常用的微生物分离纯化方法

(一) 常用的微生物分离纯化方法
菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。

其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备, 分离纯化效果好, 现分别简述如下
1. 稀释混合倒平板法
平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。

该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。

待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。

于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。

每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。

挑取单一个菌落, 一般再重复该法1-2次, 结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。

若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。

图 4 混合倒平板操作法示意图图 5 涂布平板操作法示意图
2. 稀释涂布平板法
采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。

在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。

该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。

待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。

另一种简单快速有效的涂布平板法, 可省去含菌样品悬液的稀释, 直接吸取经振荡分散的样品悬浮液l滴加入1号琼脂平板上, 用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布, 用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定), 翻转此涂棒再涂布5号、6号平板, 经适温倒置培养后挑取单个菌落。

该法可称之为玻璃涂棒连续涂布分离法。

3. 平板划线分离法
先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。

划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。

通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少, 并逐步分散开来。

经培养后,可在平板表面形成分散的单个菌落。

但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线1-2次, 并结合显微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的纯培养物。

该法的特点是简便快速。

图6 平板划线分离操作法示意图
个体细胞的生长难以测定, 而且生长与繁殖是交替进行的, 因此，微生物的生长繁殖一般不是依据个体细胞的大小, 而是以群体细胞数目的增加作为指标的。

测定微生物细胞数量的方法很多, 主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法、最大可能数(MPN)法、膜过滤法等。

测定酵母细胞数或霉菌孢子数常采用在显微镜下直接进行计数的方法, 该计数方法被广泛应用于酒精、啤酒和白酒等的工业化生产中。

平板菌落计数法被广泛应用于食品、饮品、水质和活菌制剂等的含菌指数或污染程度的检测。

该计数方法又称平板活菌计数法, 其最大优点是可以获得活菌数的信息。

但是, 该计数法操作过程较繁, 需要培养一定时间才有结果, 且测定结果易受多种因素的影响。

光电比浊计数法是采用光电比色计或分光光度计, 测定菌悬液的光密度或透光度, 其优点是简便迅速, 可以连续测定, 适合于自动控制。

但该法除了受菌体浓度影响外, 还受细胞形态、大小、培养液成分及所采用光波长等因索的影响。

(一)显微镜直接计数法
该法是将酵母菌或霉菌孢子悬液, 放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下直接进行计数，是一种常用的微生物计数方法。

Thoma血球计数板是一块特制的厚载玻片, 玻片的中间部分刻有四条沟槽, 形成三个平台。

中间的平台较宽且比两边的平台略低, 其中央刻有一小方格网的计数区, 计数区的面积为l平方毫米。

另一种计数器中间平台的中间又被一短的横沟槽分为两半, 成为两个小平台, 每个小平台上面各刻有一个计数区, 共有两个计数区。

当盖上特定盖玻片时, 盖玻片与计数室的空间厚度正好是0.l毫米, 这样计数室的体积为0.l立方毫米, 即0.000l毫升。

计数室有两种刻度形式, 一种是全区分16大格, 每大格再分25小格, 一共400小格。

另一种是全区分25大格, 每大格再分16小格, 也是400小格。

计数时, 可将酵母菌液(或孢子悬液)充满计数室, 在显微镜下按规定数4个或5个大格的总细胞数, 再求得每小格内平均的细胞数, 即可计算出每ml培养液中的细胞总数。

每ml菌液酵母菌细胞数= 每小格平均酵母细胞数×400×10000×稀释倍数。

(二)平板菌落计数法
该法的基本原理是：将待测含菌样品经适当稀释, 使其中的微生物充分分散成单个细胞, 然后取一定量的稀释样品液, 接种到平板上。

经过一定时间培养后, 由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的单菌落, 即一个单菌落应代表原样品中的一个活菌。

最后统计菌落数, 根据其稀释倍数和取样量, 换算出单位样品中所含的活菌数。

实际上，由于待测样品不易完全分散成单个细胞, 故所形成的菌落并非都是单菌落, 有一部分是由2个以上的细胞长成的, 因此平板菌落计数的结果会比实际偏低。

现在已采用菌落形成单位(cfu)来表示样品的活菌含量。

(三)光电比浊计数法
光电比浊计数法的原理是：光线透过菌悬液时, 其透光率与细胞浓度成反比, 而光密度与细胞浓度成正比。

透光率或光密度可以由光电池精确测出(光波通常选择在400～700 nm之间), 因此, 可用一系列已知菌数的某种菌悬液测定光密度, 作出光密度与菌数标准曲线。

这样，由样品液(相同菌株和培养条件)所测得的光密度, 即可从标准曲线中查出对应的菌数。

图7 光电比浊法测定细胞浓度的原理。