Bispora sp. MEY-1来源的嗜酸海藻糖酶TreA酶学性质研究

中国农业科技导报，2021,23(4)：85-92
Journal of Agricultural Science and Technology
Bispora sp.MEY-1来源的嗜酸海藻糖酶TreA酶学性质研究
蒋肖，涂涛，王坤，彤丽格，罗会颖*
(中国农业科学院饲料研究所，农业农村部饲料生物技术重点实验室，北京100081)
摘要:酸性海藻糖酶作为生物催化剂在生物工业中广泛应用，挖掘酶学性质优良的酸性海藻糖基因具有重要意义。

从Bispora sp.MEY-1中成功克隆出一个酸性海藻糖酶基因7＞丛,并在毕赤酵母GS115中实现高效表达。

对纯化后的酸性海藻糖酶TreA进行酶学性质鉴定,其最适pH为4.0,在pH2.2-5.0范围内，该酶能够维持60%以上的酶活力。

TreA在偏酸条件下稳定效果比较好，在pH1.0-4.0条件下处理1h,可以剩余88%以上的酶活力。

TreA的最适温度为60咒，在40~70t之间都可以维持50%以上的酶活力，属于中高温酶。

重组海藻糖酶TreA的比活为1913U-mg_1，动力学参数心和卩昨分别为0.67mg-mL_1f[l119iJimol-min-1-mg-1。

同时,还评估了不同金属离子或化学试剂对纯海藻糖酶TreA的酶活性影响及其蛋白酶抗性。

极大丰富了海藻糖酶基因资源，促进了其在生物工业中的应用。

关键词:Bispora sp.MEY-1；酸性海藻糖酶;异源表达;酶学性质鉴定
doi：10.13304/j.nykjdb.2020.0452
中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1008-0864(2021)04-0085-08
Enzymatic Properties of an Acidic Trehalase
TreA from Bispora sp.MEY-1
JIANG Xiao,TU Tao,WANG Kun,TONG Lige,LUO Huiying
*
(Key Laboratory for Feed Biotechnology t Ministry of Agriculture and Rural Afiairs；Feed Research Institute,
Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing100081,China)
Abstract:As a biocatalystase,acid trehalase is widely used in biological industry.It is very important to exploit new acid trehalase with excellent enzymatic properties.In this study,an acid trehalase gene(TreA)from Bispora sp.
MEY-1was successfully cloned and expressed in Pichia pastoris GS115.The enzymatic properties of purified trehalase TreA were identified.The optimum pH was4.0,and the relative activity maintained over60%under the range of pH
2.2〜5.0.The relative activity of purified enzyme was more than88%after treated for1h under pH1.0〜4.0,which
exhibited the good acid stability.The optimum temperature of purified enzyme was60七,which was enzyme with medium-high temperature resistance.The specific activity of purified enzyme was1913U*m g_1,and its K m and V max were0.67mg•mL-1and119|JLmol•min-1*mg-1,respectively.Moreover,the effects of different mental ions or chemical reagents,and the protease resistances on the purified enzyme activity were also evaluated.
Key words:Bispora sp.MEY-1；acid trehalase；heterologous expression；characterization
海藻糖是一类非还原型二糖，由两个a-D-葡萄糖通过a-1,1-糖昔键连接而成,通常以二水化合物的形式存在，是所有糖中化学性最不活跃的糖⑴。

它广泛存在于细菌、真菌、昆虫、植物及藻类等生物体内，可以起到为生物体提供碳源,以及提高细胞耐受性的作用闵。

海藻糖酶(trehalase,EC3.2.1.28)可以将海藻糖水解产生两分子的葡萄糖。

海藻糖酶广泛存在于动物、植物和微生物体内，目前已经从多种生物体内分离出来了海藻糖酶基因。

根据氨基酸序列相似性、结构相似性等特点，海藻糖酶在碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes,CAZy)数
收稿日期：2020-05・25；接受日期：2020-09-14
基金项目:现代农业产业技术体系项目(CARS-41)o
联系方式:蒋肖E-mail:Jiangxiaol3126561698@；*通信作者罗会颖E-mail：luohuiying@
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据库中，被归类到糖昔水解酶(glucoside hydrolase, GH)第15、37和65家族3〕。

除了毕赤酵母通过海藻糖磷酸化酶分解海藻糖以外,其他真菌系统中都是通过海藻糖酶分解海藻糖,并且对海藻糖具有严格的底物专一性。

基于海藻糖酶的催化特点，海藻糖酶可以广泛应用于淀粉多糖制备、食品、临床医疗和害虫防治等生物工业中⑵5〕。

丁春磊国研究表明，在燃料乙醇生产过程中，添加海藻糖酶可有效提高乙醇的产率,改善酵母的健康状态，降低生产成本。

刘迎春等⑺对金龟子绿僵菌中的海藻糖酶ReATMlp进行酶学性质鉴定和基因敲除等研究,进一步证明了海藻糖酶在害虫生物防治中的应用价值。

韩隽等⑷研究表明，谷氨酸发酵生产的后期加入海藻糖酶可以提高糖酸转化率的效果,进而提高谷氨酸的生产量。

根据海藻糖酶酶促反应的最适pH不同，可以将真菌海藻糖酶分为酸性海藻糖酶和中性海藻糖酶⑼。

真菌中性海藻糖酶的最适pH为7.0,通常位于细胞胞质中,其酶活性受转录调控机制的影响;酸性海藻糖酶最适pH为3.5-6.0,是一种外分泌性糖蛋白,主要位于液泡、细胞壁或者分泌到胞外⑼。

除此之外，还有一种源于嗜热真菌的海藻糖酶，既具有酸性海藻糖酶最适pH反应条件的特点，又具备中性海藻糖酶可被Ca?+或Mn2+激活和被ATP抑制的特点3切。

目前，多种性质优良的糖昔水解酶基因资源被成功挖掘并报道,如最适pH为1.5的甘露聚糖酶网、最适pH为4.5的木聚糖酶⑴]和最适pH为5.0的葡聚糖酶3等,人们研究最为清晰的是酿酒酵母中的酸性海藻糖酶。

Bispora sp.MEY-1菌株为本实验室从酸矿中分离的一株嗜酸真菌，在pH2.5-3.0的环境中生长情况最好⑴I。

本研究从嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1中克隆了一个海藻糖酶基因TreA并在毕赤酵母GSU5中成功实现了异源表达,通过对其酶学性质进行鉴定分析，以期获得可以应用到工业生产的海藻糖酶，进而丰富海藻糖酶资源。

1材料与方法
1.1菌株、载体及试剂
Bispora sp.MEY-1菌株由本实验室分离，保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection?CGMCC),登记号为CGMCC250027o Bispora sp.MEY-1的活化和培养条件参照李弊青等方法。

基因克隆过程中间载体为PEASY-T3,克隆宿主为大肠杆菌感受态Escherichia coli Trans-Tl，均购自北京全式金生物技术有限公司。

海藻糖酶基因TreA外源表达用的载体为P PIC9,表达宿主为毕赤酵母GS115,均为本实验室保存。

试验中所用的总RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；反转录试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司；细菌质粒提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；限制性核酸内切酶EcoR I, Not I购自TaKaRa有限公司;高保真DNA聚合酶Fast pfu DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司;其他试剂，如甲醇、乙醇和乙酸等试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2培养基
试验中所用到的培养基有马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)、马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)、LB液体培养基、LB固体培养基、MD培养基、YPD培养基、BMMY及BMGY培养基，其详细配制参照李晓丽等「阁方法;海藻糖酶酶活性测定所用的DNS试剂配制参照李弊青等”]方法。

1.3海藻糖酶基因Tre4序列分析
根据嗜酸菌株励;pora sp.MEY-1的全基因组序列测序结果，查找到一个新的海藻糖酶基因7＞丛,并对其进行生物信息学分析。

首先,将序列提交给在线网站Softberry(http://linuxl.softberry. com/berry.phtml)预测基因的内含子和外显子, SignalP 4.1Server(http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)预测编码蛋白质信号肽的序列。

然后利用Vector Nil Advance10.0软件将基因翻译为氨基酸序列后,分析其氨基酸序列的长度、蛋白质理论分子质量。

最后，将氨基酸序列提交到Expasy.PI(https://web. /compute_ pi/)预测新海藻糖酶TreA的等电点。

1.4海藻糖酶基因TreA克隆与毕赤酵母重组载
体构建
将嗜酸菌株Bispora sp.MEY-1在PDB培养基、30覽培养条件下活化48h后,转接到以海藻
4期蒋肖等:Bispora sp.MEY-1来源的嗜酸海藻糖酶TreA酶学性质研究87
糖为唯一碳源的诱导培养基中，于30七、210 r-min-1震荡培养2~3d,12000r•min7离心10 min收集菌体。

根据真菌总RNA提取试剂盒说明书提取菌体的总RNA,然后再利用反转录试剂盒Rever Tra Ace-a-TM kit将RNA反转录为cDNA o根据去除信号肽序列的全长基因设计引物(F：5'GCT GAATTCTACGTAGAATTCAAGA-TATATTCGACT-3,；R：5，-CGAATTAATT CGC-CGGCGGCTCAAATAACCAAGG-3，)(横线标注分别为限制性酶切位点EcoR I和Not I)，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。

扩增产物经EcoR I和Not I双酶切，利用T4DNA连接酶将其连入载体PPIC9后热击转化Trans-Tl大肠杆菌感受态,挑取阳性克隆子送测序公司测序,测序正确的重组载体命名为P PIC9-rreA o
1.5海藻糖酶TreA在毕赤酵母中的表达及纯化
利用质粒小提试剂盒提取测序正确的P PIC9-TreA质粒,限制性内切酶BgZ H将其线性化后，回收产物电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞。

然后将转化子涂布于MD平板，在30七培养箱中静置培养48h后挑取48个克隆子于含有3 mL BMGY培养基的离心管中震荡培养(30°C, 220r-min-1)；培养48h后,4500r•min-1离心5 min,将菌体重悬于1mL含有0.5%甲醇的BMMY 培养基中诱导培养48h o最后，通过酶活性测定获得阳性克隆子进行摇瓶放大培养。

将筛选的阳性克隆子在YPD培养基中活化培养72h,按1%的接种量接种于400mL BMGY 培养基震荡培养48h后,4500r-min-1离心5min 收集菌体转入200mL BMMY培养基中诱导培养48h,每隔24h补加0.5%甲醇。

诱导培养结束后，12000r•min-1离心5min 收集发酵液。

将200mL发酵液经10kD膜包(Vivascience,Germany)浓缩至15mL后,发酵液于pH7.0、10mmol•L-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中过夜透析。

然后，将透析过的酶液通过阴离子纯化柱(HiTrap Q HP)进行纯化，收集不同浓度盐离子洗脱下来的蛋白，并通过SDS-PAGE分析确定纯化的单一条带。

1.6海藻糖酶TreA酶活性测定
海藻糖酶的酶活性测定采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法检测还原糖生成量进行活性分析。

具体方法如下：在pH4.0,60条件下，1mL的反应体系包括100 |±L酶液和900p,L1%的海藻糖底物，反应10 min,加入1.5mL DNS终止反应后沸水煮5min, 540nm下测定0D值。

对照组先加终止液，再加酶液。

每组三个平行，一个对照。

海藻糖酶活性单位定义:在pH4.0,60P条件下,每分钟分解海藻糖生成1jxmol还原糖所需要的酶量为1个活性单位(U)。

1.7海藻糖酶TreA酶学性质测定
测定海藻糖酶最适pH时，将纯化的海藻糖酶TreA分别置于60七，不同pH(1.0~12.0,其中pH1.0~3.0是0.1mol-L-1甘氨酸-HC1缓冲液; pH3.0~9.0是0.1mol磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液;pH9.0-12.0>0.1mol-L_1NaOH-甘氨酸缓冲液)底物条件下进行酶促反应。

测定海藻糖酶TreA的pH稳定性时,纯海藻糖酶TreA酶液在不同pH1.0~12.0缓冲液稀释后置于37°C恒温水浴锅中处理1h,然后在pH4.0,60七条件下测定其相对剩余酶活，未进行处理酶活为100%对照。

测定海藻糖酶的最适温度时，纯化的海藻糖酶TreA分别在20-90°C范围内，pH4.0条件下进行酶促反应。

测定海藻糖酶TreA的热稳定性时，纯化的海藻糖酶TreA分别在60,65和70七恒温水浴锅中分别处理0、2、5、10、15、20、30和60min后，在pH4.0,60°C条件下测定其剩余酶活力,未进行处理的酶活为100%对照。

分别利用pH4.0、0.1mol-L"磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制不同浓度(0.5~10mg•mL-1)的海藻糖作为反应底物。

将纯化的海藻糖酶TreA 稀释至合适的浓度分别在不同浓度的底物中反应5min(pH4.0,60P),测定其酶活性。

将测定的酶活数据利用GraphPad Prism5.01软件分析，获得海藻糖酶TreA的人和K mO
1.8不同金属离子或化学试剂对酶活力的影响
在海藻糖底物中分别添加NaCl、LiCl、KCl、AgNOs、HgCl2,MgCl?、MnC—Pb(CH3COO)2, NiC—ZnC—C0CI2、CuC—CaC—CrC—FeC—SDS、EDTA,和B-疏基乙醇共18种物质，使其终
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浓度为5和lOmmol-L^然后，在pH4.0,60X.条件下分别测定海藻糖酶在不同底物中的剩余酶活力。

以未添加任何物质的反应体系为对照组,计算处理后海藻糖酶TreA的相对剩余酶活，评估各种金属离子和化学试剂对海藻糖酶TreA酶活力的影响，每组反应设计三个重复。

1.9海藻糖酶TreA的蛋白酶抗性评估
在纯化的海藻糖酶TreA中分别添加胰蛋白酶、蛋白酶K、胶原蛋白酶、糜蛋白酶、枯草蛋白酶和胃蛋白酶,使其终浓度为0.1然后将其置于37°C恒温水浴锅中分别处理0、30和60 min o在pH4.0.60X条件下测定其相对剩余酶活,以未添加蛋白酶的反应体系为对照组,来评估海藻糖酶TreA的蛋白酶抗性。

1.10数据分析
采用Excel2018和Origin2017对测定的数据进行处理、计算和差异性分析。

2结果与分析
2.1海藻糖酶基因的克隆与序列分析
从嗜酸菌株及密sp.MEY-1的基因组中克隆海藻糖酶基因7W,其cDNA全长序列为3075 bp,可以翻译编码1024个氨基酸。

其编码的氨基酸序列经在线网站进行信号駄预测，结果表明N端的前21个氨基酸为信号肽序列。

TreA成熟蛋白的理论分子质量为109.6kD,等电点为4.5,属于糖昔水解酶32家族。

海藻糖酶TreA的氨基酸序列经在线网站（http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetNGlye/）预测，结果显示其蛋白质表面共有7个潜在M糖基化位点,分别为Asnll7、Asnl54A Asnl77A Asn217、Aan274、Asn289和 Asn564o在氨基酸组成方面，酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）占9.28%；碱性氨基酸（赖氨酸和精氨酸）占4.88%；极性氨基酸（天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸）占34.67%；疏水氨基酸（丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缄氨酸）占34.47%o将TreA 的氨基酸序列在NCBI数据库中进行序列比对,该基因与Baudoinia panamericana来源的海藻糖酶序列最为相似,序列一致性为68.9%,显示了海藻糖酶基因TreA的新颖性。

2.2海篠糖酶TreA重组载体的表达和纯化结果
重组表达载体P PIC9-TreA在毕赤酵母GS1115中成功表达,将筛选的阳性克隆子进行摇瓶表达，获得的发酵液进行后续的纯化处理。

粗酶液经浓缩、阴离子纯化柱纯化等一系列处理后,获得单一纯化峰，并将浓缩液、纯化液及Endo H 处理的纯蛋白分别进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。

结果显示,TreA的目的条带大小为135kD 左右（图1）,经Endo H脱糖基处理后目的条带降为110kD左右，与理论分子质量一致。

200
kD“123
注:MF准蛋白样品的特定理论分子质量；1-浓缩后TreA；2—纯化后的TieA；3—End®H处理的TreA o
Note：M—Molecular weight standard；1—concentrated TreA with ultrafiltration membrane；2—Purified TreA；3——Purified TreA with Endo H.
图1TeA的SDS-PAGE凝胶电泳分析
Fig»l SDS-PAGE analysis of purified recombinant TreA 2.3海藻糖酶TreA的酶学性质分析
测定重组海藻糖酶TreA在不同pH缓冲液、50花条件下的酶活性，结果表明,TreA的最适pH 为4.0,在pH2.2-5.0范围内，该酶能够维持其60%以上的酶活力，是一种酸性海藻糖酶（图2A）。

TreA在极酸条件下（pH1.0~3.0）可维持100%的剩余酶活性,pH4.0~7.0可维持100%的剩余酶活性，随着pH条件向碱性方向移动，其稳定性逐渐减弱（图2B）O TreA的最适温度为60£,在40~70弋之间都可以剩余50%以上的酶活力（图2C）,属于中高温酶。

分析TreA的热稳定性，在60和65%：下分别处理60min,测定处理后酶液的剩余酶活分别为85%和70%,在70%
：
4期蒋肖^.Bispora sp. MEY-1来源的嗜酸海藻糖酶TreA 酶学性质研究89
进盘A
-g 0
上爲«叱
110.0100.0
90.080.070.060.050.040.0
30.020.0
10.00.0
100.0
90.0
80.070.060.0
50.040.0
30,020.010.0
0.0
A ：最适pH ；
B ：pH 稳定性；
C ：最适温度;
D :温度稳定性
L0 2.0
3.0
4,0 5.0 6.0 7.0
r pH
20
30
40 50 60 70 SO 90
温度 Temperature/T^
A ： Effect of pH on enzyme activities ；
B ： pH stabilities ；
C ： Effect of temperature on enzyme activities ；
D ： Thermostability
图2重组海蕩糖酶TreA 的基本酶学性质
Fig>2 Characterization of purifird recombinant TreA
下处理30 min,依然能够保持40%的酶活力 （图2D ）。

以1%海藻糖为底物，在最适条件（pH 4.0、 60七）下，重组海藻糖酶MA 的比活为1 913 U-mg-1,动力学参数心和乙分别为0.67 mg«mL _I ^n 119 [xmol • min -1 • mg -1 o
2.4金属离子及化学试剂海煎糖酶TreA 的影响
18种金属离子和化学试剂对重组海藻糖酶 TreA 酶活性的影响如表1所示。

当化学物质浓
度为5 mmobrnL -1时,Fe"*、Mn"、Pb2*和疏基乙醇 对海藻糖酶起激活作用;SDS 、Ag+和Hg2+对海藻 糖酶具有抑制作用；Ag+、Na+、K+、Ca2+、SDS 和
Hg"均对海藻糖酶TreA 的酸活性具有抑制作用。

浓度为10 mmoXmL"时抑制效果较5 mmol • mL _I 时更强，其中对海藻糖酶TreA 酶活性影响最大的 为Ag+,经5 mmol ・mL7离子处理后其相对剩余酶
活性降为43.5%,经10 mmol"niLri 处理后几乎没
有酶活性。

Co 2\Fe 3+和0■蔬基乙醇可显著提高
海藻糖酶TreA 的酶活性，Cc^、F 評浓度为5 mmdbmLTi 时提高海藻糖酶TreA 酶活性效果更
加明显,卜藐基乙醇浓度为10 mmol • mL-i 时提高 海藻糖酶TreA 酶活性效果更加明显。

2.5海藻糖酶TreA 对蛋白酶的抗性
测定纯海藻糖酶TreA 在含有0.1 mgml/1缓
冲液中处理后的相对剩余酶活，如图3所示，海蘸
糖酶TreA 对胰蛋白酶、胶原蛋白酶和胃蛋白酶具 有非常好的蛋白酶抗性,几乎没有酶活性的损失。

然而,海藻糖酶TreA 对蛋白酶K 和糜蛋白酶的 蛋白酶抗性较差，并且随着在蛋白酶中处理的时 间越长，酶活性损失越严重:海藻糖酶TreA 在0.1
mg ・inL7蛋白酶K 和糜蛋白酶中处理30 min 后, 相对剩余酶活分别为80% .40%;处理60 min 后 相对剩余酶活分别为60%、20%。

另外，枯草蛋白
酶对海藻糖酶TreA 的酶活性也有轻微的抑制 作用。

90中国农业科技导报23卷
表1不同金属离子及化学试剂下纯化重组
海藻糖酶TreA®性
Table1Activities of TreA under different concentration
of metal ions and chemical reagents
金属离子或
化尊剂Ions or chemicals
TreA相对剩余酶活性
Activity of TreA/%
5mmol-L"110mmol-L"1
CK100.0±1.6100±0.4
Na
*98.2±1.196.2±1.2"
k+99.8±2.497.1+0.6
**
Ca i+9&6±2.196.3±1.6
*
Li+106.1±1.692.7±2.0"
CO2*122.0±1.5112.1土1.2
*
Cr3+104.8±0.492.0±1.6
**
Ni+99.6±1.9101.6土1.7
*
Cu2+96.3±0.6109.8±1.9M
Mg2+101.6±2.398.9+1.5"
Fe3+109.7±1.8104.5土1.2
*
Mn2+160.7±1.285.1±2.5"
Zn2+100.9±0.71O4.6±1.3
**
Pb+104.1±1.596.1土1.8"
SDS71.2±1.476.2土2.4"
Ag
*43.5土0.40“
Hg2+79.3±1.20”
EDTA93.9+1.390.8+1.3"
藐基乙醇
P-mercaptoethanol
128.7±1.1132.1±1.5"
注：床和和分别表示与5mmol-L"1处理相比在P<0-05和P <0.01水平差异显著。

Nate：*and**indicate significant difference at P<0.05and P< 0.01levels compared with5mniobL-1treatment,respectively・
3讨论
海藻糖酶作为一种常见的生物催化剂，在生物工业中的应用通常需要在酸性条件下进行，因此挖掘具有嗜酸特性的海藻糖酶基因具有重要意义。

在本研究中，通过基因工程技术从嗜酸真菌Bispora sp.-MEY-1中成功克隆了一种酸性、耐中高温的海藻糖酶TreA,其最适pH为4.0,在pH2.2-5.0范围内，可维持60%以上的剩余酶活力;在pH1.0~9.0条件下处理1h,可以维持79%以上的剩余酶活力，在最适pH和pH稳定性上具有明显的优势。

目前已有多种真菌来源的酸性海
□0min■30min□60min
注:A-胰蛋白酶;B—蛋白酶K；C-胶原蛋白酶;D-糜蛋白酶; E—枯草蛋白W;F—胃蛋白酶。

*和**分别表示在P<0.05和P<0.01水平具有显著性。

Note：A—Trypsin；B—Proteinase K；C—ollagenase;D—Chymotrypsin；E—Subtilase；F—Pepsase.*and**indicate significant difference at P<0<05and PvO.Ol levels,respectively.
图3蛋白酶对纯化富组海藻糖酶TreA的活性影响Fig>3Effect of protease on enzyme activities of
recombinant TreA
藻糖酶基因被报道，刘迎春W利用RT-PCR、RACE等方法成功地克隆了金龟子绿僵菌的酸性海藻糖酶基因；酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae^19^、白色念珠菌Candida albicans^、构巢曲霉心pe闍泓nidulans^中也分离鉴定出酸性海藻糖酶基因。

此外，在NCBI数据库中还报道了另外两种丝状真菌烟曲霉Aspergillus Jumigatus和埃默森篮状菌Talaromyces emrsonii来源的酸性海藻糖酶疑似基因序列⑺，阴pom S p.-MEY-1来源的酸性海藻糖酶基因TreA与上述几种来源的海藻糖酶基因的同源性在25%~50%之间。

上述真菌来源的酸性海藻糖酶中，已有酶学性质报道的为来源于金龟子绿僵菌的海藻糖酶ReATMlp,NCBI登录号为EF190950,与本研究中的酸性海藻糖酶TreA的序列一致性为47.8%o ReATMlp的最适pH为6.0,在pH4.5~7.5范围内具有较高的酶活力，但是当反应体系pH超过7.5时，酶活力迅速下降。

与本研究中的酸性海藻糖酶TreA的最适pH和pH稳定性相比, ReATMlp的酸适应性明显较差⑺o Enfert等⑵〕发现,为减少酸性条件下正电荷的积累,许多嗜酸蛋白表面进化出大量酸性氨基酸残基。

但是，已有晶体报道的海藻糖酶与本研究的酸性海藻糖酶TreA序列一致性最高的仅为22%,不满足同源建
4期蒋肖等:Bispora sp.MEY-1来源的嗜酸海藻糖酶TreA酶学性质研究91
模的条件，无法实现TreA三维结构的可视化分析。

分析TreA和ReATMlp的一级结构时，发现TreA的氨基酸序列中酸性氨基酸(天冬氨酸Asp 和谷氨酸Glu)占9.28%,ReATMlp的氨基酸序列中酸性氨基酸占&4%。

因此，推测可能是TreA 中酸性氨基酸的比例明显高于ReATMlp,导致TreA的酸适应性明显高于ReATMlp o
酸性海藻糖酶在酵母中以_种单体形式发挥活性，在构巢曲霉4.nidulans中以二聚体形式发挥酶活性。

酸性海藻糖酶7^的范围为0.8-5 mg-mL_1[19]，本研究中的酸性海藻酶TreA的K m 为0.67mg-mL'1,对海藻糖的底物特异性极强。

酸性海藻糖酶另一特点是具有大量潜在的M糖基化位点，这也解释了TreA纯化蛋白经EndoH 脱糖基处理后在SDS凝胶条带变小的原因"如。

此外，分析酸性海藻糖酶TreA的氨基酸序列,发现其N端1~18位的短肽为信号肽，这进一步验证了酸性海藻糖酶可通过分泌途径的靶向转运，解释了这类蛋白定位于细胞表面的原因也]。

综上所述，本研究成功获得了一个新颖的酸性海藻糖酶基因乃丛,并在毕赤酵母中实现了高效表达。

该酸性海藻糖酶具有良好的酸适应性,同时对海藻糖有专一、较好的水解活力。

这些特点表明酸性海藻糖酶TreA在生物工业中具有极大的应用价值。

参考文献
[1]PAIVA C L,PANEK A D.Biotechnological applications of the
disaccharide trehalose[J].Biotechnol.Annu.Rev.,1996,2:
293-314.
[2]LUC P J,MATTHIEU J,GEMMA B,et al..Acid trehalase in
yeasts and filamentous fungi：localization,regulation and physiological function[J].FEMS Yeast Res.,2010,5:503
-511.
[3]NICOLAS T,VINCENT L,ELODIE D.The CAZy Database/
the Carbohydrate-Active Enzyme(CAZy)Database:Principles and Usage Guidelines.A Practical Guide to Using Glycomics Databases[Z].2017.
[4]CONSORTIUM T C.Ten years of CAZypedia:a living
encyclopedia of carbohydrate-active enzymes[J].
Glycobiology,2018,28(1)：3-&
[5]丁春磊.不同质量木薯原料发酵酒精的生产研究[J].广西
轻工业，2014,30(4)：19-22.
DING C L.Study on the production of fermented alcohol from cassava with different qualities[J].Guangxi J.Light Ind.,
2014,30(4):19-22.
[6]谭海刚，董健，王光路，等.中性海藻糖酶基因缺失对面包酵
母耐冷冻性的影响[J].现代食品科技,2014,30(2):66 -71.
TAN H G,DONG J,WANG G L,et al..Effect of neutral trehalase genes deletion on the Freeze-tolerant characteristics of bread yeast[J].Modem Food Sci.Technol.,2014,30(2)：66 -71.
[7]刘迎春.金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶的功能研究[J].重庆
大学,2008,42(6)：478-481.
LIU Y C.Characterization of the acid trehalase gene in Metarhizium Anisopliae[J].J.Chongqing Univ.,2008,42
(6)：478-481.
[8]韩隽,姬慧军.海藻糖酶在谷氨酸发酵中的应用[J].广州化
工，2017,45(7)：73-74.
HAN J,JI H J.Application of trehalase in glutamic acid fermentation[J].Guangzhou Chem.Ind.Technol.,2017,45
(7)：73-74.
[9]RICHARDS A B,KRAKOWKA S,DEXTER L B.Trehalose：
a review of properties,history of use and human tolerance,and
results of multiple safety studies[J].Food Chem.Toxicol.,
2002,40(7)：871-898.
[10]SCHICK I,HALTRICH D,KULBE K D.Trehalose
phosphorylase from Pichia fermentans and its role in the metabolism of trehalose[J].Appl.Microbiol.Biot.,1995,
43：1088-1095.
[11]JORGE J A,LOURDES T M,THEVELEIN J M,et al..
Trehalases and trehalose hydrolysis in fungi[J].F.Microbiol.
Lett.,1997,154(2)：165-171.
[12]GUO Y,TU T,ZHENG J,et al..Improvement of BsAPA
aspartic protease thermostability via autocatalysis-resistant mutation[J].J.Agric.Food Chem.,2019,67(37):10505 -10512.
[13]THEVELEIN J M.Regulation of trehalose mobilization in fungi
[J].Microbiol.Rev.,1984,48(1)：42-59.
[14]LUO H,LI J,YANG J,et al..A thermophilic and acid stable
family-10xylanase from the acidophilic fungus Bispora sp.
MEY-1[J].Extremophiles,2009,13(5)：849-857. [15]LUO H,WANG Y,WANG H,et al..A novel highly acidic0-
mannanase from the acidophilic fungus Bispora sp.MEY-1:
gene cloning and overexpression in pichia pastoris[J].Appl.
Microbiol.Biotechnol.,2009,82(3):453-461.
[16]LUO H,YANG J,YANG P,et al..Gene cloning and
expression of a new acidic family7endo-|3-l,3-1,4-glucanase from the acidophilic fungus Bispora sp.MEY-1[J].Appl.
Microbiol.Biotechnol.,2010,85(4)：1015-1023.
[17]李悴青，涂涛，姚斌，等.Bispora sp.MEY-1来源的新型嗜热
多聚半乳糖醛酸酶的酶学性质研究及其应用评估[J].中国农业科技导报，2017,19(10)-36-44.
LI Y Q,TU T,YAO B,et al..Heterologous expression and characterization of an acidic thermophilic polygalacturonase form Bispora sp.MEY-1with application potenti al for juice clarification[J].J.Agric.Sci.Technol.,2017,19(10)：36 -44.
[18]李晓丽，涂涛，姚斌.嗜热子囊菌JCM12803来源的双功能木
聚糖/纤维素酶[J].生物工程学报，2018,34(12):131
-141.
92中国农业科技导报23卷
LI X L,TU T,YAO B.A novel bifunctional xylanase/cellulose TcXynlOA from Thermoascus crutaceus JCM12803[J].Chin.
J.Biotechnol.,2018,34(12)：131-141.
[19]DESTRULLE M,HOLZER H,KUONSKY D J.Isolation and
characterization of a novel yeast gene,ATH1,that is required for vacuolar acid trehalase activity[J].Yeast,1995,11(11):
1015-1025.
[20]PEDRENO Y,MAICAS S,ARGUELLES J C,et al..The
ATC1gene encodes a cellwall-linked acid trehalase required for growth on trehalose in Candidaalbicans[J].J.Biol.Chem.,
2004,279(39):40852-40860.
[21]ENFERT C,FONTAINE T.Molecular characterization of the
Aspergillus nidulans treA gene encoding an acid trehalase required for growth on trehalose[J].Mol.microbiol.,1997,
24(1):203-216.
[22]LIU Z,ZHAO H,HAN L,et al..Improvement of the acid
resistance,catalytic efficiency,and thermostability of nattokinase by multisite-directed mutagenesis[J].Biotechnol.
Bioeng.,2019,116(8)：1833-1843.
[23]PEDRENO Y,MAICAS S,ARGUELLES J C,et al..The
ACT1gene encodes a cellwall linked acid trehalase required for growth on trehalose in Candida albicans[J].J.Biol.Chem.,
2004,279(39):40852-40860.
(责任编辑：温小杰)。