克氏原螯虾壳膜几丁质酶的分离纯化及酶学性质研究
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克氏原螯虾壳膜几丁质酶的分离纯化及酶学性质研究
几丁质酶广泛存在于生命体中,参与体内多种生物过程。
因其优良的特性,已被广泛应用。
目前已有不少对几丁质酶的研究,这些研究大多集中于微生物产酶及几丁质酶的克隆和基因表达分析,基于天然几丁质酶分离纯化的研究很少。
本课题以克氏原螯虾壳膜为实验材料,从中分离纯化出一种几丁质酶组分,且对该酶的酶学性质进行了探究。
旨在丰富几丁质酶的来源,为几丁质酶的广泛应用提供了重要的理论基础。
本课题首先用缓冲液抽提,经过硫酸铵分级沉淀、透析、Sephadex G-100凝胶层析、DEAE-32阴离子交换层析、苯基疏水层析三种柱层析分离纯化后,制备出了电泳纯的几丁质酶制剂。
比活力由2.76U/mL增加到44.93U/mL,纯化倍数为16.28,回收率为
2.98%;SDS-PAGE结果显示该酶为单亚基酶,酶分子量为36.8KDa;酶学性质实验结果表明该酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为6.4,在60℃以下和
pH5.0<sup>8</sup>.0之间稳定性好;K<sup>+</sup>、Ca<sup>2+</sup>对酶活力基本没有影响;Na<sup>+</sup>、Zn<sup>2+</sup>、Cu<sup>2+</sup>对酶活有轻微激活作用;Mg<sup>2+</sup>在低浓度能提高酶活,高浓度对酶的激活作用减弱并转为抑制作用;Mn<sup>2+</sup>对酶有较强的激活作用;Hg<sup>2+</sup>对酶有强烈的抑制作用;乙醇在低浓度对酶有激活作用,浓度增高对酶的激活作用减弱并转为抑制作用,甲醛对酶有强烈的抑制作用。
进一步研究该酶催化反应动力学以及化学修饰,在最适条件下,以胶体几丁质为底物测得
K<sub>m</sub>=1.63mg/mL,V<sub>max</sub>=2.09×10<sup>-1</sup>mg/
（mL·min）,K<sub>cat</sub>=1.28×10<sup>-1</sup>
min,K<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub>=7.87×10<sup>-2</sup>;SUAN、PMSF、DTNB、DTT、EDTA等修饰剂对酶活抑制作用不大,说明赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸均不是酶活性中心所必需氨基酸,并且二硫键和金属离子与酶发挥作用无关;BrAc对酶的抑制类型为可逆混合型抑制,竞争性抑制常数
K<sub>I</sub>=1.87<sup>2</sup>.04mmol/L,非竞争抑制常数
K<sub>SI</sub>=0.65mmol/L;整个酶分子中有3个组氨酸残基位于活性中
心;NBS对酶的修饰结果表明色氨酸的吲哚基可能存在于几丁质酶的酶活中心,抑制类型为不可逆抑制。