经典应用
• 生物大分子（散射体）的大小、分布； • 大致形状（球形、柱形、椭球形等）。 • 分子越大，实验越容易：和晶体学正好相
反。
最近发展
• 可以拟合出生物大分子的形状： • 利用一系列球谐函数表征分子外形，这个
外形（包络）之外密度为零，之内是均匀 的密度。 • 或者用一系列的虚拟原子（ ）或者虚拟残 基来描述生物大分子，调整这些虚拟原子 或者虚拟残基的位置来确定分子形状。
结构生物学
，，
结构生物学的定义
• 顾名思义，结构生物学就是研究各种生物 大分子（蛋白质、核酸、糖类等）的结构， 结构与功能的关系，以及如何在生物体内 发挥作用的学科。
结构的重要性
• 生物大分子的功能主要取决于其结构。
• 结构的异常会引起功能的改变，也是所谓 “构像病”的原因。
疯牛病等构像病的罪魁祸首—
得到晶体 探测衍射点强度 确定衍射相位 得到电子密度分布 进而获得原子位置
主要问题： 单晶难于制备，特别是复合物 解析相位需要特殊晶体
小角散射（）
不需要晶体，在溶液中就可进行实验。 不受分子量限制。不受浓度限制。 实验时间短，对样品稳定性要求低。 仪器设备简单，可以开展原位实验。
图片来自 8 .
小角散射所需的样品
• 核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大的 结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个 月的数据收集时间）。
• 晶体学方法：对样品要求过高，高质量晶体的获得困难。
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F (h,k,l)F (h,k,l)ei(h,k,l)
(h,k,l)?
蛋白质晶体
• 衍射能力很弱：大部分原子为C、N、O、S； • 晶体质量差，晶胞大； • 相位问题解决困难。
理想的光源必须具有以下特点： 高亮度：衍射能力很弱也可以得到好的数据； 准直性好：质量差、晶胞大的晶体也可以进
行实验； 能量可调：多波长反常散射解决相位问题。 同步辐射正好提供了适合的光源。
什么是同步辐射？
• 接近光速运动的电子或正电 子在改变运动方向时放出的 电磁辐射，因为是在同步加 速器上发现的，所以称为同 步辐射。
• 这种辐射强度高、覆盖的频 谱范围广，可以任意选择所 需要的波长且连续可调，因 此成为一种科学研究的新光 源。
同步辐射装置示意图
部分图片来自
储存环
三种发光元件
波荡扭器摆(u器nd(uWlaigtogrl)er) 弯转磁铁
图片来自
实验站
光束线
发光元件
同步辐射的亮度（单 位时间，单位面积， 单位立体角，一定光 子能量范围内的光子 数）和转靶X光机的比 较。
1m量级蛋白质晶体的结构解析
目前，10微米左右的质量良 好的晶体已经能够解析出生 物大分子结构。（，发表于 J. . ., 367, 310-318. 2007） ：可能达到5微米。
但是有相当多的生物大分 子只能够获得1微米左右 的微晶，如左图所示的与 老年性痴呆相关的蛋白质 很难形成大的单晶。
“同步辐射+硒代+样品冷冻”已经 成为解析全新结构的标准方法。
多波长反常衍射（）
• 可以解析全新结构，如果能够得到足够的 同晶置换晶体的话。
• 如果蛋白质里有金属离子存在，就可以使 用方法。
• 硒代。
原子散射因子
• 选择吸收边附近的几个波长，相当于几个 不同的完全同晶的置换。
• 分子生物学提供了硒代的手段，对于解析 全新结构非常有利。
烯醇酶-磷酸酶 E1
波长得到的相角
三个波长得到的相角
人源“” 蛋白
与的组合
三个波长
同步辐射蛋白质晶体学的发展
• 更小的晶体：生长晶体是蛋白质晶体学的 瓶颈，如果能够解析小晶体的结构将使得 许多困难的结构成为可能。
• 更自动化的实验流程：无论是解析结构还 是在药物研究中的应用，大量的尝试需要 自动化的流程。
研究实例（一） 从基因到功能：脱氨酶
, 206 159 .
206： S.
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• a 2+ ;
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D N A
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2O
2+
2+
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A
G
T
C
C T, :; T, :.
206: ,
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同步辐射覆 盖了一个很 宽的频谱范 围，从远红 外到硬X光。 而X光机只 能提供几个 分立的光子 能量。
（多对同晶置换）
设法在蛋白质晶体 中加入一些重金属 离子，同时晶体结 构不发生大的变化 （同晶置换），置 换前后结构因子的 关系。
一个同晶置换可以得到两个可能的解。
两个同晶置换就可以得到唯一的解。
由于结构的变化， 导致了疯牛病、克 雅氏病（ ； ）等传染性脑海绵 状病变（）。
正常的
致病的
分子生物学： 现代生物学的主流方向
• 分子生物学是现代生物学中最重要的学科， 几乎每年的诺贝尔化学奖，生理学或医学 奖都授予这方面的研究。
• 研究各种生物大分子的功能以及在生物体 中的生物化学过程，是分子生物学最重要 的任务。
一般完成f1数据的收集，进行f2数据收集时 就完成相位解析了。
几个波长？
• 理论上2个波长就足够破解双解了，但是有 直接法的帮助，1个波长也就足够了。
• 当然波长越多会越好，但是实验时间的延 长往往会带来不可预知的因素：辐射损伤， 仪器设备的不稳定等。
反常衍射的分类
• 单波长反常衍射：； • 多波长反常衍射：。
• 关键是衍射实验使用的X射线（能量）波长 必须可变！
同步辐射的作用
• 同步辐射的加入，大大提高了结构测定的 速度。
蛋白质结构的增( 加)
图片来自
同步辐射促进了蛋白质结构的解析
• 1980-1990年，获得解析的蛋白质数量大幅 度增加；
• 1980左右，同步辐射开始应用到蛋白质结构 解析中，1990年各种技术趋于成熟，同步辐 射大规模应用于生物大分子结构解析。
重建晶体结构中丢失部分
晶体衍射中看不到的部分一般都是一些柔性的区域。利用小角散射可以拟合出这 些区域来。 程序： , , , ， (2002). 83, 3112–3125
生物大分子复合物
已知各亚基分子结构， 而复合物结构未知；改 变亚基相对位置及取向 来拟合实验谱线。 程序： , ，J. . . (2001). 34, 527–532
• 一共有11项诺贝尔奖授予生物分子结构 方面的研究。
• 有结构解析方法研究，也有重要的生物 分子结构和功能研究的工作。
1962
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1962
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1964
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1982
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1985
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1988
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1997
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2002
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用球谐函数展开来表示生 物大分子形状。拟合展开 系数，使得计算谱线与实 验最接近。需要正则化方 法来进行拟合。 程序： D. I. ，J. . . (1992). 25, 495– 503
M. B. , V. V. D. I. J. . . (1997). 30, 811–815
用虚拟原子来表示生物大分子形状。 模拟退火这些虚拟原子的位置，使得 计算谱线与实验最接近。 程序： 和 D. I. ， (1999). 76, 2879–2886
图片来自 设计报告
2p立体角：180°
1毫弧度：0.06 ° 三代光源甚至达到10微弧度
实际的蛋白质单晶
真实单晶体内部不 是完美的，可以看 成有一系列的小晶 体镶嵌而成，每个 小晶体可以认为是 完美的晶体。这些 小晶体取向无序的
程度以“镶嵌度” 表 征。
• 分子置换法（ ，） • 同晶置换法（ ，，） • 反常散射法（ ，，） • 直接法（ ）
2003
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2006
""
2009
A.
E.
""
2003年诺贝尔化学奖 钾离子通道的三维结构图
选择筛
外螺旋
内螺旋
钾离子透过细胞膜的输运行为，对体内或是大脑中 神经信号的传导至关重要。然而离子通道的选择性 透过行为却困扰了生物学家许多年。
钾离子通道的离子导通机理
通过钾离子通道的三维 结构，解释了它对离子 的选择性透过机理。（1） “多离子透过”的过程： 原先通道里有三个钾离 子被束缚在里面，只有 体积合适的钾离子才能 通过撞击，将另一个钾 离子从相反方向弹出， 而体积较小的纳离子不 行。
小角散射
.
获得生物大分子结构的困难
实验耗时
分辨率低
灵敏度低
单晶难以获得
相位解析需要特殊单晶
• 核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大的 结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个 月的数据收集时间）。
• 晶体学方法：对样品要求过高，晶体不是想得到就能得到的。
技术可以研究溶液状态的蛋白，但是 受到很多限制
测定一系列二维、三维 核磁共振谱，通过谱峰 位置计算原子之间的键 长、键角、二面角等立 体化学参数，从而得到 整个分子的三维结构。
存在的限制：
灵敏度不够：需要很浓的溶 液
分辨率不高：存在分子量上 限（<39）
采集速度慢：样品稳定性问 题
缺少弱相互作用和中间体捕 获技术
膜蛋白结构的测定方法不完 善
蛋白质晶体学的问题主要在于样品
• ~50微升溶液； • 蛋白浓度在0.1-10； • 分子量在几千至几亿； • 单分散（）。
图片来自 8 .
小角散射的优点
• 对样品的要求很低：溶液样品既可，分子量、 浓度不拘，稳定性不用很高。
• 有些时候结晶会引起一些结构上的变化（由 于结晶时候的 导致），小角散射实验在溶液 中进行，更好地反映生物大分子的真实状态。
.
423, 33–41 (2003)
结构生物学进展：
董宇辉 ，，
• 同步辐射（ ） • 小角散射（ ） • 自由电子激光（ ）
同步辐射
:.
X射线晶体学和是蛋白质 结构测定的主要技术
测定方法 X射线晶体学
综合方法 总数
蛋白质结构
74768 9616
99.2%
458 51 165
85058
，2012年10月2日
目前同步辐射装置希望能提供1微米的聚焦光斑解析这 些 m大小晶体的结构。将大大降低生物大分子结晶 的门槛，极大地推动结构生物学研究和药物研发的进 展。
• 同步辐射提供了解析蛋白质结构最适合的 光源。
• 同步辐射的广泛应用，分子生物学技术的 发展以及蛋白质晶体学理论、软件的完善， 使得解析蛋白质结构成为相对比较常规的 技术。
生物学家的评论
• 生物大分子结构测定影响了生物学几乎所 有的领域。
• 几乎每个星期都有激动人心的结构发表在 如和这样的杂志上。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• 生物大分子晶体学已经比其他任何学科更 多地得益于同步辐射的应用。
•
E. ， .
实验的波长选择
f1
f3
f2
f4
四个可选择的波长
• f1：，f"最大； • f2：，f'最大； • f3： ； • f4： 。 • 流行做法：一边收集数据，一边解析结构。
（2）通道内氨基酸残基的结构，模拟了钾离子在溶液中的水 合状态。只有水合的钾离子能够在通道内犹如在水溶液内一 样自由地运动。
,
( ) 3.2Å .
钾离子通道
280, 69-77 (1998) 95, 649-655 (1998) 289, 123-127 (2000) 414, 37-42 (2001) 414, 43-48 (2001) 415, 287-294 (2002) 111, 967-965 (2002)