基于Keap1

福建中医药第 54 卷
病是针刀疗法的优势病种［12-13］。

颈椎的生物力学平衡是由颈部肌肉和椎体、椎间盘共同维持的，而颈部肌群劳损、椎间盘退变所导致的生物力学失衡是引起颈椎病的最常见原因［14］。

肌肉由于长期劳损所致的慢性炎症浸润，阻碍肌肉的损伤修复，致使结缔组织大量增生，提高肌肉硬度的同时降低了弹性，导致肌肉的纤维化，从而出现颈部疼痛、活动受限等［15-16］。

针刀是通过对颈部软组织进行松解、剥离来治疗CS，从而起到疏通经络、调和气血的作用，改善疼痛、活动受限等症状［17］。

但目前对于针刀疗法改善肌肉纤维化的具体作用机制尚不明确。

颈部肌肉纤维化是CS发生、发展的病理基础，Notch信号通路在促进组织纤维化过程中发挥重要
作用，在纤维化组织中，Notch呈高表达状态［18］。

TGF-β1是维持椎间盘成熟软骨细胞外基质的重要
调节物质，能够诱导和趋化炎性细胞参与椎间盘的病变，同时椎间盘的退变程度与肌肉组织内的TGF-β1含量有着显著关系［19-20］。

临床研究表明，在以纤维化为病理基础的各种组织病变中，均与TGF-β1过度表达密切相关［21］。

同时，Notch为TGF-β1的应答基因，TGF-β1的过表达会激活Notch信号通路，而Notch信号表达提升又会进一步刺激TGF-β1的水平，二者互相调节也存在相互交叉的片段［22-23］。

平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原蛋白（Collagen Ⅰ）分别是纤维蛋白和胶原蛋白的主要标志物，对于评估颈部肌群纤维化具有重要意义［24］。

本研究结果显示，造模后，与正常组相比，模型组颈后肌群弹性升高，可见炎症浸润、纤维化改变，Notch2、TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅰ等蛋白含量显著升高，提示骨骼肌纤维化、炎性渗出是CS的重要病因［25-26］。

与模型组相比，针刀能够下调模型组肌肉组织中α-SMA、Collagen Ⅰ表达，改善颈部肌群纤维化。

同时能够下调Notch2和TGF-β1的表达，Notch2能够抑制成肌细胞分化为肌成纤维细胞［27］，而TGF-β1的磷酸化是间质固有成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的重要来源［28］。

本次研究发现为针刀疗法在临床上治疗颈部疼痛提供了理论依据，同时为后续的治疗机制研究提供了新的靶点。

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18
福建中医药2023 年3 月第54 卷第3期
Fujian Journal of TCM March 2023，54（3）
基于Keap1/Nrf2/HO-1抗氧化信号通路探讨
泰山磐石散对流产大鼠子宫蜕膜的影响
刘小倩1，冉添福1，林超睿2，黄玉欣2，钟滨2，江澍2*
（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州 350122；
2.福建中医药大学中西医结合学院，福建福州 350122）
摘要：目的探讨泰山磐石散对流产大鼠子宫蜕膜组织Keap1/Nrf2/HO-1抗氧化信号通路的影响。

方法采用随机数字表法将18只SPF级受孕后的SD大鼠分成空白对照组、模型组和治疗组，每组各6只。

模型组和治疗组于妊娠第6～8天予皮下注射溴隐亭溶液建立流产模型；妊娠第1～11天，治疗组予泰山磐石散药液灌胃，空白对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。

于妊娠第12天取子宫。

观察3组大鼠死胎个数及胚胎总数，并计算出胚胎吸收率；HE染色法观察大鼠母胎界面蜕膜组织形态学变化，RT-PCR和免疫组化法分别检测各组大鼠母胎界面蜕膜组织中Keap1、Nrf2和HO-1基因水平和蛋白表达。

结果与空白对照组比较，模型组大鼠胚胎吸收率明显提高（P＜0.01），蜕膜组织中Keap1基因水平及蛋白表达明显提高（P＜0.05，P＜0.01），Nrf2和HO-1基因水平及蛋白表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，治疗组大鼠蜕膜组织中Keap1基因水平明显降低（P＜0.01），Nrf2和HO-1基因水平明显提高（P＜0.01），HO-1蛋白表达明显提高（P＜0.05）。

与空白对照组比较，模型组蜕膜组织中血管减少且扩张严重、蜕膜细胞排列紊乱；与模型组比较，治疗组大鼠蜕膜组织中血管丰富，血管扩张得到改善，细胞排列相对整齐。

结论泰山磐石散可能通过促进Keap1与Nrf2的解离以及激活Nrf2的转录，上调下游HO-1的表达，降低蜕膜组织的氧化应激水平，减少胚胎的氧化损伤，从而起到保胎的作用。

关键词：自然流产；泰山磐石散；Keap1/Nrf2/HO-1信号通路；蜕膜组织；氧化应激
自然流产（spontaneous abortion，SA）是指非人为因素造成、发生在妊娠22周前、胎儿体质量＜
500 g而自然终止妊娠的流产［1］。

在全部妊娠中，有10%～15%会发生自然流产［2］，临床上不明原因的反复自然流产是生殖医学的一个巨大挑战，给女性及家庭带来巨大伤害。

SA发病机理极其复杂，至今尚未能完全阐明。

目前认为SA与母胎的免疫失衡关系密切，正常妊娠时，母体会保持抗氧化与氧化的平衡状态［3］，如被打破，蜕膜组织中大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆积，会造成滋养层细胞、内皮细胞等氧化损伤，破坏细胞结构，导致流产的发生［4］。

Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是一条经典的抗氧化通路，在抑制氧化应激和保护细胞中起到了重要的作用［5］。

中医学保胎治疗历史悠久，而泰山磐石散就是经典保胎方剂，《竹林女科证治》中记载：“其预防堕胎之药，三月以前宜芎归补中汤或泰山盘石散”，其通过气血两补、脾肾同调，达到保胎元的目的。

课题组前期研究结
果显示，泰山磐石散可降低流产大鼠的胚胎吸收
率，具有一定的减轻炎性反应作用，以发挥良好的
保胎效果［6］。

因此，本研究拟从Keap1/Nrf2/HO-1
信号通路探讨泰山磐石散治疗SA的作用机制，以
此提供中医药治疗SA的实验依据。

1　实验材料
1.1　实验动物　SPF级SD雄性大鼠18只，雌性大
鼠18只，体质量（220±20）g。

雄鼠购于杭州医学
院，合格证编号：20220223Aazz010*******，许可证
号：SCXK（浙）2019-0002；雌鼠购于北京华阜康生
物科技股份有限公司，合格证编号：110322220100 867623，许可证号：SCXK（京）2019-0008。

本实验方案经福建中医药大学实验动物伦理委员会批准
（FJTCM IACUC 2022002）。

动物饲养于福建中医
药大学实验动物中心SPF级屏障保护系统中，自由
饮水摄食，光照与黑暗环境交替12 h，温度维持在22～26 ℃，湿度为45%～60%。

1.2　实验药物　泰山磐石散组方：黄芪9 g，人参9 g，川续断9 g，当归9 g，黄芩9 g，熟地黄7.2 g，川芎7.2 g，白芍7.2 g，白术4.5 g，炙甘草4.5 g，砂仁（后下）4.5 g，糯米18 g，购于福建中医药大学第三附属人民医院。

根据单位体质量的剂量换算，大鼠的等效剂量相当于成年人（60 kg）的6.3倍，计算得大鼠灌胃量约为10 g/（kg·d）。

大火煮沸后，用文火煮25 min，加入捣碎的砂仁再煮5 min，过滤得药液后，重复煎煮1次，将2次药液混合，水浴蒸发，制
收稿日期：2022-10-08
基金项目：福建省自然科学基金项目（2022J01350，2018J01881）；
福建省中医药大学校管课题（X2021002-重点）；国家级
大学生创新创业训练计划项目（202210393009）
通信作者：江澍，E-mail：*************
DOI：10.13260/ki.jfjtcm.2023.03006
19
福建中医药第 54 卷
成含生药量1 g/mL的泰山磐石散药液。

溴隐亭溶液用75%乙醇配制成浓度为0.4 mg/mL的溴隐亭悬液，4 ℃避光保存。

1.3　实验试剂　甲磺酸溴隐亭片（上海源叶生物科技有限公司，批号：S84497）；RNA提取液、2×Uni⁃
versal Blue SYBR Green qPCR Master Mix、SweScript All-in-One First-Strand cDNA Synthsis SuperMix for qPCR One-Step gDNA Remover（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：G3013、G3326-01、G3337-100）；Nrf2、Keap1、HO-1一抗抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：16396-1-AP、10503-2-AP、10701-1-AP）。

1.4　实验仪器　RNA逆转录仪（美国Applied bio⁃systems公司）；实时荧光定量PCR仪（德国Leica公司）；倒置显微镜（日本Nikon公司）。

2　实验方法
2.1　造模、分组及干预　适应性喂养2周，随机以1∶1的比例将SD雌鼠和SD雄鼠合笼过夜，于次日早晨8时观察大鼠排泄物中是否有阴栓脱落，根据阴栓脱落情况确定妊娠大鼠共18只，按随机数字表法将受孕鼠分为空白对照组、模型组和治疗组，每组6只。

发现阴栓为妊娠第1天，治疗组于妊娠第1～11天按10 g/（kg·d）予泰山磐石散药液灌胃，空白对照组和模型组予等量生理盐水灌胃。

模型组和治疗组于妊娠第6～8天按1 mg/（kg·d）皮下注射溴隐亭溶液建立流产模型。

2.2　取材　分别于妊娠第12天腹腔注射20%乌拉坦进行麻醉，取子宫，将取下的子宫平均分为两份，一份放入4%多聚甲醛中固定，用于HE染色和免疫组化；另一份分离出蜕膜组织后，放入液氮中速冻，转-80 ℃冰箱保存，用于基因水平检测。

2.3　观察指标　2.
3.1　胚胎吸收情况　活的胚胎组织呈粉红色，吸收的胚胎组织呈现黑褐色且变小或消失。

计数胚胎吸收数和胚胎存活数，进而计算胚胎吸收率［7］。

胚胎吸收率＝胚胎吸收个数（死胎个数）/胚胎总数×100%
2.3.2　HE染色法观察大鼠母胎界面蜕膜组织形态学变化　将固定后的子宫进行脱水、包埋、切片，再对组织切片进行脱蜡、脱水等，在苏木素染液中浸染5 min，流水反蓝15 min，伊红染液浸染1 min，蒸馏水清洗1 min，再进行梯度脱水、透明、封片保存，在不同倍数的显微镜下观察并比较各组大鼠母胎界面蜕膜组织的形态学变化，每张切片随机选择不同视野进行拍照。

2.3.3　免疫组化法检测大鼠母胎界面蜕膜组织Ke⁃ap1、HO-1、Nrf2表达　将石蜡切片进行脱蜡处理，按照免疫组化试剂盒说明书步骤操作，然后采用DAB染色法进行显色，再用苏木素复染细胞核，脱水，透明，最后用中性树胶封片，用光学显微镜观察并拍照，用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0对图片进行分析，光密度平均值进行统计分析。

2.3.4　RT-PCR检测大鼠母胎界面蜕膜组织Keap1、HO-1、Nrf2基因水平　按照RNA提取试剂盒说明书，提取蜕膜组织总RNA，用超微分光光度仪测定RNA浓度及纯度，再根据逆转录试剂盒说明书操作，逆转录成cDNA。

反应体系：5×SweScript All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL、gDNA Remover 1 μL、Total RNA/mRNA 0.1 ng～5 μg/10 pg～0.5 μg、Nu⁃clease-Free Water加至20 μL。

反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，共循环40次。

以GAPDH为内参，各组mRNA的表达水平采用2-ΔΔCt方法计算。

引物由北京擎科生物科技有限公司设计合成，引物序列见表1。

2.4　统计学方法　采用SPSS 26.0统计软件对数据进行分析。

计量资料符合正态分布以（xˉ±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结　果
3.1　3组大鼠妊娠子宫形态和胚胎吸收情况　空白对照组大鼠胚胎呈淡粉色或红色，大小均一，呈串珠状，发育较好；模型组大鼠子宫内瘀血严重，胚
表1　引物序列
基因名称Keap1 Nrf2 HO-1 GAPDH
序列（5'-3'）
F：GCTCAACCGCTTGCTGTATG
R：TAATCATCCGCCACTCATTCCT
F：CGATTAGAGGCTCATCTCACAA
R：GTTGAATTGCTCCTTGGACATC
F：CTAAGACCGCCTTCCTGCTC
R：GCGGTGTCTGGGATGAACTA
F：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG
R：GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC
引物长度/bp
101
129
195
189
20
刘小倩等：基于Keap1/Nrf2/HO-1抗氧化信号通路探讨泰山磐石散对流产大鼠子宫蜕膜的影响第3 期
胎发育不良，颜色呈黑紫色，大小不一，部分胚胎体积明显减小；治疗组子宫内状态明显改善，见图1。

与空白对照组比较，模型组大鼠胚胎吸收率明显提高（P＜0.01）；与模型组比较，治疗组大鼠胚胎吸收率明显下降（P＜0.01）。

见表2。

3.2　3组大鼠母胎界面蜕膜组织病理学观察　空白对照组大鼠母胎界面蜕膜组织中血管丰富无扩张或少量扩张，蜕膜细胞排列整齐，结构清晰，细胞核呈卵圆形、蓝紫色，核仁明显，细胞质淡染且染色均匀；模型组大鼠母胎界面蜕膜组织中血管减少且扩张严重，细胞排列紊乱，细胞核形状不规则或消失，细胞质深染且染色不均；与模型组比较，治疗组大鼠母胎界面蜕膜组织中血管丰富，血管扩张得到改善，细胞排列相对整齐，细胞质的染色变淡，整体的组织形态得到改善。

见图2。

3.3　3组大鼠母胎界面蜕膜组织Keap1、Nrf2及HO-1蛋白表达比较　与空白对照组比较，模型组大鼠母胎界面蜕膜组织Keap1蛋白表达明显提高（P＜0.05），蜕膜细胞核内Nrf2和HO-1蛋白表达均明显降低（P＜0.01，P＜0.05），治疗组Nrf2蛋白表达明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组HO-1蛋白表达明显提高（P＜0.05）。

见图3、表3。

3.4　3组大鼠母胎界面蜕膜组织Keap1、Nrf2及HO-1基因水平比较　与空白对照组比较，模型组和治疗组大鼠蜕膜组织Keap1基因水平明显提高（P＜0.01），Nrf2和HO-1基因水平均明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，治疗组Keap1基因水平明显降低（P＜0.01），Nrf2、HO-1基因水平均明显提高（P＜0.01）。

见表4。

空白对照组
模型组
治疗组
图1　3组大鼠妊娠子宫形态图
表2　3组孕鼠胚胎吸收情况比较（xˉ±s）
组别
空白对照组
模型组
治疗组
n
6
6
6
胚胎总数/个
87
87
103
胚胎存活数/个
80
31
76
胚胎吸收数/个
7
56
27
胚胎吸收率/%
8.72±3.59
67.60±26.041）
25.86±6.831）2）注：与空白对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01。

治疗组空白对照组模型组治疗组
图2　3组大鼠蜕膜组织HE染色图（×200）
21
殷金可等：HPLC-ELSD法同时测定熊胆粉中4个胆汁酸成分含量第3 期
峰面积的RSD分别为1.3%、2.6%、2.9%和2.2%（n ＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4　重复性　取熊胆粉样品（编号S1）按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。

结果测定样品中牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸含量的RSD分别为0.9%、0.7%、1.4%和1.1%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.4.5　加样回收率　取熊胆粉样品（编号S1）6份，每份约12.5 mg，精密称定，分别精密加入牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸的对照品适量（加入各成分对照品的量与样品中相应成分含有量相当），按“2.3”项下方法平行制备，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算各成分的加样回收率及RSD。

结果见表2。

2.5　样品含量测定　取熊胆粉样品按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，根据回归方程计算样品中牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量，并以（xˉ±s）表示。

由表3可知，牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸平均含量分别为（34.82±0.18）%、（27.95±0.19）%、（1.23±
0.02）%、（3.77±0.06）%，其中熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸含量均＞28.0%，符合四川省、云南省等中药材标准要求［6-7］，且较其他3个成分含量最高；牛磺鹅去氧胆酸含量次之，鹅去氧胆酸和熊去氧胆酸含量最低，平均含量分别是牛磺熊去氧胆酸含量的1/9倍和1/28倍。

3　讨　论
比较不同流动相体系（甲醇-水、乙腈-水）的分离效果，选择柱压较低的乙腈-水体系。

由于牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸4个成分均显弱酸性，为保证拖尾因子满足定量分析要求，选择在流动相中加酸，改善被测成分的色谱保留行为。

实验中考察了不同浓度甲酸水溶液（0.05%、0.1%、0.2%）对色谱峰拖尾因子的影响，结果表明当甲酸水溶液浓度为0.1%时，4个成分色谱峰拖尾因子能较好满足定量要求。

表2　加样回收率试验结果（n＝6）
成分
牛磺熊去氧胆酸
牛磺鹅去氧胆酸
熊去氧胆酸鹅去氧胆酸取样量/mg
12.50
12.10
12.20
12.50
12.40
12.60
12.60
12.50
12.60
12.60
12.20
12.40
12.60
12.50
12.80
12.50
12.80
12.60
12.20
12.50
12.60
12.50
12.60
12.70
样品中含量/mg
4.39
4.25
4.29
4.39
4.36
4.43
3.68
3.65
3.68
3.68
3.56
3.62
0.17
0.16
0.17
0.16
0.17
0.17
0.51
0.53
0.53
0.53
0.53
0.54
加入量/mg
4.30
4.30
4.30
4.30
4.30
4.30
3.64
3.64
3.64
3.64
3.64
3.64
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.53
0.53
0.53
0.53
0.53
0.53
测得量/mg
8.72±0.13
8.43±0.12
8.46±0.10
8.69±0.12
8.50±0.15
8.79±0.04
7.34±0.06
7.26±0.05
7.33±0.11
7.32±0.10
7.13±0.11
7.25±0.08
0.33±0.01
0.33±0.01
0.34±0.02
0.33±0.02
0.34±0.01
0.33±0.01
1.06±0.01
1.04±0.01
1.05±0.01
1.04±0.01
1.05±0.02
1.06±0.02
回收率/%
100.63
97.23
97.15
100.07
96.36
101.46
103.26
101.53
103.06
102.13
96.18
95.01
97.70
95.58
101.73
96.10
101.47
99.89
96.90
98.35
100.46
98.41
100.81
103.23
平均回收率/%
98.8
99.7
98.9
98.7
RSD/%
2.2
0.9
1.9
2.3
29。