菠萝蛋白酶的制备及活性测定

菠萝蛋白酶的制备及活性测定
背景
菠萝蛋白酶(Bromelain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(Anana COmOSl2S)植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。

菠萝的果、茎、柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。

一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。

八成熟的菠萝果汁含有约0．4％的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有O．3％左右的菠萝蛋白酶，茎汁含8．7％的菠萝蛋白酶(Murachi，et a1．，1964)。

1981年，Marcano首先发现菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后Willstatter，Bergmann和Martin相继指出，菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶(Stembromelain E．C．3．4．22．4)，存在于果汁中的酶称为果酶(Fruit bromelainE．C．3．4．22．5)。

Murachi和Neurath、E1．G harbawi和Whitaker采取层析法分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。

结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为pH4．6，茎菠，约为33，000，等电点为pH9．5，其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋白酶为糖蛋白。

Ota S et aL研究指出，茎菠萝酶分子量为36000，末端氨基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为30000，末端氨基酸残基也为丙氨酸，碳水化合物分析与Muraclli 的分析结果相似。

1988年，T．L．迈诺特等由十二烷基硫酸钠．聚丙烯胺凝胶电泳(SDS．PAGE)测定果菠萝蛋白酶分子量22200．25080，等电点3．8~4．8。

菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。

菠萝蛋白酶成分的复杂性，限制了其在生产中的应用，特别是医药领域对功能成分的要求上，因此对菠萝蛋白酶的成分和各成分的具体功能的分析研究具有重要意义。

菠萝蛋白酶纯品是一种糖蛋白，分子结构中含有一个寡糖分子，由木糖(xylose，xyl)、岩藻糖(fucose，Fuc)、甘露糖(mannose，Mall)和N一乙酰葡萄胺(N．aceltylglucosamine，GIcNAC)组成
用离子交换柱层析、硫酸铵沉淀等方法提纯得到的菠萝蛋白酶进行研究表明，菠萝蛋白酶相对分子量为33200D，等电点为pH9．55，酶液的最大吸收波长为280nm，0．051％浓度的酶液在280nm的光吸收值达0．984(Murachi，et a1．，1964)。

分子中有4个N
一乙酰化的氨基己糖，含糖2．1％，分子中有285个氨基酸残基，含氮量为15．88％。

在Murachi等研究的基础上，1989年，Ritonja等排列出了菠萝蛋白酶主要组分的氨基酸顺序，有20种氨基酸，共212个，C端的氨基酸为谷氨酸(Glu)，N端的氨基酸为丙氨酸(Ala)，相对分子质量为23828。

菠萝蛋白酶作为有活性的蛋白质，易受到温度、pH、金属离子等的影响。

研究表明(章佩芬等，1999)：菠萝蛋白酶的最适反应温度介于55～60℃，温度再高，酶的热失活增强，反应速度下降；菠萝蛋白酶的最适pH在6．5～7．5，在7．1附近达最大值，在酸性环境中，酶反应速度下降快，在碱性下有个较宽的应用范围，酶较稳定的pH范围在3．5~4．5；菠萝酶反应影响不大，MgCl2、CaCh对酶有一定程度的抑制作用。

生产过程中，为了保护酶的活性，防止酶自身水解作用，常加入一些活性保护剂，如EDTA、维生素C、半胱氨酸等，提高酶的活性，延长酶的保存时间。

1999年，H．H．Liang 等人研究发现，茶多酚与菠萝蛋白酶结合后能提高酶的热稳定性，延长酶的半衰期。

1．3菠萝蛋白酶的提取纯化方法．
菠萝蛋白酶的提取纯化方法很多，目前，用于工业化生产的提取方法主要有三种(王平诸等，2002)：高岭土吸附法、单宁沉淀法、超滤浓缩法。

流程
(1)高岭土吸附法工艺流程
菠萝下脚料(压榨)一汁液(高岭土吸附)一吸附物(洗脱、压滤)一洗脱液(盐析)一盐析物(离心)一湿粗酶饼(溶解、过滤)一澄清液(沉淀)一湿酶(干燥)一精品
(2)单宁沉淀法工艺流程
菠萝下脚料(压榨)一汁液(去杂质)一澄清液(加稳定剂)啼稳定液(加单宁)一单宁沉淀物(洗脱)一滤液(干燥)一酶制品
(3)超滤浓缩法工艺流程
菠萝下脚料(压榨)一汁液(去杂质)一澄清液(超滤浓缩)一浓缩液(降温、加沉淀剂、沉淀)一湿酶(减压干燥)一酶制品
步骤
2．4．1．1酪蛋白溶液的配制
称取酪蛋白0．609，加0．05mol／L磷酸二氢钠溶液80mL，搅拌溶解后，加0．1mol ／L盐酸液调节pH至7．0，加水至100mL即得。

2．4．1．2酶稀释液的配制
称取L．半胱氨酸0．269，EDTA 0．229，分别加适量水溶解后，调节pH至6．0，加水定容至100mL，即得本液，现配现用。

2．4．1．3三氯乙酸溶液的配制
称取三氯乙酸17．999，加醋酸钠29．949，和冰醋酸18．9mL，加适量水溶解后，加水至1000mL，摇匀，即得。

2．4．1．4磷酸缓冲液
量取0．2 mol／L Na2HP04溶液1 2．3mL与87．7mL 0．2 mol／L NaI--12P04 溶液混合，定容至500ml即得0．05mol／L，pH6．0磷酸缓冲液。

2．4．1．5层析缓冲液
称取1．219 Hs碱，0．589 NaCl，1 mol／L的EDTA lmL，加蒸馏水稀释到1L，用磷酸盐调pH5．0～8．O。

梯度洗脱时高浓度氯化钠洗脱液的配制，加氯化钠87．669，至1．50mol／L，其余数据同上。

2．4．1．6 SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳所用溶液
储存液：
①2 mol／L Tris·HCI(pH8．8)，100mL
称取24．29Tris碱，加50mL蒸馏水，．缓慢加浓盐酸至pH8．8，再加蒸馏水至100mL。

②l mol／L Tris-HCI(pH6．8)，100mL
称取12．19秭s碱，加50mL蒸馏水，缓慢加浓盐酸至pH8．8，再加蒸馏水至100mL。

③10％(W／V)SDS，100mL
称取109 SDS，加蒸馏水至100mL，室温保存。

④50％(V厂V)甘油，100mL
倒取甘油(100％)50mL，加入50mL蒸馏水。

⑤l％(W／V)溴酚蓝，10mL
称取100mg溴酚蓝，加蒸馏水至100mL，搅拌至完全溶解，过滤除去聚合的染料。

工作液：
①A液：丙烯酰胺储存液，10mL
30％(W／V)丙烯酰胺，O．8％(WⅣ)双丙烯酰胺。

②B液：4X分离胶缓冲液，100mL(4℃下保存)
75mL 2mol／L Tris-HCl(pH8．8)，4mL 10％SDS，21mL蒸馏水。

③C液：4X堆积胶缓冲液，100mL(4℃下保存)
50mL lmol／L Tris．HCl(pH6．8)，4mL 10％SDS，46mL蒸馏水。

④10％过硫酸铵，5mL
0．59过硫酸铵，5mL蒸馏水，密封于磨口试管，4"C下保存。

⑤电泳缓冲液，lL
39 Tris碱，14．49甘氨酸，lg SDS，加蒸馏水配成1L溶液，室温下保存。

⑥2x样品缓冲液，100mL
0．25mol／L"Iris-HCl(pH6．8)，4％(W／V)SDS，20％(V／V)甘油，痕量溴酚蓝，浓缩胶缓冲液(4X)5mL，SDS(干粉)0．49，甘油(50％)4mL，溴酚蓝(1％)201xl，加水至100mL。

⑦含2．巯基乙醇的样品缓冲液(1X)
现用现配，稀释2X样品缓冲液储液，加入2．巯基乙醇至终浓度为5％(V／V)。

⑨灌制x％分离胶的计算
A液X／3mL，·B液2．5mL，蒸馏水(7．5制3)mL，10％过硫酸铵509L，TEMED 501．t l(X>8％时，用10u 1)总量10mL。

2．4．2酶活测定方法
对于供试酶液(2．4．4．1)量取5mL(酶制品称取样品0．0159，置研钵中，加适量酶稀释液研磨10rain)用水移至100mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，量取5mL至10mL量瓶中，加酶稀释液至刻度，摇匀，放置15min后，准确量取lmL，置具塞试管中于37+0．2
4C水浴中保温10min，精密量取在37±0．2"C中保温的酪蛋白溶液5mL，迅速加入混匀，同时开动秒表，准确反应10rain，立即加入三氯乙酸溶液5mL，摇匀，过滤。

另取样品溶液lmL置具塞试管中于37+0．2"C保温10min，精密加入37℃三氯乙酸溶液5mL，准确反应10rain，立即精密加入酪蛋白溶液5mL，摇匀，过滤，滤液作空白，按照分光光度法(中国药典1977版)在275nm处测定吸光度(施特尔马赫，1992)。

准确称取酪氨酸标准品50mg，置100mL量瓶中，加O．1mol／L盐酸溶液至刻度，摇匀，准确量取lmL 置10mL量瓶中，加O．1mol／L盐酸溶液至刻度，摇匀(每lmL含酪氨酸5099，以水作空白，在275nm处测定吸光度。

在pH7．0，37*(2条件下，每分钟水解酪蛋白生成lpg／L酪氨酸所需的酶量为一个活力单位。

酶活力计算公式：
每克(mL)菠萝蛋白酶活力U／g(U／mL)．’=石A×so×。

11。

×意‰ 以10 样品体积(重量)
A：样品吸光度
As：酪氨酸吸光度
11：样品最后反应完毕体积
10：反应时间
50：每mL含有酪氨酸的烬数
2．4．3蛋含量测定方法
采用考马斯亮兰G．250法(George R，1973)测定蛋白质含量：
①标准蛋白溶液的配制：称取10mg牛血清白蛋白溶于去离子水并定容至100mL，配成0．1mg／mL的标准蛋白溶液。

②考马斯亮兰G．250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G．250，溶于50mL 95％的乙醇后，再加入120mL 85％的磷酸，用水稀释至lL，过滤后贮于棕色瓶中。

③标准曲线的绘制：取7支试管，编号后如表1，混匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定(应在lh内完成)，以牛血清白蛋白含量(嵋)为横坐标，以吸光度为纵坐标。

2．4．4．2纳米n02吸附法
供试酶液中加纳米Ti02搅拌均匀一离心(4000 rpm，15min)一取沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱一搅拌(30rain)一离心(4000 rpm，15rain)一取上清液一超滤浓缩一冷冻干燥一酶制品。

操作要点：
①吸附、洗脱：供试酶液置于玻璃或不锈钢容器中，加入纳米Ti02搅拌均匀，吸附20～30min，离心弃上清，沉淀用柠檬酸缓冲液洗脱，离心取上清。

②超滤：洗脱液先用截留分子量为40KD的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为20KD的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质，采用加去离子水多次超滤。

③冷冻干燥：据共晶点确定干燥参数。

④纳米Ti02吸附能力再生：纳米二氧化钛吸附洗脱后，采用0．1mol／LNaOH溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性，干燥后进行重吸附实验，吸附效果可恢复90％以上。

2．4．4．3高岭土吸附法
供试酶液---an 4％高岭土，搅20min,10。

C吸附30～60min--,．静置一吸出上清一沉淀用16％NaOH调pH6．5～7．O一加7％～9％NaCl，搅30min一压滤，滤液用1：3(体积比)盐酸调pH5．O一搅拌---an滤液量25％(NH4)：S04一溶解一4℃静置过夜一离心一沉淀一干燥(王平诸等，2002)。

操作要点：
①吸附：将供试酶液加入吸附槽中搅拌，同时加入4％的高岭土，搅拌约20rain，在10℃吸附30～60min，用虹吸排掉上清液，收集高岭土吸附物。

②洗脱：用16％的NaOH溶液调节吸附物的pH至7．0左右，再加入吸附质量为7％～9％的工业食盐，搅拌30min进行洗脱，然后迅速压滤，收集滤液。

③盐析：将压滤液收集在盐析槽中，‘用1：3的盐酸调节pH至5．O左右，搅拌加入压滤液质量25％的硫酸铵，待完全溶解后，4"C过夜：然后离心，收集沉淀盐析物，干燥即为粗酶。

2．4．4．4超滤浓缩有机溶剂沉淀提取
供试酶液一超滤浓缩一有机溶剂沉淀一干燥一酶制品。

操作要点：
①超滤：供试酶液先用截留分子量为40KD的超滤膜除去较大分子量的杂蛋白，再用截留分子量为20KD的超滤膜除去较小分子量的杂蛋白及其它小分子杂质。

②有机溶剂沉淀：将浓缩液降温至O~4℃，边搅拌边加入．20℃的95％乙醇，直至混合液中乙醇浓度为50％，静置，使酶沉淀，移出上清液，即为湿酶。

③干燥：将湿酶在0℃下减压干燥即得菠萝蛋白酶制品。

．3菠萝蛋白酶的保存稳定期
菠萝蛋白酶在4"C、相对湿度25％，添加0．005％的L．半胱氨酸、0．05％的EDTA 进行保存，半衰期可达240天。

4．3二氧化钛的回收利用
纳米二氧化钛吸附洗脱后，采用0．1mol／L NaOH溶液浸泡，再用去离子水洗涤至中性，干燥后进行重吸附实验，吸附效果可恢复90％以上。

采用纳米二氧化钛与石英、长石、黏土、活性炭等烧结成多孔陶瓷材料(李兴等，2002)即可实现连续吸附及再生。

实验中参照李兴等的陶瓷烧结工艺，尝试了二氧化钛多孔陶瓷的烧结，但吸附效果不如纳米二氧化钛好，烧结工艺还需进一步摸索。

4．4．1纳米二氧化钛吸附原理
本研究结果表明，纳米二氧化钛对菠萝蛋白酶有很好的吸附效果，但吸附的具体原理还不清楚，有待于进一步研究确定。

4．4．2二氧化钛多孔陶瓷材料的研制
由于纳米二氧化钛吸附及洗脱不能实现连续生产的需要，所以纳米二氧化钛多孔陶瓷材料的研制不仅能实现连续生产，还能避免二氧化钛在待纯化酶液中的残留。

实验中尝试了采用纳米二氧化钛与石英、长石、黏土、活性炭等烧结成多孔陶瓷材料进行吸附实验，但吸附效果不如粉末吸附效果好，烧结工艺还需进一步摸索。