生长激素释放相关肽GHRL-12在免疫检查点抑制剂相关心肌炎小鼠中的作用与机制研究

㊃肿瘤与心血管疾病专题㊃生长激素释放相关肽GHRL-12在免疫检查点
抑制剂相关心肌炎小鼠中的作用与机制
研究
汪雪君㊀沈毅辉㊀张卉㊀陈怡帆㊀许宇辰㊀张健㊀程蕾蕾
200032上海市心血管病研究所(汪雪君㊁沈毅辉㊁张卉㊁陈怡帆㊁许宇辰㊁张健㊁程蕾蕾);
200032上海,复旦大学附属中山医院心内科(沈毅辉㊁张卉㊁陈怡帆㊁许宇辰);200032
上海,国家放射与治疗临床医学研究中心(汪雪君㊁沈毅辉㊁张卉㊁陈怡帆㊁许宇辰㊁张
健㊁程蕾蕾);200032上海,复旦大学附属中山医院心脏超声诊断科,上海市影像医学研
究所(汪雪君㊁张健㊁程蕾蕾)
通信作者:程蕾蕾,电子信箱:cheng.leilei@
DOI:10.3969/j.issn.1007-5410.2024.02.004
㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀探讨生长激素释放相关肽GHRL-12在免疫检查点抑制剂相关心肌炎中的作用
与机制,为其临床应用提供理论依据㊂㊀方法㊀6~8周龄BALB/c小鼠,采用随机数生成器,随机分
为对照组㊁心肌炎组㊁GHRL-12组和GHRL-12+心肌炎组㊂GHRL-12组和GHRL-12+心肌炎组小鼠尾
静脉注射10mg/kg GHRL-12连续1周,同时对照组和心肌炎组小鼠尾静脉注射同等体积的无功能
scramble肽㊂在第7天和第14天分别给予心肌炎组和GHRL-12+心肌炎组小鼠250μg心肌肌钙蛋白
I(cTnI),从第14天开始,每间隔1天给予小鼠腹腔注射5mg/kg anti-PD-1,共5次㊂每7天称量小鼠
体重,测量小鼠心体比和心胫比㊂超声心动图检测心功能指标㊂HE染色检测心肌组织炎症细胞浸
润程度,Masson染色检测心肌组织纤维化程度,并用ImageJ对炎症细胞浸润和纤维化程度进行量化㊂
取小鼠眼球血,检测血清中肌酸激酶(CK)㊁CK同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶1(LDH-1)变化㊂酶联
免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中炎症因子cTnI㊁cTnT㊁白细胞介素1β(IL-1β)㊁白细胞介素6
(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)释放情况㊂蛋白质印迹技术测定小鼠心肌组织中自噬相关蛋白高
迁移率族蛋白B1(HMGB1)㊁酵母Atg6同源物(Beclin-1)㊁自噬基因-相关蛋白5(ATG5)和微管相关
蛋白轻链3B(LC3B)的表达,同时测定小鼠心肌组织中凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (Caspase-3)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表达㊂对心肌细胞核用DAPI染成蓝色,凋亡细
胞被TUNEL染成绿色,检测小鼠心肌组织发生凋亡的情况㊂㊀结果㊀(1)与对照组相比,GHRL-12
组小鼠体重无显著差异,心肌炎组小鼠体重增长不明显;与心肌炎组比较,给药第19天起GHRL-12+
心肌炎组小鼠体重增长较为明显㊂与对照组和GHRL-12组相比,心肌炎组小鼠心体比㊁心胫比显著
增加,而与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组小鼠心体比㊁心胫比下降㊂(2)超声心动图显示,
单纯给予GHRL-12干预对小鼠心功能无显著影响,与对照组相比,心肌炎组小鼠左心室射血分数(LVEF)㊁缩短分数(FS)显著下降,左心室收缩末期内径(LVEDs)㊁左心室舒张末期内径(LVEDd)显
著增加;而与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组小鼠LVEF㊁FS升高,LVEDs㊁LVEDd减少㊂
(3)HE染色结果显示,与对照组小鼠相比,心肌炎组小鼠炎症细胞浸润显著增加,而与心肌炎组小鼠
相比,GHRL-12+心肌炎组小鼠炎症细胞浸润减少㊂(4)Masson染色结果表明,与对照组小鼠相比,心
肌炎组小鼠心肌组织纤维化程度增加,而与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组小鼠心肌组织纤
维化程度降低㊂(5)与对照组小鼠相比,心肌炎组小鼠血清中CK㊁CK-MB㊁LDH-1㊁cTnI和cTnT均显
著上升,而与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组均显著下降㊂(6)蛋白质印迹结果显示,与对照
组小鼠相比,心肌炎组小鼠心肌组织HMGB1㊁Beclin-1㊁ATG5和LC3B蛋白表达均显著增加,而与心
肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组均显著下降;同时,心肌炎组Caspase-3和PARP蛋白表达均显
著增加,GHRL-12+心肌炎组均显著减少㊂(7)TUNEL结果显示,与对照组小鼠相比,心肌炎组小鼠心
肌组织凋亡显著增加,与心肌炎组小鼠相比,GHRL-12+心肌炎组小鼠心肌组织凋亡显著下降㊂结论㊀多肽GHRL-12能够改善免疫检查点抑制剂诱导的心功能损伤,减少心肌组织中炎症细胞浸润和纤维化,抑制心肌组织凋亡和自噬,为未来免疫检查点抑制剂相关心肌炎的治疗提供潜在可能㊂ʌ关键词ɔ㊀免疫检查点抑制剂;㊀心肌炎;㊀GHRL-12;㊀细胞凋亡;㊀自噬
基金项目:国家自然科学基金(82170359);上海申康医院发展中心市级医院诊疗技术推广及优化管理技术规范化管理和推广项目(SHDC22023207);中山医院临床研究专项基金(2020ZSLC21)
Role and mechanism of growth hormone release related peptide GHRL-12in mice with immune checkpoint inhibitor-related myocarditis㊀Wang Xuejun,Shen Yihui,Zhang Hui,Chen Yifan,Xu Yuchen,Zhang Jian,Cheng Leilei
Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases,Shanghai200032,China(Wang XJ,Shen YH,Zhang H, Chen YF,Xu YC,Zhang J,Cheng LL);Department of Cardiology,Zhongshan Hospital,Fudan University, Shanghai200032,China(Shen YH,Zhang H,Chen YF,Xu YC);National Clinical Research Center for Radiology and Therapy,Shanghai200032,China(Wang XJ,Shen YH,Zhang H,Chen YF,Xu YC, Zhang J,Cheng LL);Shanghai Institute of Imaging Medicine,Department of Cardiac Ultrasound, Zhongshan Hospital,Fudan University,Shanghai200032,China(Wang XJ,Zhang J,Cheng LL) Corresponding author:Cheng Leilei,Email:cheng.leilei@
ʌAbstractɔ㊀Objective㊀To elucidate the scope mechanism of ghrelin and obestatin prepropeptide-12 (GHRL-12)in immune checkpoint inhibitor(ICI)-related myocarditis,providing a theoretical foundation for its future clinical application.㊀Methods㊀BALB/c mice aged6to8weeks were randomly divided into control group,myocarditis group,GHRL-12group and GHRL-12+myocarditis group by random number generator.Mice in GHRL-12group and GHRL-12+myocarditis group were injected with10mg/kg GHRL-12through tail vein for1week,while mice in control group and myocarditis group were injected with the same volume of non-functional scramble peptide through tail vein.Mice in myocarditis group and GHRL-12+ myocarditis group were given250μg cardiac troponin I(cTnI)on day7and day14,respectively,and intraperitoneal injection of5mg/kg anti-PD-1was given every day from day14,for a total of5times.The mice were weighed every7days and the heart-body ratio and heart-shin ratio were measured. Echocardiography was used to detect cardiac function.HE staining was used to detect the degree of inflammatory cell infiltration in myocardial tissue,Masson staining was used to detect the degree of myocardial fibrosis.ImageJ was used to quantify the degree of inflammatory cell infiltration and fibrosis, respectively.The changes of creatine kinase(CK),CK isoenzyme(CK-MB)and lactate dehydrogenase1 (LDH-1)in serum were detected.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect cTnI, cTnT,interleukin-1β(IL-1β),interleukin-6(IL-6)and tumor necrosis factorɑ(TNF-α)in serum of mice.The expression of autophagy associated protein high mobility group B1(HMGB1),yeast Atg6 homology(Beclin-1),autophagy gene-associated protein5(ATG5)and microtubule associated protein light chain3B(LC3B)in mouse myocardial tissue was determined by western blotting.The expressions of cysteine aspartate protease3(Caspase-3)and polyadenosine diphosphoribose polymerase(PARP)in myocardial tissue of mice were also measured.The myocardial nuclei were dyed blue by DAPI and the apoptotic cells were dyed green by TUNEL.㊀Results㊀(1)Compared with the control group,the body weight of mice in GHRL-12group was not significantly different,and the body weight of mice in myocarditis group was not significantly increased;Compared with myocarditis group,the weight of mice in GHRL-12+ myocarditis group increased significantly from the19th day of pared with the control group and GHRL-12group,the heart-body ratio and heart-shin ratio of mice in myocarditis group were significantly increased,while compared with myocarditis group,the heart-body ratio and heart-shin ratio of mice in GHRL-12+myocarditis group were decreased.(2)Echocardiography showed that the intervention of GHRL-12alone had no significant effect on the cardiac function of pared with the control group, the left ventricular ejection fraction(LVEF)and shortening fraction(FS)of mice in myocarditis group were significantly decreased,and the left ventricular end-systolic diameter(LVEDs)and left ventricular end-diastolic diameter(LVEDd)were significantly increased.In GHRL-12+myocarditis group,LVEF and FS were increased,while LVEDs and LVEDd were decreased compared with the myocarditis group.(3)HE staining showed that inflammatory cell infiltration increased significantly in the myocarditis group compared with the control group,but decreased in the GHRL-12+myocarditis group compared with the myocarditis group.(4)Masson staining showed that the degree of myocardial fibrosis increased in the myocarditis group compared with the control group,but decreased in the GHRL-12+myocarditis group compared with the myocarditis group.(5)Serum CK,CK-MB,LDH-1,cTnI and cTnT in myocarditis group were significantly increased compared with the control group,while those in GHRL-12+myocarditis group were significantly decreased compared with the myocarditis group.(6)Western blot results showed that the protein expressions of HMGB1,Beclin-1,ATG5and LC3B in myocarditis group were significantly increased compared with the control group,while those of GHRL-12+myocarditis group were significantly decreased compared with the
myocarditis group;Meanwhile,the protein expressions of Caspase-3and PARP were significantly increased in myocarditis group compared with the control group,and significantly decreased in GHRL-12+myocarditis group compared with the myocarditis group.(7)TUNEL results showed that myocardial apoptosis was significantly increased in myocarditis group compared with the control group and significantly decreased in GHRL-12+myocarditis group compared with the control group.㊀Conclusions㊀GHRL-12peptide can improve the cardiac dysfunction induced by immune checkpoint inhibitors,reduce inflammatory cell infiltration and fibrosis in myocardial tissue,inhibit apoptosis and autophagy in myocardial tissue,and provide potential for the future treatment of immune checkpoint inhibitors-related myocarditis.
ʌKey wordsɔ㊀Immune checkpoint inhibitors;㊀Myocarditis;㊀GHRL-12;㊀Apoptosis;㊀Autophagy Fund program:National Natural Science Foundation of China(82170359);Shanghai Shenkang Hospital Development Center Municipal Hospital Diagnosis and Treatment Technology Promotion and Optimization Management Technology Standardized Management and Promotion Project(SHDC22023207); Clinical Research Foundation of Zhongshan Hospital(2020ZSLC21)
㊀㊀自2011年以来,免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)的应用为晚期恶性肿瘤治疗带来了新的选择[1]㊂不过,临床数据表明,有1.14%的患者罹患ICIs相关心肌炎,死亡率接近50%[2]㊂ICIs 相关心肌炎临床表现为胸痛㊁呼吸急促㊁肺水肿甚至心原性休克,还可能出现心律失常,导致晕厥和猝死[3]㊂目前,针对ICIs相关心肌炎主要以大剂量激素冲击治疗为主㊂但在临床诊疗中发现,一部分患者因出现激素抵抗使临床获益率降低,这部分患者最终可能发生不良心血管事件[4]㊂因此,为ICIs相关心肌炎寻找高敏感性和特异性的治疗手段迫在眉睫㊂
ICIs是阻断T细胞免疫反应阴性调节剂的一类蛋白类分子,包括细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (cytotoxic T-lymphocyte associated antigen4,CTLA-4)㊁程序化细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein1,PD-1)和PD-1配体(PD-L1)㊂PD-1㊁PD-L1和CTLA-4信号的完整性对于下调心肌的过度免疫反应至关重要[5]㊂其中,PD-1是一种在T细胞㊁活化自然杀伤细胞㊁B细胞㊁单核细胞和未成熟的朗格汉斯细胞上表达的共抑制分子[6]㊂PD-1可与配体PD-L1和PD-L2结合㊂虽然PD-L2的表达仅限于巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞,但PD-L1由淋巴细胞和非淋巴细胞表达,包括心脏和内皮细胞[7]㊂有研究表明,PD-L1仅在受伤心肌细胞的细胞表面表达,可能通过将心肌细胞抗原暴露在T 细胞面前而引发细胞死亡[8]㊂
多肽是由蛋白酶体降解产生,可作为内源性配体或受体介导多种信号通路发挥重要作用[9]㊂研究表明,除心钠肽和脑钠肽以外,循环抗微生物肽LL-37已成为心血管疾病中的新型生物标志物[10]㊂而ELA-11在多柔比星引起的心脏毒性中通过抑制凋亡保护心肌细胞[11]㊂Ghrelin是生长激素分泌受体的内源性配体,参与调节生长激素释放㊁免疫细胞激活和炎症[12]㊂有研究显示,Ghrelin通过Nrf2/ NADPH/ROS通路改善心肌梗死后纤维化[13]㊂基于前期研究,我们将内源性配体纯化后得到一条由12个氨基酸组成的,在物种间高度保守的多肽,将其命名为GHRL-12,在既往研究中尚未见报道㊂本研究将通过构建ICIs相关心肌炎小鼠模型,系统评估GHRL-12对心肌细胞的作用与机制,为其临床应用提供理论依据㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀主要试剂和仪器
GHRL-12及scramble肽合成购自上海科肽生物科技有限公司㊂苏木精-伊红(HE)和马松三色(Masson)染色试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司㊂凋亡检测试剂盒与DAPI购自上海碧云天生物技术有限公司㊂聚偏二氟乙烯(PVDF)购自美国Merck公司㊂脱脂牛奶㊁洗膜缓冲液(TBST)购自上海生工生物工程技术服务有限公司㊂辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗体#14220,#9542(1ʒ1000)购自美国Cell Signaling Technology公司㊂81115-1-RR,10181-2-AP,11306-1-AP和14600-1-AP(1ʒ1000)购自武汉三鹰生物技术有限公司㊂心肌肌钙蛋白(cardiac troponin,cTn)I㊁cTnT㊁白细胞介素(interleukin,IL)-6,IL-1β和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)ELISA检测试剂盒均购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司㊂Vevo2100超声系统购于加拿大VisualSonics公司㊂
1.2㊀动物模型构建
选取6~8周龄BALB/c小鼠,体重20~25g,共24只,SPF级环境饲养㊂采用随机数生成器,将小鼠随机分为对照组(CON group)㊁心肌炎组(ICIs group)㊁单纯给予GHRL-12组(GHRL-12group)和GHRL-12+心肌炎组(GHRL-12+ICIs group),每组各
图1㊀小鼠给药及模型建立
6只㊂GHRL-12组和GHRL-12+心肌炎组小鼠尾静脉注射10mg/kg GHRL-12连续1周,同时对照组和心肌炎组小鼠尾静脉注射同等体积的无功能scramble肽(序列:QRKKQSKVPPAE)㊂在第7天和第14天分别给予心肌炎组和GHRL-12+心肌炎组小鼠250μg cTnI,从第14天开始,每间隔1天给予小鼠腹腔注射5mg/kg anti-PD-1,共5次(图1)㊂当超声心动图显示小鼠心功能下降,心肌组织病理切片显示明显炎症细胞浸润,表明造模成功㊂所有动物实验均符合美国国立卫生研究院出版的‘实验动物护理和使用指南“(美国国立卫生研究院出版物第85-23号,1996年修订版),并经复旦大学附属中山医院动物实验伦理审查批准㊂
1.3㊀超声心动图检测
在动物模型构建完成后,将小鼠放置于含有2%异氟醚(河北一品制药股份有限公司,中国上海)的诱导室中,持续供氧2L/min㊂待小鼠麻醉完全后,将其平卧置于等温实验台上㊂使小鼠心率维持在350~550次/min,经胸超声心动图使用30MHz高频扫描探头(visualsonic Vevo2100;visualsonic,Toronto,Canada),记录M模式图像㊂测量左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)㊁缩短分数(fractional shortening,FS)㊁左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDd)和左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension,LVEDs)㊂所有测量均取连续3个心动周期的平均值㊂
1.4㊀HE染色
用10%水合氯醛腹膜麻醉小鼠,待麻醉完全后,对心腔内血液进行灌流㊂用组织固定液固定心脏7d㊂组织在乙醇和二甲苯作用下呈透明状㊂将透明组织浸泡在熔化的石蜡中进行包埋㊂冷却凝固后,切成5μM大小的薄片,压平,贴在载玻片上, 45ħ培养箱中干燥㊂再次去蜡,分别用苏木精和伊红染色㊂苏木精将细胞核和细胞内核糖体染成蓝色和紫色,伊红将细胞质染成红色㊂
1.5㊀Masson染色
按上述方法进行组织切片㊂用Weigert弹力纤维染色液对细胞核染色5~10min,洗涤后用ponceau酸品红溶液染色5~10min㊂取出切片,依次用2%冰醋酸溶液浸泡30s和1%磷酸钼酸盐溶液分化3~5min㊂然后用苯胺蓝染色5min,再用0.2%冰醋酸溶液浸泡30s㊂最后,依次用95%乙醇㊁无水乙醇㊁二甲苯透明胶和中性胶密封切片㊂1.6㊀TUNEL染色
准备好组织切片,在样本上滴加适量蛋白酶K,使其完全浸润,置于37ħ恒温培养箱中消化30min 后用PBS洗去多余蛋白酶K㊂随后加入TdT酶,在37ħ培养箱中反应2h㊂待反应完成后,用PBS洗涤样本㊂最后滴加适量dUTP标记物进行染色标记,在37ħ培养箱中孵育30min㊂染色结束后用PBS洗净,置于荧光显微镜下观察㊂
1.7㊀蛋白质印迹技术
将组织块加入按照比例配制好的蛋白裂解液中,组织匀浆仪裂解3次㊂将裂解液置于冰上裂解30min后,将裂解液置于4ħ,12000r/min离心15min㊂根据上清体积加入1/4体积的5ˑSDS㊂100ħ煮沸10min㊂冷却后,1000r/min离心1min㊂蛋白质样品依次进行电泳㊁跨膜㊁密封㊁一抗孵育㊁洗膜㊁二抗孵育㊁洗膜㊁曝光㊂鉴定蛋白表达㊂1.8㊀心肌损伤酶谱检测
取小鼠眼球血,收集血浆,4ħ,3000r/min离心15min,收集上清㊂按厂家说明配制工作试剂㊂
在自动生化仪上设置相应的参数后,自动测量并得出样品结果,包括肌酸激酶(creatine kinase,CK)㊁肌
酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)㊁
乳酸脱氢酶1(lactate dehydrogenase 1,LDH-1)㊂
1.9㊀酶联免疫吸附试验
取小鼠上清㊂用碳酸盐包被缓冲液稀释抗体
至蛋白含量为1~10μg /ml㊂每孔加100μl 于聚苯
乙烯酶标记板4ħ过夜㊂第2天丢弃溶液,用洗涤
缓冲液洗涤3次,每次洗涤3min㊂每孔加密封溶液200μl,37ħ孵育1~2h㊂除去密封液,加入300μl
洗液,浸泡1~2min,在吸水纸上拍干,重复3~5次㊂依次按步骤加入待测样品㊁生物化抗体㊁酶结合工作液和TMB 底物溶液孵育㊂酶结合工作液和TMB 底物溶液应避光孵育㊂当双倍稀释的标准孔出现
明显的颜色梯度时,在每个反应孔100μl 中加入
2M 硫酸㊂当颜色由蓝色变为黄色时,检测相应波长的OD 值㊂根据标准品的浓度和OD 值绘制标准
曲线,然后根据标准曲线方程计算样品浓度㊂
1.10㊀统计学方法
采用GraphPad Prism 软件进行数据分析㊂计量资
料用x ʃs 表示,每组至少有3个独立实验,两组间比较采用双尾t 检验;多组间比较采用单因素方差分析和
Bonferroni 事后检验㊂P <0.05为差异有统计学意义㊂2㊀结果
2.1㊀GHRL-12对ICIs 相关心肌炎小鼠体重和心功能的影响
为探索GHRL-12对ICIs 相关心肌炎小鼠的作用,我们按照图1进行小鼠分组及给药㊂为了解
GHRL-12对小鼠一般状态的影响,每7天测量小鼠体重㊂结果表明,与对照组比较,GHRL-12组小鼠体重无明显差异,而心肌炎组小鼠体重增长不明显,从第19天开始心肌炎组与对照组体重相比,表现出统计学差异(P =0.025)㊂第31天,
与心肌炎A:GHRL-12尾静脉给药后不同时间点对小鼠体重的影响;B㊁C:各组小鼠心体比㊁心胫比的比较;D:各组小鼠M 型超声图;E ~H:各组小鼠左
心室射血分数㊁左心室缩短分数㊁左心室收缩末期内径和左心室舒张末期内径的统计结果㊂与心肌炎组比较,GHRL-12+心肌炎组小鼠体重增加明显,心体比和心胫比均显著增加,同时心功能显著改善㊂a P <0.05,b P <0.01,c P <0.001(n =6)
图2㊀GHRL-12对ICIs 相关心肌炎小鼠体重和心功能的影响
组比较,GHRL-12+心肌炎组小鼠体重增长较为明显
(图2A)㊂经造模完成后,测量小鼠心体比和心胫
比发现,与对照组和GHRL-12组相比,心肌炎组小鼠心体比㊁心胫比显著增加;与心肌炎组比较,GHRL-12+心肌炎组小鼠心体比㊁心胫比显著下降(图2B㊁2C)㊂超声心动图显示,单纯给予GHRL-12
小鼠心功能无明显变化(图2D);与对照组相比,心肌炎组小鼠LVEF㊁FS 均下降,LVEDs㊁LVEDd 均上升;而经GHRL-12干预后LVEF㊁FS 有所上升,LVEDs㊁LVEDd 有所下降(图2E ~2H )㊂因此,GHRL-12能一定程度改善ICIs 相关心肌炎小鼠一般状况和心功能㊂
2.2㊀GHRL-12对ICIs 相关心肌炎小鼠心肌组织炎症细胞浸润和纤维化的影响
为进一步明确GHRL-12的作用,我们对各组小鼠心肌组织取样,切片后病理染色㊂HE 染色后,对染色组织,以蓝色为主的点状细胞即为炎症细胞,其中主要是中性粒细胞㊁淋巴细胞和单核细胞,而其他正常细胞则体积较大,细胞质较多呈粉红色,细胞核较小,呈蓝色或深蓝色㊂HE 染色结果表明,对照组和GHRL-12组小鼠心肌细胞排列整齐,细胞
形态正常,无明显炎症细胞浸润;而心肌炎组小鼠心肌组织有明显炎症细胞浸润,GHRL-12+心肌炎组小鼠心肌组织中炎症细胞浸润减少(图3A)㊂使用ImageJ 对炎症细胞浸润情况进行分析发现,心肌炎组与对照组相比㊁GHRL-12+心肌炎组与心肌炎组相
比,小鼠炎症细胞浸润程度均存在统计学差异(均为P <0.001)(图3B)㊂Masson 染色会将心肌组织中胶原纤维染成蓝色,结果显示心肌炎组小鼠胶原含量较对照组和GHRL-12组明显增加,而GHRL-12+心肌炎组与心肌炎组相比,小鼠心肌胶原含量明显降低(图3C)㊂使用ImageJ 对组织中胶原纤维含量进行定量分析显示,心肌炎组与对照组相比㊁GHRL-12+心肌炎组与心肌炎组相比,小鼠心肌胶原含量
均存在统计学差异(均为P <0.001)(图3D)㊂因此,GHRL-12能显著减轻ICIs 相关心肌炎小鼠心肌组织炎症细胞浸润和纤维化程度㊂
2.3㊀GHRL-12对ICIs 相关心肌炎小鼠心功能损伤的影响
为了确定小鼠发生心肌炎时是否会释放心肌损伤标志物,以及GHRL-12
对心肌损伤标志物释放A㊁B:各组小鼠HE 染色图片及统计结果;C㊁D:各组小鼠Masson 染色图片及统计结果㊂与心肌炎组比较,GHRL-12+心肌炎组小鼠心肌组织
炎症浸润和胶原纤维含量显著下降㊂a P <0.001(n =6)
图3㊀GHRL-12对ICIs 相关心肌炎小鼠炎症细胞浸润及纤维化的影响
的影响,我们取各组小鼠血清检测心肌酶谱变化㊂结果表明,与对照组相比,GHRL-12组小鼠血清CK 值无显著差异,而心肌炎组小鼠血清CK 值显著升高,GHRL-12+心肌炎组较心肌炎组小鼠血清CK 值下降明显(图4A)㊂同时,单纯给予GHRL-12干预后,小鼠血清中CK-MB 无明显变化,而心肌炎组小鼠CK-MB 显著上升,GHRL-12+心肌炎组较心肌炎组小鼠血清CK-MB 显著下降(图4B )㊂同样,GHRL-12可减少ICIs 相关心肌炎组小鼠LDH-1的释放(图4C)㊂心肌炎组小鼠cTnI 和cTnT 均显著
升高,而GHRL-1减少了心肌炎组小鼠cTnI 和cTnT 的释放(图4D㊁4E)㊂因此,GHRL-12可显著减少心肌损伤标志物的释放,减少ICIs 对心功能的损伤㊂
2.4㊀GHRL-12对ICIs 相关心肌炎小鼠炎症因子释放的影响
ICIs 相关心肌炎时常伴随炎症因子的释放,为了明确GHRL-12是否同样能够降低炎症因子释放,我们利用ELISA 检测各组小鼠血清炎症因子释放情况㊂如图5所示结果,心肌炎组较对照组小鼠血清中IL-1β㊁IL-6和TNF-α均显著升高(均为P <0.
001);
与心肌炎组比较,GHRL-12+心肌炎组小鼠血清中肌酸激酶(CK)㊁肌酸激酶同工酶(CK-MB)㊁乳酸脱氢酶1(LDH-1)㊁心肌肌钙蛋白I(cTnI)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)含量均显著降低㊂a P <0.001(n =6)
图4㊀GHRL-12对ICIs
相关心肌炎小鼠心功能损伤的影响
与心肌炎组比较,GHRL-12+心肌炎组小鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)㊁白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)含量均显著下降㊂a P <0.001(n =6)
图5㊀GHRL-12对ICIs 相关心肌炎小鼠炎症因子释放的影响
GHRL-12+心肌炎组与心肌炎组相比,小鼠血清IL-1β㊁IL-6和TNF-α均显著下降,且差异有统计学意义(均为P<0.001)㊂由以上结果发现,GHRL-12不仅可以缓解ICIs对心肌的损伤,还可抑制免疫细胞过度激活,抑制炎症因子释放㊂
2.5㊀GHRL-12对细胞凋亡和自噬的影响
为进一步探索GHRL-12抑制ICIs相关心肌炎进展的具体机制,我们利用蛋白质印迹技术检测细胞凋亡和自噬相关蛋白表达㊂结果显示,与对照组相比,心肌炎组小鼠心肌组织中自噬关键蛋白酵母Atg6同源物(Beclin-1)㊁高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)㊁自噬基因-相关蛋白5(ATG5)和微管相关蛋白轻链3B(LC3B)表达均显著增加;仅GHRL-12干预并不能影响自噬,而与心肌炎组相比, GHRL-12+心肌炎组小鼠Beclin-1㊁HMGB1㊁ATG5和LC3B则显著降低(图6A~6E)㊂对心肌组织进行TUNEL染色,DAPI染细胞核呈蓝色,发生凋亡的心肌细胞将被TUNEL染色呈绿色㊂结果表明,对照组与GHRL-12组发生凋亡的心肌细胞无显著差别㊂心肌炎组发生凋亡的心肌细胞显著增多,而GHRL-12+心肌炎组凋亡心肌细胞显著减少(图6F~6G)㊂蛋白质印迹技术进一步检测凋亡相关蛋白变化,发现心肌炎组小鼠心肌组织中cleaved-Caspase-3和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)均显著激活,
而
A:各组小鼠心肌组织中HMGB1㊁ATG5㊁Beclin-1和LC3B蛋白表达图片;B~E:各组小鼠心肌组织中ATG5㊁Beclin-1㊁HMGB1和LC3B蛋白表达统计结果;F:各组小鼠心肌组织TUNEL染色图片(ˑ20);G:TUNEL染色定量分析结果;H:各组小鼠心肌组织PARP和Caspase-3蛋白表达图片;I㊁J:各组小鼠心肌组织cleaved-Caspase-3与Caspase-3蛋白表达比值㊁cleaved-PAPRP与PARP蛋白表达比值统计结果㊂与心肌炎组比较, GHRL-12+心肌炎组心肌组织自噬和凋亡水平显著下降㊂a P<0.05,b P<0.001(n=3)
图6㊀GHRL-12对细胞凋亡和自噬的影响
GHRL-12+心肌炎组较心肌炎组小鼠则被一定程度抑制,且差异有统计学意义(均为P<0.001)(图6H~6J)㊂因此,我们发现GHRL-12可通过抑制细胞凋亡和自噬来改善ICIs相关心肌炎的进展㊂
3　讨论
本研究系统探索了生长激素释放相关肽GHRL-12在ICIs相关心肌炎中的作用与机制㊂研究结果表明,多肽GHRL-12能减轻因ICIs引起的小鼠心肌组织炎症细胞浸润㊁纤维化和炎症因子释放,并改善心肌炎小鼠的心功能,同时通过抑制心肌细胞凋亡和自噬,减轻ICIs引起的心肌损伤㊂凋亡和自噬是驱动ICIs损伤心肌细胞的重要因素,抑制ICIs相关心肌炎小鼠发生凋亡和自噬,将为未来治疗ICIs相关心肌炎提供潜在靶点㊂
PD-1及其配体PD-L1是关键的免疫检查点蛋白,通过负调控T细胞免疫功能的稳定性和完整性,上调免疫和炎症反应,靶向抑制PD-1/PD-L1信号可有效抑制恶性肿瘤的进展[14]㊂尽管靶向PD-1/PD-L1的药物作为一种新型的癌症治疗手段应用于临床中,但PD-1/PD-L1抑制剂的应用对心肌细胞的毒性作用限制了其临床应用[15]㊂有研究报道, PD-1/PD-L1抑制剂诱发的心肌炎具有发病迅速㊁死亡率高的特点,中位死亡时间仅为32d,最终病死率高达46%[16]㊂心肌炎的临床表现包括急性心力衰竭㊁心律失常,甚至心原性休克㊂在ICIs相关心肌炎中,心肌损伤标志物如心肌肌钙蛋白和肌酸激酶同工酶呈不同程度升高,其中以肌钙蛋白特异性最高[17]㊂如果炎症浸润到传导系统,可表现为各种形式的心律失常[18]㊂早期组织病理学检查显示,炎症部位存在大量炎症细胞浸润,炎症细胞通过释放各种炎症因子损伤心肌细胞[19]㊂在早期病变中仅观察到炎症细胞即可诊断为心肌炎㊂随着临床诊疗中ICIs相关心肌炎的发病率逐渐升高,明确其发病机制显得尤为重要㊂
目前有数据支持T细胞介导的免疫是ICIs相关心肌炎发病机制的重要组成部分,但仍然存在很多问题㊂如,什么是煽动性心脏抗原?为什么这些自身抗原会引起免疫反应?先天免疫细胞和B细胞是否发挥作用?涉及哪些心脏细胞类型?心脏细胞功能障碍从哪些方面表现出来?细胞死亡是否是发病机制的关键组成部分,如果是,则涉及哪些细胞死亡[20]这些都是亟待解决的关键科学问题㊂我们通过测量小鼠体重观察小鼠一般情况变化,超声心动图系统评估了ICIs相关心肌炎小鼠心功能变化,并检测了小鼠血清中心肌损伤标志物㊂结果表明,ICIs相关心肌炎小鼠体重增长不明显,
LVEF㊁FS值降低,LVEDs㊁LVEDd升高,血清CK㊁CK-MB和LDH-1上升,以上均证实小鼠心功能受到损害㊂利用ELISA检测心肌酶谱标志物和炎症因子释放,结果显示心肌炎小鼠cTnI㊁cTnT显著升高,表明当发生ICIs相关心肌炎时,cTnT㊁cTnI可作为指标用于临床监测㊂发生心肌炎时,炎症因子IL-6㊁IL-1β和TNF-α呈不同程度升高,因此ICIs相关心肌炎发生时可能会伴随免疫细胞激活,使炎症因子释放增加㊂
细胞死亡是细胞受到损伤后发生的终末期事件[21]㊂细胞死亡包括程序性死亡和非程序性死亡,前者在细胞死亡中占据重要地位,包括凋亡㊁自噬㊁焦亡与坏死性凋亡[22]㊂细胞凋亡是程序性死亡的典型形式,当细胞皱缩㊁细胞质和细胞核发生凝结时,细胞发生凋亡[23]㊂发生凋亡的细胞最终会被附近的巨噬细胞和其他细胞吞噬[24]㊂由于细胞凋亡时细胞内容物并未释出,且吞噬细胞不会释放炎症细胞因子,因此凋亡不会发生免疫反应[25]㊂细胞凋亡的发生机制包括一系列称为Caspases的半胱氨酸蛋白酶的顺序激活㊂当细胞受到DNA损伤㊁活化致癌基因㊁缺氧㊁氧化应激和辐照等死亡信号刺激时,促凋亡因子被上调,激活Caspases发生级联反应,促进凋亡[26]㊂另一种程序性死亡即自噬㊂大自噬是一种细胞 自食 过程,其中大细胞质和细胞器被隔离在自噬体的双膜囊泡内[27]㊂自噬体反过来与溶酶体融合,以促进细胞内容物的降解[28]㊂自噬细胞死亡的特点是没有染色质凝结和细胞质的广泛自噬空泡化[29]㊂自噬的严格调控取决于一组进化保守的基因,如ATG和自噬途径相关蛋白,如Beclin-1共同调节㊂Beclin-1通过与凋亡细胞死亡途径的调节蛋白相互作用,在这两种形式细胞死亡之间的交叉对话中发挥重要作用,动态调节生理和病理生理过程[30]㊂miR-103a-3p能够同时抑制凋亡和自噬减少缺血对心肌细胞的损伤[31]㊂在我们的研究结果中发现,与自噬相关的基因Beclin-1㊁HMGB1和ATG5表达显著上升,凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP也增加,表明ICIs相关心肌炎小鼠心肌细胞中凋亡和自噬水平增加㊂
多肽具有分子量小㊁免疫反应小㊁毒性低等优势,已经成为生物药物研发的热点之一㊂GHRL-12具有改善ICIs相关心肌炎小鼠心功能,减少心肌组。