(生物科技行业)病原生物学实习指导

（生物科技行业）病原生物学实习指导
病原生物学实习指导
主编刘兵史俊岩
主审周正任罗恩杰
编者刘兵王舰
史俊岩郑兰艳王雪莲
中国医科大学病原生物学教研室
2004年7月
前言
根据国务院学位委员会的指示，将原医学微生物学与人体寄生虫学学科合并为病原生物学学科。

国内多所医学院校先后都做了相应的调整，成立与组建病原生物学教研室，并将二门课合并，开设病原生物学课。

按教育部的意见，新一轮教学改革最终要落实到培养适应新世纪需要的创建型、协作型、复合型人才，拓宽知识面。

因此，我们联合大连医科大学、锦州医学院、沈阳医学院等四所院校编写了病原生物学教材，该教材将医学教育中《医学微生物学》、《人体寄生虫学》，感染性疾病和传染性疾病中病原学诊断及特异性防治部分整合在一起，适合培养创新性、开拓型人才。

适合培养目标的需要。

该教材已经通过教育部高等教育司的审批，被列为“面向二十一世纪课程教材”，由科学出版社出版，面向全国发行。

为配合病原生物学教材的使用，我们特地编写了《病原生物学实习指导》，供本科大学生学习病原生物学实验课之用。

本教材由医学微生物学实习指导和人体寄生虫学实习指导两部分组成，通过实习课教学使学生了解和掌握《病原生物学》的基本实验技能操作和基本研究方法，同时也能获取相应的感性知识。

为培养学生的思维能力和独立操作能力，在进行设计性实验课教学时，学生也能利用本实习指导作为工具，顺利地进行实验操作，以节省学生获取知识的时间。

为此目的，对每项实验的目的及实际意义都有所交代，对实验结果的观察与分析，也予以必要的辅导。

限于教学时数和条件，有些内容将以示教、电视或电影教学方式教学，这部分尤其需要加强复习，以弥补未能亲自操作之不足。

有关实验课的改革设想，仍须不断地接受实践考验，发扬成绩克服缺点，以不断地充实和提高。

本实习指导由刘兵主编，全体实验课教师参加编写，周正任、罗恩杰教授全面审定，我们认为本实习指导符合教学实际，但仍难免有不当之处，欢迎予以批评指正。

中国医科大学病原生物学教研室
2004年7月
目录
实习目的与要求 (1)
实验室规则 (1)
显微镜的使用方法 (2)
常用标本及观察方法 (3)
绘图法 (3)
第一篇医学微生物学实验 (4)
第一章细菌形态学检查法 (4)
实验 1 不染色标本的观察…………………………………………………４
2 革兰氏染色法 (5)
3 荚膜染色法 (8)
4 鞭毛染色法 (9)
5 芽胞染色法 (10)
第二章细菌培养实验 (11)
实验 1 常用培养基制备 (11)
2细菌分离培养与纯培养 (12)
3细菌生化反应检查法 (16)
4细菌内毒素的检测（鲎试验） (19)
第三章消毒灭菌和药物敏感性实验 (20)
实验 1 常用消毒灭菌除菌器的使用 (20)
2细菌的药物敏感性试验 (22)
第四章化脓性球菌的病原学检测 (28)
实验 1 化脓性球菌的病原学检测程序 (28)
2细菌血浆凝固酶试验 (30)
3细菌的触酶试验 (31)
4细菌耐热核酸酶试验 (31)
5肺炎球菌对小白鼠的传染试验 (32)
6抗链球菌溶血素“O”试验 (33)
第五章肠道杆菌病原学检测 (35)
实验 1 常用培养基制备 (35)
2病原性肠道杆菌的分离与鉴定方法 (37)
3肥达氏反应 (40)
第六章厌氧性细菌实验 (43)
实验 1 厌氧培养法 (43)
2破伤风毒素抗毒素中和试验 (44)
3产气荚膜杆菌实验 (45)
第七章结核杆菌、白喉杆菌实验 (46)
实验 1 抗酸染色法 (46)
2结核杆菌培养实验 (47)
3白喉杆菌奈瑟氏染色实验 (48)
第八章真菌及其他微生物实验 (49)
实验 1 支原体培养实验 (49)
2真菌培养实验 (49)
3钩端螺旋体培养实验 (53)
4放线菌的硫磺颗粒检查法 (54)
第九章病毒学实验 (56)
实验 1 电子显微镜下病毒形态观察 (56)
2 病毒培养法 (57)
3 细胞病变观察及病毒量测定 (63)
4 流感病毒的血凝与血凝抑制试验 (65)
5 乙型肝炎病毒的血清学检测法 (67)
第十章微生物学分子生物学技术 (72)
实验 1 质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳 (72)
2 DNA的限制性内切酶酶切实验和连接实验 (74)
3 耐药质粒DNA转化实验 (75)
4 PCR方法检测病原微生物 (76)
5 核酸杂交法检测病原微生物 (77)
第二篇人体寄生虫学实验 (81)
第十一章线虫实验 (81)
实验 1 似蚓蛔线虫 (81)
2 蠕形住肠线虫 (83)
3 毛首鞭形线虫 (84)
4 十二指肠钩口线虫、美洲板口线虫 (85)
5 旋毛形线虫 (88)
6 班氏吴策线虫、马来布鲁线虫 (88)
7美丽筒线虫、结膜吸吮线虫 (90)
8猪巨吻棘头虫 (90)
第十二章绦虫实验 (92)
实验 1 肥胖带吻绦虫、链状带绦虫 (92)
2 细粒棘球绦虫 (95)
3 微小膜壳绦虫 (97)
4 曼氏迭宫绦虫 (98)
第十三章吸虫实验 (100)
实验 1 华支睾吸虫 (100)
2 卫氏并殖吸虫 (102)
3 斯氏狸殖吸虫 (105)
4 日本裂体吸虫 (106)
5 布氏姜片吸虫 (108)
6 肝片形吸虫 (110)
第十四章原虫实验 (111)
实验 1 溶组织内阿米巴原虫、结肠内阿米巴原虫 (111)
2 杜氏利什曼原虫 (114)
3 阴道毛滴虫 (115)
4 兰氏贾弟鞭毛虫 (116)
5 间日疟原虫、恶性疟原虫 (117)
6 薄血膜的制作与染色、观察柏氏疟原虫 (119)
7 刚地弓形虫 (120)
8 卡氏肺孢子虫 (121)
实验目的和要求
【目的】
1．掌握病原生物学的基本实验方法和操作技术。

2．通过实验设计的讨论和实验结果分析，培养学生科学思维方法，提高独立工作能力。

【要求】
1．每次实习前必须做好预习，明确实验目的、原理、方法及操作中的注意事项等，避免和减少发生错误。

2．实验过程中必须持严肃认真的态度。

3．对实验结果必须进行仔细地观察和认真地记录，然后进行科学分析，得出恰当结论。

4．独立认真完成实验报告，书写实验报告要字迹清楚，语言简练，表格清晰，画图应力求反映实际标本的原状。

5．切实遵守实验室规则。

实验室规则
1．上实验课时，先到更衣室把个人的书包和衣物放在衣柜内，穿好白衣（实验防护衣）和拖鞋。

随身只带必要的实习指导、笔记本和文具，进入实验室后放入抽屉内。

2．实验室要保持肃静和秩序，不得高声谈笑和随处走动。

3．实验室内禁止饮食和吸烟，不得用嘴舔湿铅笔和标签等。

4．如遇有盛检验材料的器皿破损或污染其它物品时，应即用3%的来苏儿消毒；皮肤破伤须向指导教师报告，采取适当的消毒及防止感染措施。

5．用过的有菌器材或培养物等，应放于指定的地点，不得随意抛置。

6．注意节约实验试剂，爱护实验器材。

损坏器材时，应立即报告指导教师，听候处理。

7．易燃物品（酒精、二甲苯等）不准接近火源。

一旦起火，应迅速用沾水的布类和沙土覆盖扑火。

8．实验结束后，将实验台整理好，值日同学打扫室内卫生，并检查水、电、煤气等开关是否关好，防止发生安全事故。

9．离开实验室后，到更衣室脱下白大衣，将白衣和拖鞋整齐放入柜内，
洗手消毒后离去。

显微镜的使用方法
【目的】
要求熟练掌握显微镜的使用方法，尤其是油浸镜的使用方法。

【要求】
1．使用前必须对所用显微镜进行详细检查，如发现问题应及时向老师报告。

2．调光：检查未染色标本时，以弱光线为宜，此时可将集光器下降或缩小光栅，检查染色标本时，以光线强为宜，此时应适当升高集光器或将光栅打开。

3．标本观察：将标本置于载物台上，先用低倍镜观察。

用粗螺旋调至看出物象后，再调节微螺旋，使物像更加清晰。

在换高倍镜观察前，鉴于高倍镜视野范围比低倍镜小，故须将被观察内容移至视野中央后再换之。

有时显微镜本身存在偏心现象，此时要记住其偏心的方向和距离。

用油浸镜观察前，应先转开低倍镜或高倍镜镜头，在玻片上加一滴镜油，再转换油镜头。

眼从侧方看，调节粗螺旋，使镜头浸入镜油中至接近玻片时为止（注意勿压碎玻片）。

眼看目镜，调节粗螺旋提升镜筒，至看到物象，再调节细螺旋，至可清楚看到标本为止。

观察完毕，应先提高镜筒，并将高倍镜（或油浸镜）头扭向一侧，再取下玻片。

※寄生虫标本绝大多数为封片标本，有一定厚度，因此在观察时应不断调节细螺旋。

※用油浸镜观察微生物标本时，应将显微镜亮度开关调至最亮，集光器升至最高，光栅打至最大。

4．注意事项：微螺旋是显微镜最精细、最脆弱的机械部分，每旋转一周使镜筒上升或下降0.1毫米，只能做往返回转，不要向单一方向转动数周。

观察滴片标本时，载物台应放平，注意勿将物镜镜头接触粪液。

观察封片标本时，勿使镜头与盖玻片接触，以免压坏标本或损伤镜头。

观察血涂片标本时，必须按一定顺序，逐个视野检查，以免遗漏。

油镜头使用完毕，应用擦镜纸蘸少许二甲苯擦试，再用干燥镜纸擦去残存之二甲苯。

最后将物镜头转成“人”字形，降落镜筒或上抬载物台，稍微下降集光器，对号送入镜盒内。

常用标本及观察方法
1．瓶装标本
指一些蠕虫成虫、医学昆虫成虫、病变脏器大体标本、蠕虫生活史及中间宿主。

主要用肉眼观察，必要时结合放大镜。

2．玻片标本
指滴片标本和封片标本（虫卵﹑虫体﹑组织﹑血液）。

先用低倍镜，再用高倍镜或用油浸镜。

※注意滴片标本用过后将盖玻片拨下收回，载玻片放入污物缸内。

绘图法
1.必须在认真观察多个标本并基本掌握所观察标本的典型结构之后再绘图。

2.绘图要用规定的报告纸和铅笔画点线构成的轮廓图（部分绘图用彩色笔）。

3.绘图时要线条清晰，注字准确清楚，并应向右侧指线。

4.要妥善处理同一标本各部层次及同类标本间大小，比例关系。

5.将放大倍数写于图下。

第一篇医学微生物学实验
第一章细菌形态学检查法
实验1 不染色标本的观察
应用不染色标本可直接观察活细菌的形态和运动，且能避免由于某些染色操作而引起细菌变形，常用的不染色标本的制备方法有悬滴法和压滴法。

【材料】
①枯草杆菌6~12h肉汤培养物
②葡萄球菌6~12h肉汤培养物
③凡士林
④载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、煤气灯
【方法】
(一)悬滴法
取清洁的凹玻片
和盖玻片各一张，涂
少许凡士林于凹玻片
窝的周围；取一接种
环枯草杆菌肉汤培养
物滴于盖玻片之中央，
将盖玻片迅速翻转，
复盖于凹玻片窝上(图
1—1)。

轻压盖片，使其
固定并密封，防止菌液变干，便于长时间观察。

同法再以葡萄球菌肉汤培养物做一悬滴片。

镜检方法：将集光器稍降下，使视野内光线变暗。

用低倍镜找出悬滴的边缘，然后换用高倍镜或油镜观察滴内细菌的形态和运动。

枯草杆菌有鞭毛能运动。

它们可向不同方向运动，速度较快，相互间的位移很大。

葡萄球菌没有鞭毛不能做固有运动，但由于受水分子的撞击而呈分子运动(布朗氏运动)，只在一定范围内作往复颤动，相互间位移不大。

按细菌运动性的不同，可以推知细菌有无鞭毛，这是鉴别菌种的要点之一。

(二)压滴法
分别取枯草杆菌和葡萄球菌肉汤培养物，放于载物片中央。

小心地把盖玻片放于液滴之上，勿使中间产生气泡，中间液层越薄越好。

镜检方法
与悬滴法相同。

本法较悬滴法简单，但标本容易干涸，不能长时间观察(注意：勿将菌液压溢到玻片边缘之外)。

【附录】
接种环和接种针：接种环又称为白金耳，接种针又称为白金线，是细菌取材或接种的常用工具。

前端通常用细电炉丝制成，损坏时可自行更换；也可用白金丝制作，但价格昂贵。

实验2 革兰氏染色法
革兰氏染色法(Gram’s stain)是最常用的细菌染色法，本实验要求同学能正确掌握此染色方法的操作技术，理解其在鉴别细菌上的重要意义。

【原理】
细菌经结晶紫初染染成蓝色。

革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。

而革兰氏染色阴性菌（G—）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。

【材料】
①金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)24h斜面培养物
②大肠杆菌(Escherichia coli，E．coli)24h肉汤培养物
③革兰氏染色液
④生理盐水
⑤载物玻片、接种环等
【方法】
按涂片→干燥→固定→染色→镜检的顺序进行。

准备载物玻片：用镊子从载物片缸中取出经3％盐酸酒精脱脂的载物玻片，用擦片布擦净，然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.5~2.0cm的圆圈，做为涂膜的标记范围。

点燃煤气灯：先把煤气灯的煤气孔和通气孔闭上，再把管道的煤气开关打开，然后把煤气灯的煤气口稍稍开放，立即用火柴点燃之，适当调节煤气孔和通气孔，使火焰长度在8~10cm，并能分清内外焰为止。

1．涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下：
用肉汤培养物涂片：
①右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。

②将接种环按15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝烧
红(图1—2)，然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。

③用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将试管口用火焰烧灼灭菌。

④用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料(图1—3)，此时注意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。

⑤将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上略加烧灼（时间要短以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。

⑥将接种环上之材料涂于载物片上，随后立即将接种环用火焰烧灼灭菌。

为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。

用斜面培养物涂片：
用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。

无菌操作取材步骤同前。

2．干燥：放空气中自然干燥。

如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。

3．固定：用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，以固定之。

此时杀死大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。

4．染色：
①将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1min。

②水洗后加芦戈氏碘液处理(媒染)1min。

③水洗后用95％酒精脱色，脱色时频频摇动玻片，直至流下的液体无色为止(约需0.5min)。

④水洗后加石炭酸复红稀释液染色(复染)0.5min。

⑤水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检。

染色过程中，水洗要用自来水的细流徐徐冲洗，冲洗涂膜的背面，勿使强水流直接冲到涂膜上。

【结果观察】
使用油镜观察，注意标本中两种细菌的形态、大小、排列各如何，最后判定染色性，哪种细菌是革兰氏阳性菌(染成紫色)，哪种细菌是革兰氏阴性菌(染成红色)。

将在标本中观察到的细菌形态和染色性，用有色铅笔画出模式图，并附以文字说明。

注意事项：①酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则
芽胞(Spore)是细菌的休眠状态，对各种理化因素有强大的抵抗力，能
耐受恶劣环境的影响。

芽胞折光性很强，可经特殊染色法染色后，在光学
显微镜下观察。

本实验要求学生了解两种特殊染色法并认识这种细菌特殊
构造。

(一)威-康(Wiltz—Conkln)二氏芽胞染色法
【材料】
①破伤风杆菌（Clostridium tetani）24h琼脂斜面纯培养物
② 3％孔雀绿水溶液
③ 0.5％花红水溶液
④载物玻片
【方法】
1．取破伤风杆菌培养物涂膜、干燥、火焰固定。

2．滴加3％孔雀绿水溶液加热染色3～6min，水洗。

3．0.5％花红水溶液复染0.5～1min，水洗，干燥，镜检。

【结果观察】
芽胞染成绿色，菌体染成红色。

注意芽胞的形状、在菌体中的位置和大小(与菌体横径比较)。

同时可
能看到没有芽胞的繁殖体和失掉菌体的芽胞。

（二）Moeller氏芽胞染色法
经火焰固定的细菌涂片，以5％铬酸水溶液处理2~10min，充分水洗。

用石碳酸复红染液加热染色1min，水洗。

用5％硫酸水短时间脱色(约5s)，立即水洗。

再用美蓝染液染色半分钟，水洗，吸干，镜检。

结果芽胞染成
红色，菌体染成蓝色。

(刘兵)
第二章细菌培养实验
感染性疾病的诊断关键在于病原菌的分离与鉴定，人工培养法为细菌
提供必要的生长条件，使其在体外生长繁殖。

本章着重介绍常用细菌培养
基的制备、细菌的接种方法及生化反应鉴定法，最后简介了内毒素的检测。

要求同学们了解培养基的制作原则和方法，掌握细菌的分离培养技术。

实验1 常用培养基制备
培养基是指在人工培养细菌时，提供给细菌生长繁殖所必需的营养物质的制品。

基础培养基中所含的营养物质能满足一般病原菌生长繁殖所需的氮源、碳源和无机盐等。

在基础培养基的基础上添加一些特殊成分（如糖类、血液、抑制剂等）则可制成营养培养基、鉴别培养基和选择培养基等。

(一)肉汤培养基
肉汤培养基是常用的液体培养基，也是制备常用的细菌分离培养基及其他某些培养基的基础。

【材料】
鲜牛肉(去脂肪和肌腱)、蛋白胨、氯化钠、pH试纸、10％碳酸氢钠、试管、三角烧瓶、蒸馏水等。

【方法】
1．将新鲜牛肉500g切碎或搅碎，加水1000ml，放4℃冰箱或冷处浸泡过夜，然后煮沸30min，放凉，使残余的脂肪凝固，再用绒布或滤纸过滤，将滤液补足为原量。

此溶液称为肉水或肉浸液。

2．1000ml肉水中加入蛋白胨10g、氯化钠5g，加热溶解，放凉。

3．用精密pH试纸测酸碱度，用10％碳酸氢钠校正pH为7.2左右。

过碱时，可用10％醋酸校正之。

4．分装于试管中或三角烧瓶中，15磅(121℃)高压蒸气灭菌20～30min。

如用市售的牛肉膏代替新鲜肉水时，可将牛肉膏溶成0.3～0.5％的水溶液，再如上法制成培养基。

(二)普通琼脂培养基
普通琼脂培养基是常用的固体培养基，包括普通琼脂平板和普通琼脂斜面两种，前者用于分离纯种细菌，后者用于增殖纯种细菌或保存菌种。

【材料】
①肉水 200ml
②蛋白胨 2g
③氯化钠 1g
④琼脂 5g
⑤无菌平皿、灭菌试管、三角烧瓶等。

【方法】
1．按上记数量把肉水、蛋白胨、氯化钠和琼脂放到三角烧瓶中，加热
溶化。

2．趁热用pH试纸测酸碱度，用10％碳酸氢钠校正pH为7.2左右。

3．15磅高压蒸气灭菌20～30min。

4．趁热将溶化的培养基倒入灭菌平皿内，每个平皿倒入约15ml，凝固后即成普通琼脂平板培养基；如趁热将培养基倒入灭菌试管内，再将试管斜放试验台上，凝固后即成普通琼脂斜面培养基。

琼脂系由海藻中提取的一种多糖，俗称洋粉，具有100℃溶化，40℃凝固的特性。

细菌不能分解琼脂，故无营养作用，仅是固体培养基的赋形剂。

普通琼脂培养基也可用市售的营养琼脂粉(含有普通琼脂培养基的各种成分并已调好pH)制备，用法见产品说明书。

(三)血液琼脂培养基
有些细菌其营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长不良，可用血液琼脂培养基进行培养。

【材料】
①普通琼脂培养基 200ml
②血液(脱纤维羊血或兔血) 10～20ml
【方法】
1．加热溶化普通琼脂培养基。

2．待冷至50℃左右时，加入无菌的脱纤维血液，混匀(注意勿使产生泡沫)。

3．分注于灭菌试管或平皿中制成血斜面和血平板培养基。

实验2 细菌分离培养与纯培养
细菌分离培养法是指将临床材料接种于适当的培养基(Media)上进行孵育，分离获得纯种细菌的方法。

只有获得纯种细菌才能鉴定细菌，研究细菌的生物学特性、致病性及对药物的敏感性，进而指导临床治疗疾病。

本次实验的目的是学习细菌分离培养与纯培养法，掌握几种常用的细菌接种技术。

【材料】
①金黄色葡萄球菌和大肠杆菌24h混合肉汤培养物
②普通琼脂平板培养基
③普通琼脂斜面培养基
④肉汤培养基
⑤革兰氏染色液
⑥生理盐水
⑦载物玻片，接种环等。

【方法】
1．平板培养基接种的分离培养法
平板培养基具有较大的表面积，用于从混杂的检查材料中分离出纯种细菌，其要点是如何获得较多的孤立菌落。

最常用的平板接种法是划线法，根据检查材料中含菌量的多少，可采用不同的划线方法：
①连续划线法：检查材料中含菌量较少时，可用本法。

先将接种环用火焰灭菌，待冷却后挑取检查材料，涂于平板的上端，随即向下连续平行划线至平板的中部，然后将平板旋转180°，由平板的另一端连续平行划线至平板的中部(图2—1a)。

划线时接种环与平板表面所成的角度要小，以免划破琼脂。

划线要密而不重复，充分利用平板的表面。

②分段划线法：检查材料中含菌量较多时，可用此法以求获得孤立菌落。

先将检查材料涂于平板上端后，然后将接种环用火焰灭菌，冷却后使接种环通过已涂于平板上端的接种材料划线于“1”区(图2—1b)。

再将接种环火焰灭菌，待冷却后再划线于“2”区。

同法再划线于“3”区。

可根据菌量的不同，决定分段的数目。

划线完毕，先盖好平板，再将接种环上残留的细菌用火焰灭菌。

在平皿底面，用特殊铅笔写上班级、学号和材料号，然后使平皿底面向上放于铁丝筐中，送37℃温箱培养，经18～24h，可观察有无孤立菌落生长，每一孤立菌落即为一纯种细菌。

一般病原菌的菌落数少于杂菌，故在分离培养时，应力求出现较多的孤立菌落，以提高病原菌检出率。

【结果观察】
①菌落形态：首先一般先观察整个平板培养基上的菌落形态及种类，然后再选有代表性的各种孤立菌落做如下的详细观察。

大小：一般可描述为针尖大、粟粒大等，也可按实测mm数表示之。

大菌落(直径在5mm以上)
中等大菌落(直径在3mm左右)
小菌落(直径在1mm左右)
形状：点状、圆形、卵圆形、叶状等。

边缘：整齐、锯齿状、毛发状等。

表面：光滑、皱纹、湿润、干燥等。

隆起度：凸起、扁平、中心凹陷等。

结构：均质性、颗粒状等。

色调：无色、白色、黄色、褐色等。

透明度：透明、半透明、不透明等。

观察菌落时，不要将空气中落入培养基而生长的杂菌误认为目的细菌。

杂菌一般生长于划线痕迹外，或为个别的形状异常的孤立菌落。

另外观察时，也要注意保护好平板，勿使再落入杂菌。

②细菌形态：选择经肉眼详细观察过的不同种类的孤立菌落各一个，用特殊铅笔在平皿底部作圈记并编号，然后再涂膜，做革兰氏染色。

涂膜方法：先取载物玻片，用特种铅笔在玻片背面画两个圆圈，并写上与平皿上菌落相同的号码。

用接种环按无菌操作取材法沾取生理盐水，于每一圆圈内各放一滴。

再用接种针按无菌操作法分别从选好的菌落上挑取细菌，按编号在载物片上涂于生理盐水内，做成薄而均匀的涂膜。

挑菌时不要取菌太多，不要触碰其它菌落，涂膜切勿太厚，否则影响镜检效果。

染色后镜检，注意观察视野内是否为形态相同的纯种细菌，注意其形态、排列、染色性等，如有不同，则可能挑菌时触碰其它菌落，应另选菌落涂片染色。

以上所学习的是最经典的培养方法，目前临床检验常使用全自动培养仪，大大提高了培养的效率和质量。

全自动快速血培养仪（Bact Alert 120）能从血液和体液中快速检出需氧菌、厌氧菌、L型细菌和真菌，一般24h内检出率达85%，48h内检出率达95%以上。

2．斜面培养基接种的纯培养法
斜面培养基不易污染，常用于培养纯种细菌。

斜面培养基通常也采用划线接种法。

接种时，右手持接种环，先将接种环灭菌，待冷后挑取平板上孤立菌落的细菌。

将平板放回原处后，用左手取斜面培养基，用右手小指和手掌拔去试管棉塞，将试管口通过火焰略微加热灭菌，再将接种环插入试管(勿触碰管壁)，由斜面底部向上划一直线，然后再从斜面底部向上连续平行划线(图2—2)。

划线完毕，再将试管口通过一下火焰，棉塞灭菌后，塞好棉塞，最后将接种环上的残留细菌用火焰灭菌。

接种好的斜面培养基放37℃温箱培养18～24h，所接种的细菌则生长为均质的菌苔。

此培养物来自孤立菌落，为纯种，可用于该菌的各种生物学性状检查。

3．液体培养基接种法
可采用“双管移植法”(图2—3)，将琼脂斜面上生长的细菌移植于肉汤培养基中，即左手持细菌培养物和肉汤培养基两支试管，右手持接种环，按无菌操作法取少量细菌，在肉汤表面稍上的管壁上轻轻研磨，使细菌混入培养基内。

接种后放37℃温箱培养18~24h，肉眼观察，如培养基出现混浊或形成菌膜、沉淀等，则表示有细菌增殖，观察其增殖状态，有助于鉴别细菌。

4．高层培养基接种法
细菌实验室为保存菌种或测定细菌有无动力，常制成固体或半固体的高层培养基，某些生化性状检查也使用高层培养基(如醋酸铅培养基)。

高。