产碱性蛋白酶菌株的筛选与诱变育种

产碱性蛋白酶菌株的筛选与诱变育种
郑津辉
【摘要】为获得性状稳定、高产的碱性蛋白酶菌株,采用平板诱变法对产碱性蛋白酶菌株进行诱变处理.结果表明,采用牛奶平板法及Folin测酶活法从鸡粪土样获得产碱性蛋白酶出发菌株.该菌株经亚硝基胍(NTG)诱变并利用利福平抗性株筛选获得蛋白酶活力为出发菌株34,65倍的2个变异株.因此,利用亚硝基胍作为诱变剂可产生高产酶菌株.
【期刊名称】《华北农学报》
【年(卷),期】2015(030)005
【总页数】3页(P122-124)
【关键词】碱性蛋白酶;筛选;诱变育种
【作者】郑津辉
【作者单位】天津师范大学生命科学学院,天津300387
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.97
蛋白酶是一种重要的工业化应用的酶制剂，占酶制剂市场的65%以上，广泛用于洗涤剂、制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学工业、废物处理等行业。

碱性蛋白酶的最适反应pH 值一般大于9.0，是目前市场上最为广泛使用的蛋白酶。

微生物具有生长速度快，生长条件简单、代谢过程特殊和分布广等特点，使之成为
生物酶的重要来源［1－2］。

又由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动物、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单，价格低廉、来源广、菌易培养、同时易于实现工业化大批量生产的特点。

而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性，有一定的酯酶活力。

因此，碱性蛋白酶研究已成为蛋白酶研究的热点。

在全世界生产所有种类的酶中，碱性蛋白酶占总产量的37%左右，其中以微生物源的蛋白酶研究最为广泛，尤其是芽孢杆菌属菌株［3］。

当前国外碱性蛋白酶高产菌株的选育主要用基因工程技术和蛋白质工程手段进行工业微生物菌种的定向选育，目的性强，而且酶结构研究也比较深入。

目前，我国碱性蛋白酶研究总体趋势发展较好，主要集中在高耐温碱性蛋白酶和常温碱性蛋白酶，但酶活力不高仍是当前工业化生产的一个最主要的限制因素。

利用物理、化学因子单独或复合诱变选育高活力菌株是菌种选育的一种好方法。

以往试验多从观察蛋白水解圈大小来优选产碱性蛋白酶的菌株，或从改变培养条件入手来提高酶的产量，本试验侧重点是经过初筛和复筛的优选，采用亚硝基胍(NTG)为化学诱变剂，以利福平抗性为辅助筛选标记，通过选择抗利福平的菌株筛选获得RNA 聚合酶体变异株，增加酶产量，并以此筛选出高产酶菌株。

1 材料和方法
1.1 材料与仪器
菌种:产碱性蛋白酶菌株从天津市武清区农家鸡粪土壤中提取，枯草芽孢杆菌由天津师范大学生命科学院微生物教研室提供。

培养基:牛奶平板(初筛培养基)、发酵培养基(复筛培养基)。

试剂:硼砂、氢氧化钠、酪氨酸、碳酸钠、三氯醋酸、Folin 试剂、利福平、亚硝基胍均为分析纯试剂，购自华生生物公司。

仪器:UV 2250 紫外/可见光光度计(日本岛津)，ZHWY-110X50 恒温振荡水浴箱(上海旦鼎公司)，DH5000-II 恒温培养箱(上海博迅公司)。

1.2 初筛
参照文献［4－5］的方法，取0.5 g 土样于无菌水中配置成菌悬液，取0.2 mL 适当浓度涂布于初筛牛奶平板上，37 ℃培养30 h 后，挑取形成透明圈的单菌落分离纯化得到初筛菌株。

1.3 复筛
初筛菌株点接于牛奶平板，37 ℃培养24 h 后，测定水解圈直径(D)和菌落直径(d)的大小，选取D/d 比值较大的菌株为复筛菌株。

复筛菌株接种于发酵培养基，37 ℃、200 r/min 摇床培养48 h 后于3 000 r/min，离心15 min，上清即为粗酶液。

取适量粗酶液采用Folin 法［6－7］测定其蛋白酶活力，酶活力以碱性蛋白酶活力单位U/mL 表示，即以每毫升或每克样品在40 ℃，pH 值为11 的碱性条件下，每分钟水解酪蛋白所产生的酪氨酸质量以μg 来表示，重复3 次取均值。

1.4 亚硝基胍(NTG)诱变及利福平抗性筛选
将复筛菌株分别接种到肉汤培养基中于37 ℃、200 r/min 摇床培养12 ～16 h，参考文献［8］。

取0.1 mL 菌液涂于牛奶平板上，待表面液体渗入牛奶平板后，用灭菌牙签取少量NTG 粉末点在之前标记的位置，待粉末湿润后，于37 ℃恒温箱中培养24 h，至标记处出现明显抑菌圈，选取抑菌圈明显的菌株接于5 mL 肉汤中，37 ℃、200 r/min 培养2 ～6 h，即为活化和扩大培养。

分别将稀释诱变菌液的每个浓度梯度涂布到含利福平终质量浓度为0，10，20 μg/mL 的牛奶平板上，培养2 ～3 d 观察透明圈直径。

将出现水解圈明显的诱变菌接种到含相应利福平浓度的发酵培养基中于37 ℃、200 r/min 摇床培养48 h 后测定其粗酶液蛋白酶活力，参考文献［9－10］。

粗酶液的酶活力测定各重复3 次取均值。

2 结果与分析
2.1 诱变前的酶活力筛选结果
根据吸光度值计算复筛后产碱性蛋白酶比较高的菌株的酶活力，见表1，菌5、菌
7 及对照菌的酶活力分别是(12.5±0.82)，(6.61±1.25)，(316.22±4.35)U/mL。

表1 未经诱变的菌5、菌7 和对照菌的碱性蛋白酶活力比较数据Tab.1 Comparison of the alkaline protease activity among the bacteria without mutagenic of bacteria 5，7 and the control bacteria U/mLBacte菌ria株strain 1 Bac菌te 2 r 5 ia 5 3 1 Bac菌t2e r 7 ia 7 3 1枯草C(2o对 n tr照ol 菌)3 OD 值(680 nm)OD value 0.34 0.5 0.33 0.28 0.26 0.23 1.50 1.4 1.5酶活力/(U/mL)Protease activity 12.04 13.45 12.01 8.03 6.12 5.69 313.17 321.2 314.3平均酶活力/(U/mL)Average value 12.5±0.82 6.61±1.25 316.22±4.35
2.2 亚硝基胍诱变及利福平抗性筛选结果
亚硝基胍诱变结果如图1 所示，NTG 点置的周围没有菌生长，随着NTG 向周围
扩散，浓度降低，小剂量时达到诱变效应，从NTG 诱变抑菌圈边缘刮取的菌苔即为诱变菌。

图1 筛选亚硝基胍诱变下的菌株Fig.1 The screening of NTG mutagenesis strains
利福平抗性的诱变菌株酶活力比较结果如表2。

经诱变的菌株在有利福平和没加利福平的培养基中，酶活力在对应的利福平浓度下有变化，菌5 在利福平浓度0
μg/mL 时酶活力(125.60±1.98)U/mL，在利福平浓度10，20 μg/mL 时酶活力分别为(381.40±6.60)，(425.20±14.20)U/mL。

菌7在利福平浓度0 μg/ml 时酶活力为(106.50±1.80)U/mL，在利福平浓度10，20 μg/mL 时酶活力分别为(433.62±8.97)，(12.90±0.30)U/mL。

菌5 和菌7 诱变菌株最适生长的利福平浓
度分别为20，10 μg/mL。

诱变前后菌株酶活力对比结果如图2，可看到出发菌5、菌7 的酶活分别是12.5，6.61 U/mL，经诱变后分别为(425.20±14.20)，(433.62±8.97)U/mL。

该菌株经
亚硝基胍(NTG)诱变并利用利福平抗性株筛选获得蛋白酶活力分别为出发菌株34，
65 倍的2 个变异菌株。

表2 不同利福平浓度发酵液的诱变菌株酶活力比较数据Tab.2 Comparison of activity of mutant enzymes in different concentration of rifampicin fermentation liquid利福平浓度菌株/(μg/mL)OD680酶活力/(U/mL)Bacteria strainRifampicinOD valueEnzyme activity concentration菌5 Bacteria 5 0 0.64 125.60±1.98 10 1.20 381.40±6.60 20 0.90 425.20±14.20菌7 Bacteria 7 0 0.58 106.50±1.80 10 1.45 433.62±8.97 20 0.45 12.90±0.30枯草(对照菌) 0 2.00 453.77±4.55 Control 20 0.60 264.30±4.41
图2 菌5、菌7 和枯草芽孢杆菌诱变前后菌株酶活力对比结果Fig.2 Comparison of the enzyme activity among Bacillus subtilis strain 5，7 and Bacillus subtilis
2.3 亚硝基胍诱变效应分析
NTG 点置的周围没有菌生长，因为高浓度的NTG 能杀死周围的菌，只有周围低浓度下生长出来的菌才可能是诱变菌，同时诱变菌要经活化和扩大培养。

因刚诱变处理后的菌株，有一个表现迟滞的过程，需要3 代以上的繁殖将突变性状表现出来。

这样在液体培养基中培养几个小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代以获得纯的变异细胞，使稳定的变异显现出来，以免形成变异和不变异的混杂菌落同时存在，造成筛选结果的不稳定和将来菌株的退化。

2.4 利福平抗性作为辅助筛选标记分析
经过活化培育后的菌悬液进行适当稀释后涂布到含有不同浓度的利福平牛奶平板表面，以利福平抗性作为辅助筛选标记，因为利福平是一种转录抑制剂型抗生素，可通过与RNA 聚合酶的β 亚基结合而抑制转录的起始过程，通过选择抗利福平的菌株有可能筛选获得RNA 聚合酶体变异株，以提高转录水平，增加酶产量。

从表2 可以看出，经诱变的菌株在有利福平和没加利福平的培养基中，酶活力在对应的利
福平浓度下有很大的变化。

说明含有利福平的平板上获得了抗利福平的菌株，也就是RNA 聚合酶体变异株，大大提高了酶产量，而淘汰了在没加利福平的平板上转录水平低的菌株。

而作为对照菌株枯草芽孢杆菌，因其本身是产碱性蛋白酶高效菌株，所以受利福平浓度影响不大。

菌5 在利福平浓度为20 μg/mL 时酶活力最高，而菌7 在利福平浓度为10 μg/mL 时酶活力最高，而在20 μg/mL 时大大降低，
可能是高浓度下转录抑制起了作用。

同时看到经亚硝基胍诱变的菌株其碱性蛋白酶活力明显提高。

3 结论与讨论
采用亚硝基胍(NTG)为化学诱变剂，以利福平抗性为辅助筛选标记，能有效地筛选到2 个高产碱性蛋白酶菌株菌5 和菌7，同时不同的利福平浓度对酶活力是有影
响的。

菌5 在利福平浓度20 μg/mL时酶活力最高，为(425.2±14.20)U/mL。

菌
7 在利福平浓度10 μg/mL 时酶活力最高，为(433.62±8.97)U/mL。

它们的酶活
力分别比出发菌株提高了34，65 倍。

由此可见，通过化学因子诱变和优化发酵条件选育高活力菌株的确是一种切实可行的办法。

本试验证实利福平是有效辅助筛选标记的，且利福平价格低廉，毒性低，稳定可靠，可以作为普遍筛选变异菌株的较好试剂。

我国的碱性蛋白酶研究较国外晚，目前，对其研究技术主要有传统的诱变技术、基因工程、蛋白质工程、孢子热处理等［11－12］。

但无论何种方法，能保证菌株
性能的稳定性还是我们今后要做的进一步研究工作。

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