尿素循环障碍患者家系的基因突变分析及产前诊断

DOI:
10.12280/gjszjk.20200537
张庆华，郝胜菊，王兴，陈雪，周秉博，刘芙蓉，郑雷，冯暄，张钏
【摘要】目的：分析7例尿素循环障碍（urea cycle disorder，UCD）患者家系的基因突变情况，并对2例再
生育家庭进行产前诊断。

方法：联合应用高通量测序（panel）结合Sanger测序、长距离-聚合酶链反应（LD-
PCR）以及多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）等基因检测技术，对7例
疑似UCD患者家系进行相关致病基因突变分析，并对其中2例高风险家系的胎儿羊水标本进行产前基因诊
断。

结果：7例疑似UCD患者均得到明确基因诊断：4例患儿为SLC25A13基因突变引起的新生儿肝内胆汁淤积
症（neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency，NICCD），且1例同时患脊髓性肌萎缩症（spinal
muscular atrophy，SMA）；1例患儿为ASS1基因突变引起的瓜氨酸血症Ⅰ型（citrullinaemia typeⅠ，CTLN1）；2例
患儿为OTC基因突变引起的鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症（ornithine transcarbamylase deficiency，OTCD）。

2家系
再生育时产前诊断结果：1例胎儿为父源SLC25A13致病基因携带者；1例为OTC正常的UCD胎儿。

结论：基因诊
断有助于可疑UCD患者的明确诊断以及分型，部分疑似UCD胎儿可能OTC正常。

对于生育过UCD患儿的家系，
再生育时进行产前基因诊断可积极预防出生缺陷。

【关键词】尿素循环障碍，先天性；瓜氨酸血症；鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症；DNA突变分析；产前诊
断；新生儿肝内胆汁淤积症
Gene Mutation Analysis and Prenatal Diagnosis of Family with Urea Cycle Disorder ZHANG Qing-hua,
HAO Sheng-ju,WANG Xing,CHEN Xue,ZHOU Bing-bo,LIU Fu-rong,ZHENG Lei,FENG Xuan,ZHANG
Chuan.Gansu Province Medical Genetics Center,Gansu Province Maternal and Child Health Care Hospital,
Lanzhou730050,China
Corresponding author:ZHANG Chuan,E-mail:**********************
【Abstract】Objective:To investigate the gene mutations of seven families suspected with urea cycle
disorders(UCD),and to perform prenatal diagnosis for two reproductive families.Methods:Target sequence capture
combined with high-throughput next-generation sequencing,and Sanger sequencing/LD-PCR/MLPA(multiplex
ligation-dependent probe amplification)technologies were used to investigate the gene mutations for seven families
suspected with UCD.After the genotypes of the pedigrees were identified,two amniotic fluid samples from high-
risk pregnant women were used for prenatal genetic diagnosis.Results:The diagnosis of UCD was confirmed in
seven suspected families.Among of them,four patients were diagnosed as the neonatal intrahepatic cholestasis
caused by citrin deficiency(NICCD)and one of them was coexist with spinal muscular atrophy(SMA).One patient
was diagnosed with citrullinaemia typeⅠ(CTLN1).And two patients were diagnosed with ornithine transcarbamylase
deficiency(OTCD).Prenatal genetic diagnosis of two families show that one fetus had a mutation at a heterozygous
mutation of SLC25A13with paternal;and another one was a proband with normal OTC gene.Conclusions:
Genetic diagnostic can make accurate and effective diagnosis of UCD.However,some families with suspected UCD
could have normal OTC gene.The prenatal genetic diagnosis combined with OTC gene testing can prevent the
rebirth defects in high-risk families.
【Keywords】Urea cycle disorders，inborn；Citrullinemia；Ornithine carbamoyltransferase deficiency disease；
DNA mutational analysis；Prenatal diagnosis；Neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency
（ＪＩｎｔＲｅｐｒｏｄＨｅａｌｔｈ蛐ＦａｍＰｌａｎ，2021，40：185-188）
·论著·
基金项目：兰州市人才创新创业项目（2018-RC-95）；国家人口与生
殖健康科学数据中心项目（2005DKA32408）；甘肃省卫生
行业科研计划项目（GSWSKY-2015-22）
作者单位：730050兰州，甘肃省妇幼保健院医学遗传中心
通信作者：张钏，E-mail：**********************
尿素循环（urea cycle，UC）是人体内清除氨的主
要途径，有6种关键酶：鸟氨酸氨基甲酰转移酶
（ornithine carbamoyltransferase，OTC）、N-乙酰谷氨
酸合成酶（N-acetylglutamate synthase，NAGS）、氨甲
酰磷酸合成酶Ⅰ（carbamyl phosphate synthaseⅠ，
CPSⅠ）、精氨酸琥珀酸合成酶（argininosuccinate
synthetase，ASS）、精氨酸代琥珀酸裂解酶（arginine
succinate lyase，ASL）和精氨酸酶（arginase，ARG），两
种转运体（线粒体内膜鸟氨酸转运体和柠檬酸转运
体）的参与，其中任何一个酶或转运体的缺陷都会导
致尿素循环障碍（urea cycle disorder，UCD）[1]。

UCD总
表1
7例UCD 患者的临床表型及基因检测结果
序号性别临床表型
基因基因型（父/母）
疾病名称遗传模式父源性母源性新发性1女颈部柔软，无抵抗，皮肤巩膜黄染，高胆红素血症SLC 25A 13-IVS16ins3kb c.1737G>A
NICCD 合并SMA
AR SMN 1E7-8del E7-8del -AR 2男胆汁淤积，黄疸，肉碱代谢异常，瓜氨酸代谢异常SLC 25A 13
c.1364G>T
c.1660_1661ins16bp -NICCD AR 3女皮肤黄染，高胆红素血症，瓜氨酸指标异常SLC 25A 13 c.1638_1660dup23IVS16ins3kb -NICCD AR 4男胆汁淤积性肝病，血液蛋白不足，低纤维蛋白原血症SLC 25A 13 c.1638_1660dup23IVS16ins3kb -NICCD AR 5男高氨血症，新生儿惊厥，呼吸暂停ASS 1 c.1088G>A
c.787G>A -CTLN1AR 6男新生儿惊厥，代谢性酸中毒，高氨酸血症OTC -- c.958C>T OTCD XL 7
女高氨血症，尿素循环障碍，呼吸衰竭
OTC
-
Exon7-9Del
-
OTCD
XL
注：
AR 为常染色体隐性遗传，XL 为X 染色体连锁遗传。

体发病率在活产婴中约为1∶69000～1∶35000，其中约50%的UCD 伴有新生儿高氨血症，死亡率高达
25%～50%，
存活者会遗留不可逆性神经系统后遗症[2]。

本研究对7例疑似UCD 患儿等进行基因检测，以明确其致病基因及基因分型，对这些患者家系提供遗传咨询及再生育时的产前诊断。

1对象与方法
1.1
研究对象
选取2017年9月—2019年9月在甘肃省妇幼
保健院（我院）收治的患儿，根据临床表现与遗传代谢病串联质谱检测及尿气相分析检测等生化代谢改变高度疑似UCD 患者7例，男4例、女3例，年龄4d ～3个月；经患者监护人签署知情同意书及经医院学术伦理委员会批准后，采集患儿及父母静脉血2～3mL
（乙二胺四乙酸抗凝）进行基因突变分析。

1.2
方法
应用北京天根公司（中国）的基
因组DNA 提取试剂盒，
按照试剂盒说明书进行。

利用遗传代谢病基因检测panel （北京
迈基诺公司）进行高通量测序以明确致病突变，测序平均深度为200×。

对检测到的变异进行过滤筛选，应用PolyPhen2和
MutationTaster 软件对新变异进行蛋白功能预测，新变异致病性判读根据美国医学遗传学与基因组学会2015
指南进行。

①Sanger 测序。

应用Primer5软
件针对变异位点设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

对聚合酶链反应（PCR ）扩增产物用纯化试剂盒纯化后，上机进行测序（ABI3500DX ，美国），应用SeqMan 软件对测序结果与标准序列进行比对分析。

②长距离-PCR （LD-
PCR ）。

使用Long PCR 试剂盒（北京普洛麦格生物技术有限公司）进行PCR 扩增，对扩增产物进行电泳来检测SLC 25A 13基因
IVS16ins3kb 位点突变情况。

③多重连接探针扩增（multiplex ligation-dependent probe amplification ，
MLPA ）技术分析。

对1例OTC 缺乏的患儿通过MLPAP079探针
（MRC-Holland ）进行检测；1例新生儿肝内胆汁淤积症（neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency ，NICCD ）疑似合并脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy ，
SMA ）先证者通过P060探针（MRC-Holland ）
进行检测；按照试剂盒说明书操作完成MLPA 反应。

MLPA 反应产物在ABI3500DX 测序仪上进行毛细管电泳。

电泳结果采样MLPA 数据分析专用软件Coffalyser
进行分析。

患儿母亲再孕时，孕18～21周经腹行羊膜
腔穿刺，抽取羊水15mL 行先证者突变位点检测。

2结果
2.1
患者基因测序分析结果
例1检测到
SLC 25A 13基因自发杂合突变c.1737G>A ；例2检测到SLC 25A 13基因父源杂合突变c.1364G>T ，检测到母源杂合突变c.1660_1661ins16bp ；例3检测到
SLC 25A 13基因父源杂合突变c.1638_1660dup23；例4检测到SLC 25A 13基因父源杂合突变c.1638_1660dup23；例5检测到ASS 1基因父源杂合突变c.1088G>A ，检测到母源杂合突变c.787G>A ；例6检测到OTC 基因自发半合子突变c.958C>T 。

见表1。

例1及其母亲、例3及其
母亲、例4及其母亲均检测到SLC 25A 13基因杂合突变IVS16ins3kb 。

见表1。

P060探针在例1上检测到
SMN 1基因E7-8del 纯合突变，其父母均为杂合突变携带者。

P079探针在例7上检测到OTC 基因杂合突变Exon7-9Del ，
其母亲为7-9外显子的杂合性缺失突变携带者，例7和其母亲均检测到杂合突变，但母亲未
患病。

见表1。

通过分子检测，
7例疑似UCD 患儿得到了明确分型：4例为NICCD （57%），
1例为瓜氨酸血症Ⅰ型（CTLN1，
14.3%），2例为鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症（ornithine carbamoyltransferase deficiency ，
OTCD ，28.7%），见表1。

本研究共发现3个UCD 相关致病基因：SLC 25A 13、ASS 1和OTC ，发现相应的9个等位基因突
表27例UCD 患者家系主要基因突变类型及频率
基因名称
碱基改变
氨基酸改变突变类型频数HGM Ｄ（+/-）clinvar
（+/-）SLC 25A 13c.1737G>A
p.W579X 无义突变1+-IVS16ins3kb -插入突变3++c.1638_1660dup23p.A554Gfs*17移码突变2++c.1364G>T
p.R455L 错义突变1+-c.1660_1661ins16bp p.A554Gfs*17
移码突变1-+ASS 1 c.787G>A p.V263M 错义突变1++c.1088G>A p.R363Q 错义突变1++OTC
c.958C>T p.R320X 无义突变1+-Exon7-9Del
-
缺失突变
1
+
+
注：HGMD 为人类基因突变数据库（ ），clinvar 网址https:///clinvar/。

变，包括3种错义突变、2种移码突变、1种无义突变、1种插入突变，1种缺失突变。

其中突变频率最高的是
SLC 25A 13基因IVS16ins3kb 等位基因突变，
见表2。

2.2产前诊断结果分析例2和例6家系再次妊娠
时，在孕19周通过羊水穿刺进行了产前基因诊断：例2家系胎儿检测到SLC 25A 13基因c.1364G>T 父源致
病基因携带变异，见图1A 和图1B
（见后插一）；例6家系胎儿未检测到与先证者相同的OTC 基因c.958C>T 半合子突变，见图1C 见后插一）。

经遗传咨询后，告知这两家系胎儿患病风险较低，这两家系均选择了继续妊娠，胎儿随访至生后1个月，足跟血串联质谱检查未见异常，发育良好。

3讨论
3.1基因检测可对UCD 患儿进行精确分型UCD 是一组遗传代谢病，患儿的体征、临床表现未见特异性，难以进行鉴别诊断。

因此对相关致病基因进行基因诊断尤为重要。

本研究通过对7例疑似UCD 患儿进行基因诊断后，发现5例瓜氨酸血症（4例NICCD 及
1例CTLN1）和2例OTCD 。

其中病例1较罕见，
除SLC 25A 13基因复合杂合突变外还伴有SMN 1基因外显子7和8纯合缺失，该患儿共患NICCD 及SMA 。

3.2
UCD 致病基因的异质性
瓜氨酸血症是一组
通常表现为神经精神症状及血清中瓜氨酸和氨浓
度升高的UCD ，通常分为Ⅱ型（NICCD ）和Ⅰ型（CTLN1），分别为SLC 25A 13和ASS 1双等位基因变异导致的常染色体隐性遗传病[3]。

瓜氨酸血症Ⅱ型（NICCD ）由SLC 25A 13基因突变所致。

其发病率具有地域性差异，在我国南方约
1/9200，北方约1/3500000，我国呈南高北低趋势。

同时，NICCD 致病基因的携带率及突变类型亦有差
异：SLC 25A 13基因杂合子携带率在日本、韩国人群中分别为1/69、1/50[4]，
中国人群中为1/63；已报道的SLC 25A 13基因致病突变类型超过90种，
而中国人群中c.851_854delGTAT 、
c.1638-1660dup23、c.615+5G>A 、IVS16ins3kb 和c.1399C>T 等5个突变约占85.40%的突变等位基因，构成中国人普遍存在的SLC 25A 13突变[5]。

本研究共检测出4例NICCD 患儿，发现5种SLC 25A 13等位基因变异
（IVS16ins3kb 、c.1638-1660dup23、c.1364G>T 、c.1737G>A 和c.1660_
1661ins23），其中IVS16ins3kb 和c.1638-1660dup23与研究报道其在中国人群高发[4]相符。

此外，上述变
异存在地域差异，如：
IVS16ins3kb 作为一种转座后插入突变，在日本较为常见[6]，在中国北方人群高于南方；c.1364G>T 在中国北方较为常见；而c.1638-1660dup23的相对频率在中国不同区域则相对一致[7]。

本研究4例NICCD 患儿中，有3例均有SLC 25A 13基因IVS16ins3kb 杂合突变（3/4），与在中国北方较为常见的趋势一致。

瓜氨酸血症Ⅰ型（CTLN1）是由于ASS 基因突变所致，是UCD 中第三大类型，发病率约为1/200000～
1/44300[3]。

其致病基因ASS 1基因突变频率具有一
定的地域性分布差异，且不同基因与临床表型严重程度有关。

本研究共发现2个ASS 1等位基因错义突变，分别为c.787G>Ａ（ｐ．Ｖａｌ２６３Ｍｅｔ）和c.1088G>A （ｐ.Arg363Trp)。

有研究报道ASS 1基因携带亦存在地
域性差异：p.Arg363Trp 在德国（包括德国人和居住
在德国的土耳其人）患者中的携带率为13.5%；而p.Val263Met 在土耳其患者中携带率为7.9%[8]。

本研究中因ASS 1等位基因变异较少，突变频率是否存在地区性差异有待后续进一步分析。

同时，有研究报道p.Val263Met 等位基因复合杂合或纯合突变情况下多表现为迟发和（或）轻度瓜氨酸血症[9]。

本研究中患者目前仅主要表现为血清瓜氨酸指标等异常增高；未见其他显著临床表现，临床表型与这一等位基因复合杂合变异表型相符，故而，对于这种轻型或迟
发型CTLN1，
基因诊断显得更加重要，及时应用基因诊断明确变异类型，高度重视予以积极治疗及预防，
可有效避免突发异常的出现。

OTCD 由OTC 基因突变引起，是UCD 中最常见的亚型，平均发病率为7.1/100000，属于X 连锁不完全显性或X 连锁隐性遗传代谢病；OTCD 的临床表现主要与酶的残余活性相关。

目前OTC 基因已报道超过400种基因突变类型[10]。

本研究共发现2个OTC 等位
基因分别为c.958C>T和外显子7-10缺失；其中无义突变c.958C>Ｔ（ｐ．Ｒ３２０Ｘ）为一男性半合子突变患儿，该男性患者病情较重，主要是由于OTC基因携带在X 染色体上，这一酶的活性在男孩体内完全失活，导致急性氨中毒，该临床表型与XL基因变异遗传模式相符；而另一等位基因变异外显子7-10缺失，为一女性杂合子突变患儿。

通常女性杂合子突变，临床表现高度多样，约15%患者发病；多数杂合子携带者不出现高氨血症[11]。

由于实验条件限制，本研究没有做X染色体随机失活检测，但笔者推测例7正常的那条X染色体发生了非随机失活，从而导致了疾病的发生[12-13]。

3.3产前基因诊断可避免患儿出生本研究为2个再生育家系提供产前基因诊断：例2家系胎儿检测到SLC25A13基因c.1364G>T父源携带突变；例6家系胎儿未检测到与先证者相同的OTC基因c.958C>T半合子突变。

2个家庭均选择了继续妊娠，出生后随访至1个月，生化指标及发育状况均正常。

综上，笔者对7例疑似UCD患儿进行了基因分析，明确了其治病原因，并对两患者家系再生育时进行了产前诊断。

通过高通量测序技术对患者进行基因分型后可及早给予干预治疗，可为遗传咨询及产前诊断提供可靠依据[14-16]；进而在致病基因明确的前提下，通过产前诊断或胚胎植入前单基因病检测（PGT-M）有效预防出生缺陷。

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doi:10.1186/s13023-018-0908-1.
（收稿日期：2020-09-16）
[本文编辑王琳]
石家庄地区新生儿Citrin 蛋白缺乏症串联质谱筛查结果分析
（正文见第182页）
注：A 为c.1021+1G ＞A ；B 为c.851_854delTATG 。

图1例1患儿的SLC 25A 13基因突变检测结果
尿素循环障碍患者家系的基因突变分析及产前诊断
（正文见第185页
）
图1产前诊断测序图
C 例6家系OTC 基因变异c.958C ＞T
B 例2家系SL
C 25A 13基因变异c.1660_1661ins
A 例2家系SLC 25A 13基因变异c.1364G ＞
T A
B
胎儿埃布斯坦畸形一例
（正文见第196页
）
图1三尖瓣发育畸形图2三尖瓣返流
·后插一·
先证者
父亲
母亲
胎儿。