茶花鸡MHC单倍型及其对HPAI免疫应答水平影响的测定

茶花鸡MHC单倍型及其对HPAI免疫应答水平影响的测定

ZHENG Yu-fang;JIAN Zong-hui;DUAN Rui-rui;LU Qiong-fen;LIU Jian-ping;CHEN Pei-fu

【摘要】为筛选茶花鸡H5N1高致病性禽流感(HPAI)抗性MHC单倍型,本实验对293只脱温茶花鸡先后两次接种同一HPAI灭活疫苗(0.4 mL/只),二次免疫前、后采集抗凝外周血,分别应用病毒血凝抑制(HI)试验和夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆特异性抗体效价和IFN-γ水平;通过PCR扩增分析微卫星LEI0258和MCW0371,根据扩增产物的长度多态性确定个体MHC单倍型及基因型.选取频数不少于5的MHC单倍型或基因型,对其与抗体效价和IFN-γ水平的关联性分别做单因素方差分析.结果显示,应用PCR扩增LEI0258获得50种长度多态性片段,包括已有命名的20种和新发现的30种;二免后茶花鸡实验群体特异性抗体效价和IFN-γ水平均极显著高于二次免疫前(p＜0.01);249 bp、307 bp、319bp携带组和B17单倍型纯合子组二次免疫后抗体效价和IFN-γ水平均显著高于其它组(p＜0.05).本实验初步判定249 bp、307 bp、319bp携带者和B17单倍型纯合子具有较高的HPAI免疫应答水平,提示其可以作为进一步鉴定HPAI抗性的候选MHC 单倍型,有望为建立HPAI控制新策略提供思路.

【期刊名称】《中国预防兽医学报》

【年(卷),期】2019(041)001

【总页数】6页(P63-68)

【关键词】茶花鸡;主要组织相容性复合体;微卫星;抗体;γ干扰素

【作者】ZHENG Yu-fang;JIAN Zong-hui;DUAN Rui-rui;LU Qiong-fen;LIU Jian-ping;CHEN Pei-fu

【作者单位】

【正文语种】中文

【中图分类】S852.4

H5N1 高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)是严重危害

养禽业和人类健康的人兽共患病。目前中国的禽流感防制主要是采取捕杀并结合疫苗免疫的策略[1]。有国外学者报道红色原鸡(Gallus gallus)对H5N1 HPAI 具有较强的抵抗力[2]。茶花鸡作为滇南一带少数民族驯养红色原鸡形成的半野生鸡品种，并与后者存在基因交流，其继承了红色原鸡丰富的群体遗传多样性[3-5]，可能具

有类似的遗传抗病特性。研究发现，已知主要组织相容性复合体(MHC)是决定动

物抗病力的关键遗传因素，据此国外已培育出抗马立克病的鸡品系[6-7]。基于获

得性免疫应答水平可视为动物抗病力的间接选择指标，有必要对接种HPAI 疫苗的茶花鸡测定其血清特异性抗体效价和效应T 细胞干扰素(IFN-γ)水平，以期找到代

表HPAI 抗性的MHC 单倍型或基因型。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1 亚型Re-5 株)为乾元浩生物股份有限公司生产；AIV H5 亚型血凝抑制试验抗原由哈尔滨维科生物技术开发公司生产；293 只健康脱温茶花鸡由云南省西双版纳茶花鸡保种场核心群繁殖，为同

一批孵化，饲养条件相同，均仅在1 日龄接种马立克疫苗，90 日龄后独立饲养；IFN-γ ELISA 检测试剂盒Chicken IFN-γ CytoSetTM Catalog#CAC1233 购自

Invitrogen 公司。

1.2 引物的设计根据GenBanK 提供的鸡MHC 参考基因序列Z83781 设计引物(表1)，由昆明擎科生物合成。其中，LEI0258-F/LEI0258-R 为微卫星LEI0258 扩增引物，MCW0371-F/MCW0371-R 为微卫星MCW0371 扩增引物。

表1 实验用引物序列Table 1 The sequence of primers used in the experiment引物名称Primer name LEI0258-F LEI0258-R MCW0371-F

MCW0371-R引物序列(5'→3')Primer sequence

(5'→3')CACGCAGCAGAACTTGGTAAGG AGCTGTGCTCAGTCCTCAGTGC CTGCTCCGAGCTGTAATCCTG TTTCATGGCATCCTAAGATG扩增产物大小Product size 183 bp-552 bp 200 bp-209 bp

1.3 实验动物免疫及采血对293 只健康脱温茶花鸡分别于35 日龄和53 日龄接种同一HPAI 灭活疫苗(H5N1 亚型Re-5 株)(0.4 mL/ 只)，二免前1 d、二免后7 d 均采集翅下静脉全血约2 mL，自然沉降1 h～2 h，分离血浆和血细胞，-20 ℃保存。

1.4 血浆抗体效价检测参考《中华人民共和国国家标准高致病性禽流感诊断技术》GB/T 18936-2003，采用HA-HI 检测二免前、后的血浆中禽流感抗体效价。采用血凝抑制试验检测血浆中H5N1 抗体效价，判定茶花鸡的体液免疫应答水平。

1.5 血浆IFN-γ 水平检测利用IFN-γ ELISA 检测试剂盒检测茶花鸡血浆中IFN-γ

水平，测定OD450nm值，并绘制标准曲线的直线回归方程y=0.0002x+0.0386，R2=0.9963，根据样品的OD450nm 值用回归方程计算对应样品的IFN-γ 的浓度，判定细胞免疫应答水平。

1.6 茶花鸡微卫星的扩增及测序分析提取1.3 中采集全血的鸡红细胞基因组DNA，以此为模板，分别以LEI0258-F/LEI0258-R和MWC0371-F/MWC0371-R为引

物配制30 μL 体系，体系组成为：ddH2O 21 μL、10×PCR Buffer (Mg2+)3 μL、