三孢布拉氏霉菌产类胡萝卜素发酵调控机理的研究

三孢布拉氏霉菌产类胡萝卜素发酵调控机理的研究三孢布拉氏霉菌是目前唯一实现工业化生产类胡萝卜素的高产菌株。

通过微生物发酵生产类胡萝卜素具有成本低、不受季节的限制、产品纯度高和无毒副作用等优势。

前人的研究结果表明,外源添加植物油能提高类胡萝卜素的产量,而且富含亚油酸和亚麻酸的植物油效果更显著。

实验结果证明与葵花籽油和大豆油相比,亚麻籽油对提高类胡萝卜素的产量具有更显著的效果。

但是亚麻籽油是如何促进三孢布拉氏霉菌产类胡萝卜素的机理不明。

而亚麻籽油富含α-亚麻酸(ALA),因此,选择了单一成分ALA,从代谢和转录水平上来研究它如何促进三孢布拉氏霉菌产类胡萝卜素。

利用GC-MS技术及和多维数据分析技术相结合的方法,研究了ALA的添加引起的三孢布拉氏霉菌胞内代谢物的变化。

通过偏最小二乘判别分析法(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)分析,发现可以将对照组和ALA 处理组区分开,并且使用了聚类分析进一步验证了PLS-DA分析结果的可靠性。

实验结果表明,在外源ALA存在的条件下,菌体优先利用外源的脂肪酸而不是从头合成脂肪酸,这表现为处理组菌体胞内亚麻酸和亚油酸的含量比对照组高很多,而他们的前体物质的含量与对照相比并无差异。

而脂肪酸和类胡萝卜素的合成具有相同的前体物质——乙酰辅酶A,这就使得更多的乙酰辅酶A用于类胡萝卜素的合成。

由于ALA的乳化作用,菌体形成了均匀分散的菌丝球,这样有利于溶氧的增加,进而促进菌体的生长和营养物质的吸收。

同时溶氧的增加也造成了氧化压力的增加,因此菌体为了维护自身的安全而合成更多的类胡萝卜素,这是类胡萝卜
素合成的外界刺激因素之一。

这一结论通过测定过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活力得到证实。

由于鉴定出的代谢物数量有限,再加上根据瞬时的物质变化很难推断代谢流的变化。

因此,利用RNA-seq技术从转录水平上,全局的观察基因转录水平的表达。

发现ALA添加后,脂肪酸合成的基因表达都显著下调,脂肪酸降解的基因表达上调。

还发现乙醛酸循环的两个关键酶异柠檬酸裂合酶和柠檬酸合酶的基因表达上调,以及糖异生途径的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因表达也上调,而糖酵解途径被抑制,这也解释了为何代谢组学方法测定的ALA处理后胞内葡萄糖含量积累。

ALA的添加也使麦角固醇的合成减少。

麦角固醇是类胡萝卜素合成途径的支路之一,也与类胡萝卜素竞争进入细胞膜,它的减少有利于类胡萝卜素合成的增加。

同时,还发现ALA显著促进八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶(carRA)和八氢番茄红素脱氢酶(carB)基因的表达,其次是促进牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因(carG)的表达。

此外,还发现了与类胡萝卜素合成有关的转录因子Mot3的转录明显上调。

Mot3是个多功能的调控因子,还具有抑制麦角固醇合成,抑制响应性激素的基因的表达。

Mot3在三孢布拉氏霉菌中的作用,需要后续实验验证。

一些转录因子的发现,表明ALA调控孢子的形成,菌丝及细胞壁的生成,细胞的分裂及性发育,如SteA。

SteA是否也参与调控类胡萝卜素的合成,需要进一步的验证。

此外,还发现了对过氧化氢及其敏感的转录因子Pap1和Prr1的表达上调,这说明氧化应激是类胡萝卜素合成增加的外界刺激因素之一。