发酵产物的提取与精制

❖ 2、絮凝作用 ❖ 絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子
量聚电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使 胶粒形成粗大的絮凝团的过程。
❖ 常用的絮凝剂 ❖ 聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、
磷酸氢二钠
❖ 絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤 速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质 和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等， 提高了滤液质量
（一）凝聚和絮凝技术
❖ 凝聚和絮凝能有效改变细胞、菌体和蛋白质 等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使 它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。
❖ 常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、 细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等 胶体粒子的去除。
❖ 但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两 个概念，其具体处理过程也是有差别的。
菌种对过滤速度影响
❖ 真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可 达10μm，发酵液容易过滤，不需特殊处理。 其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来， 故可采用鼓式真空过滤机过滤。
❖ 放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。 如链霉素发酵液菌丝仅0.5~1.0μm左右，还含 有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一 般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。
✓该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入
很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。
• 撞击破碎法
✓一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬
浮液冷却至-25˚C至-30 ˚C形成冰晶体， 利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细 胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由 于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物 的变形所引起的。
一般工艺过程
❖ 一般说来，下游加工过程可分为4个 阶段：培养液(发酵液)的预处理和固 液分离；初步纯化(提取)；高度纯化 (精制)；成品加工。
❖ 工艺过程的划分：
➢ 预处理和固液分离 ：目的是除去发酵液中的菌体细胞
和不溶性固体杂质。
➢ 初步分离 ：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为
后道精制工序创造有利条件
但是，对不稳定的微生物容易引起所需 蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过 滤速度也会降低。
➢ 高度纯化 ：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。 ➢ 成品制作 ：成品形式由产品的最终用途决定。
❖ 选择下游加工工艺的原则：
➢ 是胞内产物还是胞外产物 ➢ 原料中产物和主要杂质浓度 ➢ 产物和主要杂质的物理化学特性及差异 ➢ 产品用途和质量标准 ➢ 产品的市场价格 ➢ 废液的处理方法等
第一节 发酵醪的预处理和菌体分离
❖ 地位
➢ 传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠 檬酸)，分离和精制部份占整个工厂 投资费用的60%。
➢ 对重组DNA发酵、精制蛋白质的费 用可占整个生产费用的80%~90%。
❖ 下游加工过程的特点
❖ 1、成分复杂：细胞、代谢产物、残余培养基 ❖ 2、产品浓度低：传统发酵一般1～10％ ❖ 3、失活问题 ❖ 4、不稳定性 ❖ 5、纯度和生物安全问题 ❖ 6、收率低：50％左右
❖ 细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因 准，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难 以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。
培养基的组成对过滤速度影响
❖ 用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使 过滤困难；
❖ 发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养 基也会使过滤困难。
发酵周期对过滤的影响
❖ 正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在 菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞自治后的 分解产物一股很难过滤。有时延长发酵周期 虽能使发酵单位有所提高，但严重影响发酵 液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难， 最终造成成品质量降低。
❖ 还有许多是存在于细胞内，例如青霉素酰化酶，碱 性磷酸酯酶等，称为胞内产物。
❖ 对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获 得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液，
❖ 对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎， 使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的 分离。
4，微生物细胞的破碎技术
❖ 机械方法
发酵产物的提取 与精制
概论
❖ 下游加工过程在发酵工程中的地位
❖ 下游加工过程的定义
发酵产品系通过微生物发酵过程、酶反应过 程或动植物细胞大量培养获得。从上述发酵液、 反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程 称为下游加工过程(Down stream processing)。它由一些化学工程的单几操作 组成，但由于生物物质的特性，有其特殊要求， 而且其中某些单元操作一般化学工业中应用较 少。
❖ 去除会影响后续提取的高价无机离子。
❖ 发酵醪预处理的要求:
❖ （1）菌体的分离 ❖ （2）固体悬浮物的去除 ❖ （3）蛋白质的去除 ❖ （4）重金属离子的去除 ❖ （5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除 ❖ （6）改变发酵醪的性质 ❖ （7）调节适宜pH值和温度
预处理的方法
1，凝聚和絮凝技术 2，杂蛋白质的去除 3，高价无机离子的去除方法
• 干燥法
✓可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥
和冷冻干燥等。
✓空气干燥主要适用于酵母菌。真空干燥
适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较 不稳定的生化物质。
✓干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白
质或其它组织变性。
• 化学法
✓用酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白
质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞 内渗漏出来。
✓渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的
菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成 受抑制而强度减弱时才是合适的。
❖ 冻结-融化法
❖ 将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化， 反复多次而达到破壁作用。
❖ 对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但 通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提 高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某 些蛋白质的变性。
目的
❖ （1）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分 离固形物的速度，提高固液分离器的效率
❖ （2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中 （多数是液体）
❖ （3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步 操作。
一、 发酵液的预处理
❖ 采用理化方法设法增大虚浮液中固体粒子 的大小、或降低粘度，以利于过滤。
在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀 物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。 预处理的方法
3，高价无机离子的去除方法
❖ 钙离子，可用草酸。
❖ 镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形 成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能 大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法 可用于环丝氨酸的提取。
❖ 铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士 蓝沉淀。
改善过滤性能的方法
❖ 等电点 ❖ 蛋白质变性 ❖ 吸附 ❖ 凝聚和絮凝 ❖ 加入助滤剂 ❖ 直接在发酵液中形成填充-凝固剂 ❖ 酶解作用
（二）固—液分离设备
❖ 不同性状约发酵液应选择不同的固—液分离 设备。常用于发酵液的分离设备有：
✓ 板框压滤机 ✓ 真空鼓式过滤机 ✓ 离心分离机
❖ 板框压滤机
发酵工业下游技术的一般工艺过程
❖ 下游加工过程由各种化工单元操作组成。 由于生物产品品种多，性质各异，故用到 的单元操作很多，其中如蒸馏、萃取、结 晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单元操 作，理论比较成熟，而另一些则为新近发 展起来的单元操作，如细胞破碎、膜过程 和色层分离等，缺乏完整的理论，介于两 者之间的有离子交换过程等。
✓该法的优点是适用的范围广，破碎率高，
细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留 率高，
✓该法对冷冻—融解敏感的生化物质不适
用。
• 渗透压冲击
✓是较温和的一种破碎方法，将细胞放在
高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或 蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然 稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中， 由于渗透压的突然变化，水迅速进入细 胞内，引起细胞壁的破裂。
高压匀浆器 珠磨法 撞击破碎法 超声波破碎
❖ 非机械方法
酶解 渗透压冲击 冻结和融化 干燥法 化学法
• 高压匀浆器
采用高压匀浆器是 大规模破碎细胞的 常用方法，利用高 压迫使细胞悬浮液 通过针形阀，由于 突然减压和高速冲 击撞击环造成细胞 破裂
高压匀降的排出阀
❖ 珠磨法
研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与 玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或 研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装 置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升 高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分 解决。
✓溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分
解细胞壁上糖蛋白分子的α-1，4糖苷键， 使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞 移至低渗溶液中使细胞破裂。
• 自溶作用
✓是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是
由微生物本身产生的。
✓影响自溶过程的因素有温度、时间、pH
缓冲液浓度、细胞代谢途径等。
✓自溶法在一定程度上能用于工业规模，
（二）杂蛋白质的去除方法
❖ 1．等电点沉淀 蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去。
❖ 2．变性沉淀 使蛋白质变性的方法有：加热、大幅度改变pH，加有机溶
剂（丙酮、乙醇等）、加重金属离子如Ag＋ 、Cu2＋ 、 Pb2＋ 等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、 过氯酸等及表面活性剂。 ❖ 3. 加各种蛋白质沉淀剂 加入某些化学试剂使蛋白质与之形成复合物沉淀 ❖ 4．吸附
✓某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方
法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但 是，这些试剂容易引起生化物质破坏， 还会带来分离和回收化学物质的问题。
• 酶解法
✓利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的
键，从而达到破壁的目的。
✓优点：专一性强，发生酶解的条件温和。
✓缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于
小规模的实验室研究。
二、发酵液的固液分离
❖ 微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞 碎片以及残余的固体培养基成分。
❖ 固液分离是指将发酵液（或培养液）中的悬 浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白 质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去
（一）影响过滤速度的因素
❖ 1、发酵液中粒子的直径 ❖ 2、发酵液黏度
培养基的组成 未用完培养基的数量 消沫油 发酵周期
影响絮凝的因素
➢絮凝剂的添加量 ➢发酵液的pH ➢絮凝剂的分子量 ➢搅拌转速 ➢搅拌时间
絮凝剂加量对絮凝效果(滤速)的影响
料液中，絮凝 剂浓度增加有 助于架桥充分， 但是过多的加 量反而会引起 吸附饱和，在 每个胶粒上形 成覆盖层而使 胶粒产生再次 稳定现象。
发酵液pH对阴离子聚丙烯酰胺絮凝效果的影响 溶液pH的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电 离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大， 由于链节上相邻离子基团间的电排斥作用，而使分 子链从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。
• 超声波法
✓细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产
生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘 滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应 力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破 碎。
✓对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不
同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比 革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果 级差。
✓ 优点：
板框压滤机的过滤面积大； 过滤推动力(压力差)能较大
幅度地进行调整，并能耐受 较高的压力差；
结构简单，价格低， 动力消耗少等优点。
✓ 缺点
不能连续操作，设备笨重， 劳动强度大，
卫生条件差，
非生产的辅助时间长，阻碍 了过滤效率的提高。
❖ 鼓式真空过滤机
✓ 优点
能连续操作， 能实现自动化控制
❖ 1、凝聚作用
凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和 蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的 过程。
❖ 凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处 理的物质带负电荷（如细胞或菌体一般带负电荷）， 因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无 机盐类、金属氧化物类。
❖ 常（明用矾的）无、机盐AlC类l3凝6H聚2剂O、有F：eCAll32、（ZSnOS4）O43、18MHg2COO3： Al(OH)3、FeSO4、Ca(OH)2或石灰等。
❖ 缺点
压差较小，主要适 用于霉菌发酵液的 过滤。
❖ 离心分离 ❖ 优点
分离速度快，效率 高，
操作时卫生条件好 等优点，
适合于大规模的分 离过程。
❖Байду номын сангаас缺点
投资费用高， 能耗较大。
三、细胞的破碎与分离
❖ 微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，例 如细菌产生的碱性蛋白酶，霉菌产生的糖化酶等， 称为胞外产物。