一株除臭细菌的筛选及鉴定

一株除臭细菌的筛选及鉴定
吴翔１，２，余洋１，２，谢丽源１，２㊀
（１．四川省食用菌研究所，四川成都６１００６６；２．国家农业微生物新都观测实验站，四川成都６１００６６）
摘要㊀［目的］筛选获得分类地位明确㊁具有较好除臭效果的微生物菌株㊂［方法］通过平板涂布法从鸡粪发酵料中筛选具有除臭效果的菌株，并检测各菌株对鸡粪中氨气和硫化氢的降解率㊂通过表型特征㊁生理生化特征和遗传特征等多相分析来确定目的菌株的分类地位㊂［结果］筛选获得一株除臭细菌３－１，对氨气和硫化氢的降解率分别达到了６３．０８％和６２．８０％㊂鉴定结果表明，细菌３－１为原磷谷氨酸杆菌（Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ），在ＧｅｎＢａｎｋ核酸登录号为ＯＭ８１６７３０㊂［结论］菌株３－１在无害化处理畜禽粪污方面具有一定的应用前景㊂
关键词㊀除臭细菌；筛选；鉴定
中图分类号㊀Ｘ１７２㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２３）０６－００５８－０３
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．０６．０１６㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ
）：ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａＤｅｏｄｏｒａｎｔＢａｃｔｅｒｉａｌＳｔｒａｉｎ
ＷＵＸｉａｎｇ１，２，ＹＵＹａｎｇ１，２，ＸＩＥＬｉ⁃ｙｕａｎ１，２㊀（１．ＳｉｃｈｕａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｄｉｂｌｅＦｕｎｇｉ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ６１００６６；２．ＮａｔｉｏｎａｌＯｂｓｅｒｖｉｎｇａｎｄＥｘ⁃ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔａｔｉｏｎｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｉｎＸｉｎｄｕ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ６１００６６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｏｓｃｒｅｅｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｔｒａｉｎｓｗｉｔｈｃｌｅａｒｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓａｎｄｇｏｏｄｄｅｏｄｏｒｉｚａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔ．［Ｍｅｔｈｏｄ］Ｓｔｒａｉｎｓｗｉｔｈｄｅｏｄｏｒｉ⁃ｚａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｍａｎｕｒｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍａｔｅｒｉａｌｓｂｙｐｌａｔｅｃｏａｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｓｏｆａｍｍｏｎｉａａｎｄｈｙ⁃ｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｉｄｅｉｎｃｈｉｃｋｅｎｍａｎｕｒｅｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄ．Ｔｈｅｔａｘｏｎｏｍｉｃｓｔａｔｕｓｏｆｔｈｅｔａｒｇｅｔｓｔｒａｉｎｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｍｕｌｔｉｐｈａｓｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｔｈｅｓｔｒａｉｎ３－１ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇｄｅｏｄｏｒｉｚｉｎｇｆｕｎｃ⁃ｔｉｏｎｓｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄ，ｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆＮＨ３ａｎｄＨ２Ｓｒｅｍｏｖｅｄｗｅｒｅ６３．０８％ａｎｄ６２．８０％．Ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂａｃｔｅｒｉａ３－１ｗａｓＧｌｕ⁃ｔａｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉａｅ，ａｎｄｔｈｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｎｕｍｂｅｒｉｎＧｅｎＢａｎｋｗａｓＯＭ８１６７３０．［Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ］Ｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎ３－１ｈａｖｅｇｒｅａｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｔｈｅｈａｒｍｌｅｓｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｌｉｖｅｓｔｏｃｋｍａｎｕｒｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｄｅｏｄｏｒａｎｔｂａｃｔｅｒｉａｌ；Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
基金项目㊀成都市重点研发支撑计划项目（２０２２ＹＦ０５００９５６ＳＮ）；四川省
农业科学院国际科技交流合作提升行动计划项目（２０２１ＺＳＳＦＧＨ０５）㊂
作者简介㊀吴翔（１９８１ ），女，四川理县人，副研究员，博士，从事土壤
微生物研究㊂
收稿日期㊀２０２２－０５－０６
㊀㊀随着经济发展，人民生活水平的提高，对肉㊁蛋㊁奶等产品的需求越来越大，促进了畜禽养殖业的快速发展㊂而畜禽养殖业的发展必然增加畜禽粪污产生的量，给环境带来新的压力㊂其中畜禽粪便中含有的大量蛋白质㊁氨基酸等营养物质被分解为ＮＨ３㊁Ｈ２Ｓ等恶臭气体［１］，这些气体会引起周围强烈的刺激性，损害吸入群体的人身健康㊂目前对这些恶臭气体主要的处理方法有物理法㊁化学法和生物法
［２－６］
，而生物
法主要通过微生物降解㊁转化恶臭成分，具有成本低㊁不易产生二次污染等优点，因此是解决恶臭气体重要的研究方向㊂该研究从鸡粪发酵物中筛选降解ＮＨ３和Ｈ２Ｓ的微生物菌株，为后续研发除臭剂打下基础㊂１㊀材料与方法
１．１㊀培养基㊀含氮富集液体培养基
［７］
：蔗糖２５ｇ，ＮＨ４ＮＯ３
２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４２ｇ，ＮａＣｌ２ｇ，ＦｅＳＯ４０．１ｇ，ＣａＣｌ２０．５ｇ，ＺｎＳＯ４
０．０５ｇ，ＭｇＳＯ４㊃７Ｈ２Ｏ０．５ｇ，蒸馏水９５０ｍＬ，灭菌后的鸡粪浸出液５０ｍＬ，ｐＨ７．５ ８．０㊂ＬＢ培养基：胰蛋白胨１０ｇ，酵母提取物５ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，琼脂粉１８ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ７．４㊂产气检测培养基
［８］
：蔗糖２ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，蛋白胨１０ｇ，酵母浸
出粉５ｇ，琼脂粉１８ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ６．５ ７．０㊂
１．２㊀样品采集及处理㊀在成都市大邑县㊁邛崃市采集鸡粪发酵物共计５个，称取样品各５ｇ分别置于富氮液体培养基中进行富集培养，放入３０ħ㊁１２０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡，３ｄ后在转接
到新鲜的培养液中培养，连续转接３次㊂
１．３㊀菌株筛选㊀将富集后的培养液进行梯度稀释，选取适宜稀释度的稀释液０．１ｍＬ，采用平板涂布法涂布于ＬＢ培养基上，于３０ħ的恒温培养箱倒置培养，待菌长出后将纯化后的单个菌株接种到产气培养基，利用石蕊试纸和醋酸铅试纸检测各菌株的产气情况，菌株生长过程中产生ＮＨ３红色石蕊试纸将变为蓝色，产生Ｈ２Ｓ气体醋酸铅试纸将变为黑色［９］㊂参照李玥等［８］的方法，再次检测２种气体产气试验都不变色菌株的除氨和除Ｈ２Ｓ能力，确定筛选目标菌株㊂
１．４㊀菌株鉴定
１．４．１㊀显微形态和培养形态特征分析㊂将筛选所得的目标菌株于ＬＢ培养基上划线培养，于培养箱３０ħ培养１８ｈ，观察菌株形态特征，并对菌落形态拍照；挑取单菌落进行革兰氏染色，并于光学显微镜下观察其显微形态㊂
１．４．２㊀生理生化特征分析㊂菌株大部分生理生化特征利用ＢｉｏｌｏｇＧｅｎⅢ型细菌鉴定仪的微孔板检测，具体按照ＢｉｏｌｏｇＧｅｎⅢＭｉｃｒｏＰｌａｔｅＴＭ使用说明书步骤操作，其微孔板布局如图１所示㊂其他生理生化试验检测内容参照赵斌等［１０］的‘微生物学实验“进行操作㊂将ＬＢ培养基ＮａＣｌ含量调节为１％㊁４％㊁８％和１０％（ｗ／ｖ），ｐＨ分别调节为５㊁６㊁７㊁８㊁９㊁１０㊁１１，检测菌株生长ｐＨ范围和ＮａＣｌ耐受情况，检测菌株在７㊁１５㊁２５㊁
３０㊁４０㊁４５和５０ħ条件下的生长情况㊂
１．４．３㊀菌株１６ＳｒＲＮＡ基因序列的测定及系统发育树构建㊂参照细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒（杭州博日科技有限公司）的说明书提取细菌基因组ＤＮＡ㊂用细菌通用引物（正向引物２７Ｆ５ᶄ－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３ᶄ，反向引物１４９２Ｒ
㊀㊀㊀
安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２３，５１（６）：５８－６０
５ᶄ－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３ᶄ）参照张飞官等［１１］的方法扩增菌株１６ＳｒＤＮＡ㊂ＰＣＲ产物在生工生物工程（上海）有限公司进行测序㊂将测得的１６ＳｒＲＮＡ基因序列提交到Ｇｅｎ⁃
Ｂａｎｋ，获得各菌株的登录号㊂参照张越己等［１２］的方法构建系统发育树
㊂
图１㊀ＢｉｏｌｏｇＧＥＮⅢＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ微孔板测试布局
Ｆｉｇ．１㊀ＴｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｉｎｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓｏｆＢｉｏｌｏｇＧＥＮⅢＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ
２㊀结果与分析
２．１㊀菌株的分离㊀从５个鸡粪发酵物样品中分离获得５２株菌株，其中细菌３８株，放线菌１４株㊂在利用试纸检测各菌株产生ＮＨ３和Ｈ２Ｓ气体的过程中发现，有５株细菌同时不产生ＮＨ３和Ｈ２Ｓ，它们分别是３－１㊁３－２㊁４－３㊁５－２㊁５－４，分别检测了这５株菌的除氨和除Ｈ２Ｓ能力，结果如表１所示，从表１
可看出，菌株３－１的除氨率和除硫化氢率均为５个菌株中最高的，分别达到了６３．０８％和６２．９８％，因此选该菌为最优的目的菌株确定其分类地位㊂２．２㊀菌株的鉴定
２．２．１㊀形态特征㊂菌株３－１是革兰氏阳性的好氧细菌，在ＬＢ培养基上的菌落呈现出隆起㊁边缘整齐的形状，菌株表面湿润，无可溶性色素，菌株为乳白色，培养过程中菌株颜色无变化，无金属光泽，在光学显微镜下观察发现该菌呈现杆状，如图２所示㊂
表１㊀菌株除臭结果
Ｔａｂｌｅ１㊀Ｄｅｏｄｏｒｉｚａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｏｆｓｔｒａｉｎｓ
处理Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ产生氨量ＡｍｏｕｎｔｏｆＮＨ３ｐｒｏｄｕｃｅｄｍｇ／ｋｇ除氨率Ａｍｍｏｎｉａｒｅｍｏｖａｌｒａｔｅʊ％产生硫化氢量ＡｍｏｕｎｔｏｆＨ２Ｓｐｒｏｄｕｃｅｄｍｇ／ｋｇ除硫化氢率
Ｈ２Ｓｒｅｍｏｖａｌｒａｔｅʊ％ＣＫ７４９．３３ʃ１２．３６１．８１ʃ０．０４３－１２７６．６７ʃ５．７９６３．０８０．６７ʃ０．０４６２．９８３－２４６８．６７ʃ９．２９３７．４５１．２３ʃ０．０２３２．０４４－３４３５．３３ʃ１３．２７４１．９０１．３４ʃ０．０１２５．９７５－２５２３．００ʃ１１．５２
３０．２０１．４６ʃ０．０３１９．３４５－４
５２４．６７ʃ６．８０２９．９８
１．３７ʃ０．０５
２４．３１
图２㊀菌株３－１在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态（ａ）和光学显微形态（ｂ）
Ｆｉｇ．２㊀Ｃｏｌｏｎｙｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ（ａ）ａｎｄｏｐｔｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ（ｂ）ｏｆｓｔｒａｉｎ３－１ｏｎｂｅｅｆｅｘｔｒａｃｔｐｅｐｔｏｎｅｍｅｄｉｕｍ
２．２．２㊀生理生化特征㊂菌株３－１培养２２ｈ后在Ｂｉｏｌｏｇ鉴定板上的鉴定结果如图３所示㊂将该菌ＧｅｎⅢ鉴定板上的鉴定结果在数据库中比对，未发现有与该菌结果具有匹配可能性的菌株，距离最近的菌为Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，但与该菌的相似度（ＳＩＭ）为０．２１２，距离（ＤＩＳＴ）为１０．２５３，无匹配可能性㊂
鉴定结果表明该菌具有一定的耐酸性和耐盐性，可在ｐＨ低至５和含８％ＮａＣｌ的培养液中生长，生长温度是１５ ３０ħ㊂可利用糊精㊁Ｄ－麦芽糖㊁Ｄ－纤维二塘㊁蔗糖㊁Ｄ－松二糖㊁水苏糖㊁棉子糖㊁蜜二塘㊁Ｄ－水杨酸㊁Ｎ－乙酰神经氨酸㊁Ｄ－葡萄糖㊁Ｄ－果糖㊁Ｄ－甘露醇㊁Ｄ－阿拉伯醇㊁甘油㊁Ｌ－丙氨酸㊁Ｌ－天冬氨
９
５５１卷６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀吴翔等㊀一株除臭细菌的筛选及鉴定
酸㊁Ｌ－谷氨酸㊁Ｌ－焦谷氨酸㊁Ｌ－丝氨酸㊁果胶等生长
㊂
图３㊀菌株３－１在鉴定板上的反应结果Ｆｉｇ．３㊀Ｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｏｆ３⁃１ｉｎｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ
２．２．３㊀菌株１６ＳｒＲＮＡ基因部分序列分析㊂菌株３－１的１６Ｓ
ｒＲＮＡ基因部分序列长度为１４２４ｂｐ，在ＧｅｎＢａｎｋ核酸登录号为ＯＭ８１６７３０㊂根据菌株３－１系统发育分析，菌株３－１属于贝氏谷氨酸杆菌属（Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒ）细菌，与该属菌株原磷谷氨酸杆菌ＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅＤＳＭ２０１６８系统发育关系最近，其１６ＳｒＲＮＡ基因相似性为９９．９３％；其次是菌株ＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒｓｏｌｉＳＹＢ２，相似性为９９．０７％；通过邻接法构建的基于菌株３－１相关菌株１６ＳｒＲＮＡ基因部分序列的系统发育树如图４所示㊂结合其形态特征㊁生理生化特征和１６ＳｒＲＮＡ基因部分序列分析结果［１３］，初步判定菌株３－１属于原磷谷氨酸杆菌（Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）㊂
３㊀讨论
在已有的降解畜禽粪污臭气方面的研究中，发现具有这
类功能的微生物主要包括芽孢杆菌［１４］㊁镰刀菌［１５］㊁酵母
图４㊀通过邻接法构建的基于菌株３－１及相关菌株１６ＳｒＤＮＡ序列的系统发育树
Ｆｉｇ．４㊀Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎ１６ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｓｔｒａｉｎ３⁃１ａｎｄｏｔｈｅｒｒｅｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃ｊｏｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄ
菌［１６
－１７］
等，该研究所得的降解氨气和硫化氢的菌株为原磷谷
氨酸杆菌（Ｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ），已有的报道中该类菌主要具有产生Ｌ－谷氨酸㊁谷氨酸等功能［１７］，鲜有该类菌用于降价畜禽粪污臭气成分的报道㊂该研究筛选出的菌株３－１对氨气和硫化氢都有较好的去除效果，具有研发为功能菌
株生产除臭剂的潜力，为除臭菌剂的研发等后续研究打下了基础㊂参考文献
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［１３］ＢＵＳＳＥＨＪ．ＲｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅｔａｘｏｎｏｍｙｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ，ｅｍｅｎｄａ⁃
ｔｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｅｎｓｕｌａｔｏ，ｐｒｏｐｏｓａｌｔｏｒｅｃｌａｓｓｉｆｙｓｅｌｅｃｔｅｄｓｐｅｃｉｅｓｏｆｔｈｅｇｅｎｕｓＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｈｅｎｏｖｅｌｇｅｎｅｒａＧｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒｇｅｎ．ｎｏｖ．，Ｐａｅｎｉｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒｇｅｎ．ｎｏｖ．，Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｔａｍｉｃｉｂａｃｔｅｒｇｅｎ．ｎｏｖ．，Ｐａｅｎａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｅｎ．ｎｏｖ．，ａｎｄＰｓｅｕｄａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｅｎ．ｎｏｖ．，ａｎｄｅ⁃ｍｅｎｄｅｄｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｒｏｓｅｕｓ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｊｏｕｒｎａｌｏｆｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６，６６（１）：９－３７．
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ｇｌｙｃｏｓｙｌ１⁃ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｏｌｙｍｅｒｓａｎｄｔｅｉｃｈｕｌｏｓｏｎｉｃａｃｉｄｆｒｏｍＧｌｕｔａｍｉｃｉ⁃ｂａｃｔｅｒｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅＶＫＭＡｃ⁃２１０４Ｔｃｅｌｌｗａｌｌ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０２０，８５（５）：６２９－６３５．
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６㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年。