木质素降解菌的筛选和产酶特性初探

木质素降解菌的筛选和产酶特性初探
姜立春;刘羽;林寿露;赵丽萍;阮期平
【摘要】为了促进生物高效降解木质素,采用苯胺蓝、氯化锰、α-萘酚平板法和木质素降解试验,从腐竹中分离、筛选获得1株具有高效降解木质素活性菌株,命名为LQ-04.对该菌株产酶条件进行了优化,其优化工艺为:碳源为葡萄糖10 g/L,氮源为酵母膏10 g/L,pH为6.0,温度为40℃,转速为180 r/min,在该优化条件下木质素过氧化物酶(LiP)活性高达82.8 U/mL.这将为木质素的生物降解提供实验依据.
【期刊名称】《绵阳师范学院学报》
【年(卷),期】2016(035)008
【总页数】6页(P6-10,15)
【关键词】腐竹;木质素;过氧化物酶;酶学特性;降解率
【作者】姜立春;刘羽;林寿露;赵丽萍;阮期平
【作者单位】绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳621000;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳621000;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳621000;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳621000;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室,四川绵阳621000
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.9
木质素(lignin)是自然界植物组织的有效成分之一，仅次于纤维素的第二大有机化
合物，其同纤维素和半纤维素是构成植物细胞壁的重要成分[1].它的主要作用是增加植物组织的强度和硬度，起着粘合植物纤维和使纤维刚挺的功能[2].木质素的分子结构比较复杂，主要由苯丙烷类结构单元通过碳键与醚键等多种形式的共价链连接形成，是一种非水溶性的、没有规则的、三维空间网状的芳香族高聚化合物[3].由于木质素微观结构的复杂性与含有较稳定的键型结构，致使其不容易被降解[4]. 目前研究和应用较广的降解木质素菌种大多是真菌门担子菌纲的白腐菌[5]，但实
际上，对木质素的降解是依靠真菌、细菌、放线菌和相应的微生物共同起作用而完成的.细菌在木质素降解的过程中主要起着间接的作用，可在一定程度上改变木质
素结构，其降解木质素的机理随细菌菌种不同而不同[3].放线菌在木质素降解的研究中，其研究范围比较狭窄，但在降解木质素的过程中也有着不可忽视的作用[6].木质素降解酶系比较复杂，最为重要的三种酶是木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧
化物酶(MnP)和漆酶(Lac)[7].除此之外，还有一些其他酶类也对木质素的降解有一定的影响.虽然木质素降解酶种类繁多，但并不是每一种菌都能产生上述酶类，因
而不同种类的微生物其降解机制不同.同时，诸多因素影响木质素降解酶的活性，
主要有碳源、氮源、初始pH、培养温度、诱导剂、碳氮比例与表面活性剂等[8-10].张安龙等[11]以树枝和树皮为样本筛选得到一株产漆酶能力强的木质素降解菌，通过产酶条件优化发现加入诱导剂CuSO4浓度为0.5 mmol/L最有利于该菌株产漆酶.董旭杰等[12]通过对3种白腐菌产木质素降解酶活研究认为，培养基中的碳
氮比对锰过氧化物酶与漆酶产生存在一定的影响.漆酶易在高碳低氮的培养条件产生，而锰过氧化物酶在低碳高氮的培养下易产生.乔乔等[13]通过添加不同的氮源
来研究黄曲霉对木质素降解酶的效果，发现无机氮源组优于有机氮源组.王仁祐等[14]研究结果显示生物表面活性对木质素降解菌产酶存在一定影响，能够提高黄孢原毛平革菌的锰过氧化物酶活性，也能将简青霉产酶高峰期提前.因此，研究菌株
发酵产酶条件优化，对提高菌株对于木质素的降解能力具有重要的科学意义.
本文通过以采集的腐竹作为研究材料，结合苯胺蓝、氯化锰和α-萘酚平板的变色
反应分离和筛选能高效降解木质素优良菌株.之后对获得的菌株优化发酵产酶条件
和酶学特性进行了初步研究，进而获得该菌株最适产酶的优化条件.这将为采用微
生物降解木质素提供实验依据.
1.1 供试菌株
试验所用多年堆积的朽竹和腐土样本采自四川永盛竹纤维有限公司.
1.2 培养基
初筛培养基：K2HPO4 0.5 g，KH2PO4 0.5 g，NaCl 0.2 g，NH4NO3 1.0 g，MgSO4 0.2 g，CaCl2 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，微量MnSO4·H2O，竹粉
10 g，琼脂粉20 g，加蒸馏水定溶至1 L.
苯胺兰培养基：马铃薯200 g，酵母粉15 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，氯化钠
5 g，苯胺兰0.1 g，pH=7.0，琼脂粉20 g，加蒸馏水定溶至1 L.
氯化锰筛选平板：MnCl2·4H2O 0.15 g，琼脂20 g，自来水定容1 L.
α-萘酚筛选平板：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g,MgSO4·7H2O 1.5 g，VB 0.1 g，琼脂20 g，自来水1 L，待冷却至50 ℃，添加单独灭菌的0.005 % α-萘酚[15].
1.3 试验方法
1.3.1 菌株筛选将腐竹样本1 g于100 mL生理盐水中震荡1 h，梯度稀释10-1-10-6并涂布于初筛培养基上，每个平板涂布100 uL，28 ℃培养7 d.逐次分离
直到获得单菌落，均同时接种在苯胺蓝、α-萘酚与氯化锰3种鉴定培养基平板上，在28 ℃条件下培养4-5 d.通过菌苔周边培养基颜色变化初步判定各个菌株产酶能力，方法见文献[8].
1.3.2 酶活的测定(1)粗酶液的制备将初筛到的菌株接种于液体产酶培养基中，
32 ℃，150 r/min培养48 h，5 000 r/min离心8 min，得到上清液为粗酶液.
(2)木质素过氧化物酶125 mmol/L的酒石酸钠缓冲液(pH3.0)3.2 mL，10 mmol/L藜芦醇100 uL，粗酶液0.6 mL，放至32 ℃水浴锅预热，加入H2O2溶液(10 mmol/L)100 uL开始反应，3 min后在310 nm处测定OD值变化情况.酶活力定义(U/mL)：每分钟每毫升培养基滤液增加0.1个OD值为一个酶活力单位[16].
(3)锰过氧化物酶乳酸钠缓冲液(50 mmol/L pH4.5)3.4 mL，MnSO4溶液(1.6 mmol/L)100 uL，0.4 mL的粗酶液，放至32 ℃水浴锅预热，加入H2O2溶液(1.6 mmol/L)100 uL开始反应，3 min后在240 nm处测定OD值变化情况.酶活力定义(U/mL)：每分钟每毫升培养基滤液增加0.1个OD值来表示[17].
(4)漆酶50 mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.5)1.5 mL，10 mmol/L的愈创木酚1 mL和1 mL粗酶液，放在25 mL试管中振荡混匀，32 ℃反应10 min，测定470 nm下OD值变化.酶活力定义为：1 min内吸光度增加0.01所需要的酶量为一个酶活力单位[18].每个因子都做3个平行实验.
1.4 木质素降解率测定
将LQ-04在合适条件下接入上述培养基中，分别在第0、2、4、6、8、10 d后用无菌吸管吸取2 mL培养液，用粗滤纸过滤后，于5 000 r/min离心8 min，取上清液经适当稀释后，于280 nm下比色，测定木质素磺酸钙含量[19].配制木质素磺酸钙标准溶液，测定不同浓度下的吸光度，绘制标准曲线.木质素磺酸钙含量与吸光值间的线性回归方程为y=0.086 9x+0.202 8，相关系数R2=0.997 5.
木质素磺酸钙降解率(%)=(初始含量m1-发酵后含量m2)/初始含量m1×100%.
2.1 菌株分离与筛选
将分离得到的10个菌株分别接种在3种不同的选择固体培养基上，经过4-5 d培养观察其结果，显示能使苯胺蓝平板上产生褪色圈的有6株菌，其中脱色圈范围
大于1 cm的有4株，编号为LQ-01、LQ-02、LQ-03与LQ-04；在α-萘酚选择平板上产生紫色圈的有3株，其中变色范围明显的有2株，编号为LQ-03与LQ-04；在氯化锰鉴定选择上产生棕色圈有2株，其中变色范围明显的仅有1株，编
号为LQ-04；菌株LQ-04在3种选择平板有比较明显的颜色反应，而菌株LQ-03在苯胺蓝与α-萘酚中有变色反应，揭示这2个菌株可能有降解产木质素的能力.将菌株LQ-03与LQ-04接种到木质素磺酸钙降解复筛培养基内，培养10 d检测发
现对木质素磺酸钙均有一定的降解作用，降解率分别为8.2%和15.6%.从菌落形态上来看，菌株LQ-03和LQ-04都属于霉菌.因此，以降解活性较高的菌株LQ-04
为目标菌株研究其产酶特性.
2.2 LQ-04产酶特性研究
2.2.1 生长产酶曲线测定LQ-04中LiP、MnP和Lac三种酶酶活及菌株生物量随时间的变化曲线，见图1.结果表明，菌体在60 h时进入稳定期，此时菌体生物量最高；LiP在60 h具有最大酶活达24.8 U/mL，MnP和Lac在72 h具有最大
酶活分别为6.8 U/mL和16.7 U/mL，Lac和MnP在平台期后菌丝生长缓慢时才
表现酶活性，这表明二者的合成与菌体的生长是非偶联的，属于滞后合成型酶，而LiP的产生和菌株的生长则为同步的.同时，LiP比MnP和Lac具有较高的酶活力，可推测LQ-04主要是通过分泌LiP对木质素进行降解，因此，选择对LiP酶活的
测定来作为后面产酶优化的依据，并确定最适培养时间为60 h.
2.2.2 碳源对产酶条件影响设置不同碳源(浓度20 g/L)接种LQ-04于32 ℃，150 r/min摇床培养60 h，见图2.结果表明，LQ-04在葡萄糖为碳源条件培养下，具有最大酶活力为42.6 U/mL，其次是蔗糖和麦芽糖，因此葡萄糖作为LQ-04产酶最适碳源.设置不同葡萄糖浓度于上述条件下进行摇床培养60 h.由图3可知当葡萄糖浓度为10 g/L时，其酶活最高达到为51.2 U/mL；随着葡萄糖浓度升高，酶活逐渐降低，在40 g/L时，酶活最低为10.6 U/mL，可能葡萄糖浓度过高多产酶
有一定的抑制作用，因此选10 g/L作为葡萄糖的最适浓度.
2.2.3 氮源对产酶条件影响设置不同氮源(浓度1 g/L)，在上述条件下培养60 h，见图4.结果表明，当LQ-04以牛肉膏为氮源时，具有最大的酶活50.1 U/mL，其次为蛋白胨，氯化铵酶活最低为6.5 U/mL.因此，将牛肉膏作为最适氮源.设置不
同牛肉膏于上述条件下进行摇床培养60 h.由图5可知，当牛肉膏浓度为10 g/L 时，其酶活最大为55.8 U/mL，高于或者低于此浓度酶活力都下降，这可能是因
为牛肉膏浓度的过高或过低抑制了菌株LQ-04的产酶能力.因此，将10 g/L牛肉
膏作为最适产酶浓度.
2.2.4 初始pH对产酶的影响设置不同初始pH值在上述条件下培养60 h.菌株产酶能力受到环境因子的影响较明显，为此初始pH值会直接影响菌株LQ-04的
生长状况和发酵产酶的代谢动力学.由图6所示，当培养基初始pH值6.0时，LQ-04的产酶的活性最高为66.5 U/mL，pH值高于或低于6.0，LQ-04产酶的能力
均受到不同程度的影响，尤其是pH值低于5.0时菌株LQ-04不但生长程度较慢，而且产酶能力降低较快.因此，产酶最适pH为6.0.
2.2.5 温度对产酶的影响设置培养温度不同在上述条件下培养60 h，见图7.结果表明，在15～40 ℃范围内，酶活随着温度的升高而不断增大，当温度升至40 ℃时，菌株达到最大的产酶能力，酶活达到71.6 U/mL，40 ℃后酶活开始下降较快，这可能是由于随着温度的上升，酶结构受到影响，导致酶活降低.因此，选择40 ℃作为发酵产酶的最徍温度.
2.2.6 转数对产酶的影响设置培养转数不同在上述条件下培养60 h，见图8.结果表明，随着转数升高其酶活逐渐升高，当转速达到为180 r/min时，菌株酶活
达到峰值为78.2 U/mL，转速变小不利于LQ-04对酶的合成和分泌，它的生长和代谢活动得不到充足的氧气供应，因此酶活较低，当转数达到200 r/min酶活反
而降低，可能转数过高其机械剪切力容易造成酶结构的破坏和酶活性的减弱或丧失
[4].因此，选择180 r/min作为产酶最适转数.
总之，在上述优化条件下，即在10 g/L葡萄糖，10 g/L牛肉膏，pH 6.0和转数为180 r/min条件下，将接种LQ-04后于40 ℃恒温摇床上培养60 h.进行5个平行实验，测定LiP酶活平均达到了82.8 U/mL，同时测定MnP为9.3 U/mL和Lac为23.6 U/mL.
通过对在多年存放堆积的腐竹中筛选、分离纯化后获得纯菌株，选择其中变色反应比较明显，况且变色圈明显大于菌落直径的菌株，最终获得产酶能力较强的菌株LQ-04.对其产酶条件进行了优化，在培养基中葡萄糖10 g/L，牛肉膏10 g/L，初始pH值为6.0，温度为40℃，转速为180 r/min条件下培养，测定LiP酶活平均达到了82.8 U/mL，可作为液体培养产酶的最适工艺条件.。