PCR技术在畜禽传染病诊断中的应用

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2011 9
OCCUPATION
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PCR技术在畜禽传染病诊断中的应用
文／冷毕丹
PCR，即聚合酶链式反应,英文polymerase chain reaction的缩写，又称基因体外扩增技术，是在一对引物定向引导下，用D N A 聚合酶对D N A 中作为模板的特异性靶序列进行体外扩增的技术。

PCR技术是美国马利斯（K.B.Mulli)）等在1985年提出的。

它可以从极微量的生物材料中简便、快速地得到大量特定基因，或在众多复杂的生物基因中检测出单拷贝基因。

与传统的畜禽传染病诊断方法，如细菌学、病毒学、免疫学等方法相比，PCR技术快速方便、敏感性高、特异性强、操作简便。

目前，PCR技术已在畜禽传染病诊断中发展得比较成熟，特别是在多种病毒性疾病的诊断中已相继得到应用，如猪蓝耳病、猪细小病毒病、伪狂犬病、猪圆环病毒病、口蹄疫、猪瘟、猪乙型脑炎、禽流感、鸡白血病、鸡新城疫等。

一、ＰＣＲ技术基本原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由“变性—退火—延伸”三个基本反应步骤构成：
１．模板ＤＮＡ的变性
加热模板DNA至93℃左右一定时间后，其DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链，以便与引物结合，为下轮反应做准备。

２．模板ＤＮＡ与引物的退火（复性）
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

３．引物的延伸：ＤＮＡ模板
引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环“变性—退火—延伸”三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、ＰＣＲ技术的优缺点
１．ＰＣＲ技术的优点
（１）灵敏度高。

PCR产物的生成量以指数方式增加，能将皮克（pg =10-12）量级的起始待测模板扩增到微克
（μg =10-6）水平，能从100万个细胞中检出一个靶细胞。

在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

（２）简便快速。

PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行“变性—退火—延伸”反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。

扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，电泳分析无放射性污染，易推广。

（３）对标本的纯度要求低。

不需要分离病毒或细菌及培养细胞。

DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板，直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

２．ＰＣＲ技术的缺点
由于过高敏感性容易导致交叉扩增，当实验室污染后，可能出现假阳性结果，而在引物针对范围过窄或存在抑制剂情况下还会出现假阴性结果。

三、ＰＣＲ技术在畜禽传染病诊断中的应用
１．诊断细菌性疾病
（１）猪呼吸道致病菌混合感染。

胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌都是猪呼吸道常见的重要致病菌，都可能导致或者继发于其他病原感染。

这三种细菌引起的临床症状很难区分，多重感染也给传统的细菌学诊断方法带来困难。

PCR检测方法在检测临床样本时，尤其是当多种其他物种的DNA存在时，可能会出现非特异性扩增。

当非特异性扩增产物的大小和预计阳性产物大小相似时，就可能发生误判，出现假阳性结果。

为了对PCR产物进行定性，提高检测方法的特异性和敏感性，研究还建立了针对胸膜肺炎放线杆菌的PCR-ELISA检测方法。

（２）猪增生性肠炎。

猪增生性肠炎是由胞内劳森氏菌引起的猪的接触性传染病。

该菌可导致猪肠道功能严重损坏、腹泻、肠出血，而增厚的黏膜阻碍营养吸收，进而引起体重减轻，甚至造成死亡。

PPE实验室诊断方法可以快速准确检测到含有45pg/μL的样品总DNA模板。

PCR扩增能获得200bp特异性条带，与GenBank上公布的PHE/MN1-00株相应片段的核苷酸序列进行同源性分析，同源性若为99.50%，则表明扩增产物是特异性的目的片段。

此外，PCR技术还可用于副猪嗜血杆菌病、布鲁氏菌病、魏氏梭菌、猪链球菌等细菌性疾病的检测。

根椐GenBank中已发表的猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、伪狂犬病毒（PRV）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）等4种病毒基因序列，对各病毒基因区进行同源性分析，确定PRRSV M和N、PPV VP2、PRVgD、PCV-2ORF2基因的保守区为各病毒的诊断靶序列。

在建立各病毒单项PCR 技术的基础上，优化多重PCR反应条件，建立了4种病毒的四重PCR技术，可同时扩增PRRSV的660bp（北美株）、PPV 的313bp、PRV的217bp、PCV-2的447bp的特异性片段。

用82份临床病料对多重PCR技术和单项PCR/RT-PCR技术进行对比验证，结果显示，两者的总符合率为93%以上。

这表明建立的多重PCR检测方法，具有特异、快速、准确的特点，可用于对这4种病毒的同时检测和鉴别诊断。

（２）猪流感。

猪流感（Swine influenza，SI）是由正粘病毒科猪流感病毒引起的一种急性高度接触传染性的群发性猪呼吸道疾病。

临床以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭、高发病率、低死亡率为特征。

猪是禽、猪、人流感病毒共同的易感宿主。

根据GenBank上发表的多株猪流感病毒（SIV）序列，在保守区域设计1对引物，并对RT-PCR反应条件进行优化，建立可检测出多种亚型猪源流感病毒的RT-PCR方法。

通过对反应产物测序分析，与预期结果相符，证明该方法具有很强的特异性。

该方法可以检测出约1个TCID50的猪流感病毒，显示较高的敏感性。

通过对12份临床样品进行检测，结果发现该方法和其他两种方法分离病毒符合率相当。

该研究建立的猪流感RT-PCR诊断方法具有高特异性和敏感性，适用于SIV的诊断应用和推广。

（３）猪伪狂犬病。

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎为主要症状的一种重要传染病。

目前，在世界许多国家和地区屡见发病报道。

尤以猪的发病比较多见，成为重要的病毒贮存宿主和传染源。

根据伪狂犬病病毒（PRV）gB基因的序列，研究者设计并合成了一对引物，以闽A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件，建立了检测PRV的PCR方法。

应用该方法对分离的病毒进行基因扩增，获得了217bp的特异性DNA片段，证明了对分离病毒检测的特异性和敏感性，为伪狂犬病的快速诊断提供了条件。

此外，PCR技术还可用于口蹄疫、猪瘟、猪乙型脑炎、禽流感、鸡白血病、鸡新城疫等病毒病的诊断。

３．其他病原微生物
PCR技术已广泛用于衣原体、弓形虫、猪附红细胞体、安氏隐孢子虫、猪胸膜肺炎放线杆菌、鲁道夫对盲囊线虫等方面的诊断。

（作者单位：广西柳州畜牧兽医学校）
园林树木的优化环境功能及其文化内涵
文／卢福永
园林环境的生态含义是植被建植。

园林植物服务的主体是人，环境景观效应和改善人的生理健康、心理机能和精神状态密切相关。

在人与环境的关系中，人具有自然和社会的双重属性，与此相对应的环境，也即具有自然和社会的双重含义。

园林树木建植具有优化环境功能和丰富文化内涵的双重价值，在营造生态环境的同时，丰富园林植物的人文意识与审美价值，充分继承和弘扬民族文化，陶冶人民的思想情操，提高全社会文化艺术修养、行为道德水准和综合素质水平，致力于建立文化、历史、艺术相互融合与和谐的统一氛围。

一、园林树木景观建植的花文化内涵
中华文化源远流长，博大精深。

园林植物中的花木题材与传统工艺美术及音乐曲艺、宗教习俗等多方位应用与关联，更是广泛深入、不断升华，形成一种特殊的花文化体系，激发人民无限的创作灵感，给后世留下唇齿留香的美文和回味无穷的佳作，成为园林树木景观建植中的一朵艳丽奇葩。

１．花文化的精神内涵
花文化以园林建植景观为主题一脉相承，在我国已有数千年的锤炼发展。

历史以园林树木为主的词、赋甚多，如松之刚劲、柏之坚贞、牡丹富贵、竹子虚心、榴花热情。

陆游词“零落成泥碾作尘，只有香如故”的千古名句长久以来受人赞赏，引人诗涌不绝，联想浮翩，几入化境；陈毅元帅诗“大雪压青松，青松挺且直，欲知松高洁，待到雪化时”的豪情之作，铿锵有力，掷地有声，意境深邃，荡气回肠；白居易一曲《长恨歌》“玉容寂寞泪阑干，梨花一枝春带雨”，可见梨花的艺术形象与浓艳无关，而是美中略带忧伤，还透着几分超凡脱俗的仙气。

梅花是我国的传统名花，约在西汉初叶始就用于园林景观，至今已有2000多年的历史。

世界上第一部梅花专著《梅谱》云：“梅以韵胜，以格高。

”“韵”即风度韵味。

梅花色泽典雅清丽，暗香袭人沁肺。