植物组织培养基本技术
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④诱导分化、增殖和生根阶段一般选用IBA和NAA
10
2.细胞分裂素（CTK）： （1）作用： ①促进细胞分裂； ②诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长； ③抑制顶端优势，延缓离体组织衰老； ④对根的生长一般起抑制作用 （2）常用的细胞分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）
等。 （3）使用浓度：一般0.1~10.0mg/L
（4）有些生长调节物质不溶于水，2,4-D 、NAA 、 IAA 、GA3等在配制时可先用少量95%的乙醇溶 解。KT、6-BA等可先溶解于少量1mol/L的盐酸 中。叶酸则可先用少量稀氨水溶解。
18
3、配制好的母液贴上标签 标签：注明母液的名称、配制倍数、配制日期、配制人员及配1L培养基时
应移取的量。 注意：母液要低温保存，储存时间不易过长，有沉淀或霉菌，则不可再用。
4
（三）有机营养物质： 培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。 为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成 分主要有以下几类：
5
1、碳水化合物——碳源： 可作为碳源的有蔗糖，葡萄糖和果糖最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用浓度
在2%—5%，常用3%（30g/L），即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用 2.5%。
21
（三）计算： 1.欲配制1L MS＋6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L＋3%蔗糖+0.6%琼脂培养基，已知
MS母液已经配制完成，其浓度分别是：大量元素10倍，微量元素200倍，铁盐 100倍，有机物500倍， 1.0mg/ml 6-BA，0.1mg/ml NAA。 （1）计算各种母液、蔗糖和琼脂的用量 （2）叙述培养基的配制过程
26
（2）如茎、叶外被茸毛、蜡质、不光滑等，则用软毛刷蘸洗衣粉水刷洗 （3）流水冲洗 2.70%乙醇浸泡10~30s，无菌水冲洗1次 3.选择合适的消毒剂，浸泡适当时间 4.无菌水冲洗3~5次
27
第三节 灭菌消毒技术
一、物理灭菌方法： （一）高温灭菌： 1.高压蒸汽灭菌 （1）设备：高压蒸汽灭菌锅 （2）特点：简便、迅速、灭菌彻底 （3）适用范围：耐高压高温的培养基、无菌水、无
19
（二）培养基的制备方法
1.确定培养基配方及配制量； 2.根据配方和配制量计算出各种母液及糖、琼脂的用量。 3.按需吸取母液、称量蔗糖和琼脂。 4.用60%-70%培养基最终容积的蒸馏水将琼脂煮溶。 5.分别加入各种母液和糖，一些不耐热的激素在灭菌后用过滤灭菌法加入。
20
6.加蒸馏水定容至最终容积，调PH值。 7.分装 8.包扎 9.瓶身上做标记 10.高压灭菌 ：0.105 MPa，121℃，20~30min
才能混合，而且要注意先后次序，把钙离子、锰离子、钡离子和硫酸根、磷 酸根错开，以免相互结合生成沉淀。 • 另外，在混合各种无机盐时，稀释度应大，混合要慢，注意搅拌。
17
（2）在配制微量元素母液时也应注意药品的添加 顺序，以防止沉淀的产生。
（3）铁盐由于易被氧化，易与其他混合液产生沉 淀，因此铁盐应与Na2-EDTA混合配制成螯合铁。
3
2、微量元素：指小于0.5mmol／L的元素，包括 Fe，B，Mn，Cu，Zn，Mo，Co等。 Fe：常用FeSO4·7H20，因其在pH值5.2以上，易形
成Fe(OH)3的不溶性沉淀，通常FeSO4·7H20 和 Na2—EDTA结合成络合物使用。 B：H3BO3 Mn，Cu，Zn：常用其硫酸盐； Mo：Na2MoO4 Co: CoCl2
（3）常用浓度：0.1~5.0mg/L
（4）需注意的问题：
①IAA稳定性差——过滤灭菌，避光保存；
②生长素与细胞分裂素（CTK）配合使用：IAA/CTK比 值高，促进根的分化；IAA/CTK比值低，促进芽的分 化；IAA/CTK比值始终，形成愈伤组织，不分化
③ 2,4-D可有效诱导愈伤组织的形成，但对芽的形成具 有抑制作用，且使用浓度范围较窄，稍过量对植物组 织有毒害作用；
1、MS培养基——应用最为广泛 （1）特点：无机盐和离子浓度较高，硝酸盐含量较高 （2）适用范围：广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养
14
2.White培养基：其特点是无机机盐数量较低，适用 于生根培养，胚胎培养及一般的组织培养也可以 用，应用较广泛。
3.B5培养基：其主要特点是含有较低的铵，较高的硝 酸盐和VB1，铵对植物的生长有抑制作用。木本植 物尤其适宜在B5培养基上生长。
程。 2.注意事项： （1）接种过程中要树立无菌意识，保证无菌操作； （2）操作迅速。
33
3.无菌操作技术： （1）实验器具和材料的准备 （2）用70%的酒精擦拭超净工作台，开超净工作台和室内紫外灯。 （3）关紫外灯、打开风机，过5~10分钟进入缓冲间。 （4）用70%的酒精擦拭台面并消毒双手及实验用具。 （5）进行外植体的消毒与接种 （6）完成工作后清理工作台上的废弃物，用70%的酒精擦拭台面和双手
要因素； 2.外植体的生理状态和发育年龄 3.取材的季节 4.外植体的大小 5.外植体的来源 6.易于消毒
24
（二）外植体的类型 1.带芽的外植体——适于离体快繁，脱
毒培养 2.分化的器官和组织 3.种子和胚
25
二、外植体的消毒
1.外植体预处理： （1）适当修剪： ➢ 茎段：将茎上的叶片、叶柄等剪去，将茎剪成带有2~3个节的茎段； ➢ 叶：大叶剪成带叶脉的叶块； ➢ 根：修去老根死根等，剪成2~5cm的根段。
第二章 植物组织培养的 基本技术
1
第一节 培养基及其配制
一、培养基成分 培养基：供植物材料生长的人工配制的基质。 （一）水分：母液及培养基配制时，要用蒸 馏水，但大规模生产时，可用自来水代替。 （二）无机元素：
根据植物需要量的多少，可分为：大量 元素和微量元素。
2
1.大量元素：指浓度大于0.5mmol／L的元 素，包括：N、P、K、Ca、Mg、S等。 N：在制备培养基时以NO3-N和NH4-N两种形 式供应。常用含N物质有KNO3、NH4NO3、 (NH4)2SO4 P：常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。 K：常用的物质有KCI、KN03、 KH2P04 Ca、Mg、S： MgSO4·7H20、 CaCl2·2H2O
34
二、植物组织培养条件
一、温度 一般为20~30℃。喜温性植物如茄科、禾本科、兰科等26~28 ℃，冷凉性植物 如百合科、十字花科、菊科等18~22 ℃。培养室。一般设置（25±2）℃。
二、光照 1.光照强度 一般为2000~3000lx 2.光质： 一般在419~467nm 3.光周期: 16h的光照，8h的黑暗。
22
2.要配制1mol/L NaOH 100ml，1mol/L HCl 1000ml，则需称取 NaOH 多少克，量 取浓HCl 多少ml？
注：NaOH的摩尔质量是40g/mol，浓盐酸的摩尔浓度为12mol/L23Leabharlann 第二节 外植体的选择与消毒
一、外植体的类型 (一）外植体的选择原则 1.植物的基因型：决定植物组织培养难易程度的重
4.N6培养基：其特点是成分较简单，KNO3和（NH4） 2SO4含量高，广泛应用于小麦、水稻及其他植物 的花药培养和其他组织培养。
15
三、培养基的配制
（一）母液的配制及保存 1.母液的类型： • 大量元素母液（N 、P 、S 、K 、Ca 、Na 、Mg等
大量元素的无机盐混合液）10X或20X • 微量元素母液（Mn 、Mo 、Co 、Cu 、Zn 、B 、I
菌纸、接种工具、培养容器等 （4）要求：0.105MPa、121℃、20~30min
28
2.灼烧灭菌： （1）设备：酒精灯 （2）特点：简便、迅速 （3）适用范围：接种工具 （4）要求：用酒精灯外焰灼烧
29
3.干热灭菌： （1）设备：电热干燥箱、接种器械灭菌器 （2）特点：干燥、但耗时较长 （3）适用范围：金属接种工具 ，玻璃培养容器 （4）要求：160~170℃，1~2h，如有玻璃器皿则必须待温度降至50℃时，才能打
等微量元素的无机盐混合液）100X • 铁盐母液（一般使用螯合铁Fe-EDTA)100X • 有机营养母液（各种维生素和某些氨基酸的混合液）
100X • 植物激素母液（各种植物激素单独配制的母液）
100X
16
• 2、配制母液的注意事项： • （1）配制无机盐母液要防止混合各种盐时产生沉淀，各种药品必须在溶解后
6
7
8
5.天然有机附加物：如椰汁、香蕉汁、马铃薯汁、酵母提取液等。 （四）植物生长调节剂： 1、生长素类： （1）组培中的作用： ①促进细胞伸长； ②促进生根； ③诱导愈伤组织的形成； ④2,4-D会诱导某些植物不定胚的形成。
9
（2）常用的生长素：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸 （IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4D）
（二）常用化学消毒剂
灭菌剂
次氯酸钙 次氯酸钠 氯化汞 抗菌素
使用浓度 (%) 9~10 2 0.1~1 4~50mg/L
持续时间 （min） 5~30 5~30 5~8 30~60
去除的难 易 易 易 较难 中
效果
很好 很好 最好 较好
32
第四节 接种与培养技术
一、接种 1.定义：把无菌的培养物或经过表面消毒后的外植体，转移到新鲜培养基上的过
35
三、湿度 一是 培养器皿内的湿度条件 二是培养环境的湿度条件70%~80%
四、气体 氧气；废气
36
作业
1.培养基的成分包括哪些？ 2.配制母液时应注意什么？ 3.植物生长物质为什么要单独配制母液？ 4.详细论述培养基的配制过程。
37
谢谢聆听！
38
11
3.其他生长调节剂： （1）GA：赤霉素 ①作用： a.促进幼苗茎的伸长和不定胚发育为小植株 b.与生长素协同作用，对形成层的分化有影响：
IAA/GA比值高时，有利于木质部分化 IAA/GA比值低时，有利于韧皮部分化 c.打破休眠 d.抑制器官和胚状体的形成，但二者形成后，又可 促进其生长 ②常用浓度：0.1-0.5mg/L
12
（2）ABA：脱落酸 a.促进胚状体的发生 b.促进胚状体发育成熟但不萌发 （五）凝固剂：琼脂、卡拉胶等 浓度：一般0.4%~0.7% （六）其他物质 1.活性炭（AC）：防止外植体褐变；降低玻璃苗的产生率；有利于生根，一般
0.5%~3% 2.抗生素： 3.抗氧化物质
13
三、培养基的类型及特点
开烘箱门，以防温度骤降玻璃破碎。
30
（二）紫外线灭菌：紫外灯，适于接种室、培养室及超净工作台的空气和物体表 面灭菌。
（三）过滤灭菌：细菌过滤器、注射器，适用于高温高压下易分解的试剂，主要 是植物生长调节物质，如IAA、GA3、ZT的灭菌。
31
二、化学方法
（一）适用范围：适用于外植体表面、接种器械表面、 环境、空气和操作人员皮肤的消毒。
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2.细胞分裂素（CTK）： （1）作用： ①促进细胞分裂； ②诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长； ③抑制顶端优势，延缓离体组织衰老； ④对根的生长一般起抑制作用 （2）常用的细胞分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）
等。 （3）使用浓度：一般0.1~10.0mg/L
（4）有些生长调节物质不溶于水，2,4-D 、NAA 、 IAA 、GA3等在配制时可先用少量95%的乙醇溶 解。KT、6-BA等可先溶解于少量1mol/L的盐酸 中。叶酸则可先用少量稀氨水溶解。
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3、配制好的母液贴上标签 标签：注明母液的名称、配制倍数、配制日期、配制人员及配1L培养基时
应移取的量。 注意：母液要低温保存，储存时间不易过长，有沉淀或霉菌，则不可再用。
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（三）有机营养物质： 培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium)。 为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成 分主要有以下几类：
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1、碳水化合物——碳源： 可作为碳源的有蔗糖，葡萄糖和果糖最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用浓度
在2%—5%，常用3%（30g/L），即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用 2.5%。
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（三）计算： 1.欲配制1L MS＋6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L＋3%蔗糖+0.6%琼脂培养基，已知
MS母液已经配制完成，其浓度分别是：大量元素10倍，微量元素200倍，铁盐 100倍，有机物500倍， 1.0mg/ml 6-BA，0.1mg/ml NAA。 （1）计算各种母液、蔗糖和琼脂的用量 （2）叙述培养基的配制过程
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（2）如茎、叶外被茸毛、蜡质、不光滑等，则用软毛刷蘸洗衣粉水刷洗 （3）流水冲洗 2.70%乙醇浸泡10~30s，无菌水冲洗1次 3.选择合适的消毒剂，浸泡适当时间 4.无菌水冲洗3~5次
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第三节 灭菌消毒技术
一、物理灭菌方法： （一）高温灭菌： 1.高压蒸汽灭菌 （1）设备：高压蒸汽灭菌锅 （2）特点：简便、迅速、灭菌彻底 （3）适用范围：耐高压高温的培养基、无菌水、无
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（二）培养基的制备方法
1.确定培养基配方及配制量； 2.根据配方和配制量计算出各种母液及糖、琼脂的用量。 3.按需吸取母液、称量蔗糖和琼脂。 4.用60%-70%培养基最终容积的蒸馏水将琼脂煮溶。 5.分别加入各种母液和糖，一些不耐热的激素在灭菌后用过滤灭菌法加入。
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6.加蒸馏水定容至最终容积，调PH值。 7.分装 8.包扎 9.瓶身上做标记 10.高压灭菌 ：0.105 MPa，121℃，20~30min
才能混合，而且要注意先后次序，把钙离子、锰离子、钡离子和硫酸根、磷 酸根错开，以免相互结合生成沉淀。 • 另外，在混合各种无机盐时，稀释度应大，混合要慢，注意搅拌。
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（2）在配制微量元素母液时也应注意药品的添加 顺序，以防止沉淀的产生。
（3）铁盐由于易被氧化，易与其他混合液产生沉 淀，因此铁盐应与Na2-EDTA混合配制成螯合铁。
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2、微量元素：指小于0.5mmol／L的元素，包括 Fe，B，Mn，Cu，Zn，Mo，Co等。 Fe：常用FeSO4·7H20，因其在pH值5.2以上，易形
成Fe(OH)3的不溶性沉淀，通常FeSO4·7H20 和 Na2—EDTA结合成络合物使用。 B：H3BO3 Mn，Cu，Zn：常用其硫酸盐； Mo：Na2MoO4 Co: CoCl2
（3）常用浓度：0.1~5.0mg/L
（4）需注意的问题：
①IAA稳定性差——过滤灭菌，避光保存；
②生长素与细胞分裂素（CTK）配合使用：IAA/CTK比 值高，促进根的分化；IAA/CTK比值低，促进芽的分 化；IAA/CTK比值始终，形成愈伤组织，不分化
③ 2,4-D可有效诱导愈伤组织的形成，但对芽的形成具 有抑制作用，且使用浓度范围较窄，稍过量对植物组 织有毒害作用；
1、MS培养基——应用最为广泛 （1）特点：无机盐和离子浓度较高，硝酸盐含量较高 （2）适用范围：广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养
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2.White培养基：其特点是无机机盐数量较低，适用 于生根培养，胚胎培养及一般的组织培养也可以 用，应用较广泛。
3.B5培养基：其主要特点是含有较低的铵，较高的硝 酸盐和VB1，铵对植物的生长有抑制作用。木本植 物尤其适宜在B5培养基上生长。
程。 2.注意事项： （1）接种过程中要树立无菌意识，保证无菌操作； （2）操作迅速。
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3.无菌操作技术： （1）实验器具和材料的准备 （2）用70%的酒精擦拭超净工作台，开超净工作台和室内紫外灯。 （3）关紫外灯、打开风机，过5~10分钟进入缓冲间。 （4）用70%的酒精擦拭台面并消毒双手及实验用具。 （5）进行外植体的消毒与接种 （6）完成工作后清理工作台上的废弃物，用70%的酒精擦拭台面和双手
要因素； 2.外植体的生理状态和发育年龄 3.取材的季节 4.外植体的大小 5.外植体的来源 6.易于消毒
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（二）外植体的类型 1.带芽的外植体——适于离体快繁，脱
毒培养 2.分化的器官和组织 3.种子和胚
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二、外植体的消毒
1.外植体预处理： （1）适当修剪： ➢ 茎段：将茎上的叶片、叶柄等剪去，将茎剪成带有2~3个节的茎段； ➢ 叶：大叶剪成带叶脉的叶块； ➢ 根：修去老根死根等，剪成2~5cm的根段。
第二章 植物组织培养的 基本技术
1
第一节 培养基及其配制
一、培养基成分 培养基：供植物材料生长的人工配制的基质。 （一）水分：母液及培养基配制时，要用蒸 馏水，但大规模生产时，可用自来水代替。 （二）无机元素：
根据植物需要量的多少，可分为：大量 元素和微量元素。
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1.大量元素：指浓度大于0.5mmol／L的元 素，包括：N、P、K、Ca、Mg、S等。 N：在制备培养基时以NO3-N和NH4-N两种形 式供应。常用含N物质有KNO3、NH4NO3、 (NH4)2SO4 P：常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。 K：常用的物质有KCI、KN03、 KH2P04 Ca、Mg、S： MgSO4·7H20、 CaCl2·2H2O
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二、植物组织培养条件
一、温度 一般为20~30℃。喜温性植物如茄科、禾本科、兰科等26~28 ℃，冷凉性植物 如百合科、十字花科、菊科等18~22 ℃。培养室。一般设置（25±2）℃。
二、光照 1.光照强度 一般为2000~3000lx 2.光质： 一般在419~467nm 3.光周期: 16h的光照，8h的黑暗。
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2.要配制1mol/L NaOH 100ml，1mol/L HCl 1000ml，则需称取 NaOH 多少克，量 取浓HCl 多少ml？
注：NaOH的摩尔质量是40g/mol，浓盐酸的摩尔浓度为12mol/L23Leabharlann 第二节 外植体的选择与消毒
一、外植体的类型 (一）外植体的选择原则 1.植物的基因型：决定植物组织培养难易程度的重
4.N6培养基：其特点是成分较简单，KNO3和（NH4） 2SO4含量高，广泛应用于小麦、水稻及其他植物 的花药培养和其他组织培养。
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三、培养基的配制
（一）母液的配制及保存 1.母液的类型： • 大量元素母液（N 、P 、S 、K 、Ca 、Na 、Mg等
大量元素的无机盐混合液）10X或20X • 微量元素母液（Mn 、Mo 、Co 、Cu 、Zn 、B 、I
菌纸、接种工具、培养容器等 （4）要求：0.105MPa、121℃、20~30min
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2.灼烧灭菌： （1）设备：酒精灯 （2）特点：简便、迅速 （3）适用范围：接种工具 （4）要求：用酒精灯外焰灼烧
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3.干热灭菌： （1）设备：电热干燥箱、接种器械灭菌器 （2）特点：干燥、但耗时较长 （3）适用范围：金属接种工具 ，玻璃培养容器 （4）要求：160~170℃，1~2h，如有玻璃器皿则必须待温度降至50℃时，才能打
等微量元素的无机盐混合液）100X • 铁盐母液（一般使用螯合铁Fe-EDTA)100X • 有机营养母液（各种维生素和某些氨基酸的混合液）
100X • 植物激素母液（各种植物激素单独配制的母液）
100X
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• 2、配制母液的注意事项： • （1）配制无机盐母液要防止混合各种盐时产生沉淀，各种药品必须在溶解后
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5.天然有机附加物：如椰汁、香蕉汁、马铃薯汁、酵母提取液等。 （四）植物生长调节剂： 1、生长素类： （1）组培中的作用： ①促进细胞伸长； ②促进生根； ③诱导愈伤组织的形成； ④2,4-D会诱导某些植物不定胚的形成。
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（2）常用的生长素：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸 （IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4D）
（二）常用化学消毒剂
灭菌剂
次氯酸钙 次氯酸钠 氯化汞 抗菌素
使用浓度 (%) 9~10 2 0.1~1 4~50mg/L
持续时间 （min） 5~30 5~30 5~8 30~60
去除的难 易 易 易 较难 中
效果
很好 很好 最好 较好
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第四节 接种与培养技术
一、接种 1.定义：把无菌的培养物或经过表面消毒后的外植体，转移到新鲜培养基上的过
35
三、湿度 一是 培养器皿内的湿度条件 二是培养环境的湿度条件70%~80%
四、气体 氧气；废气
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作业
1.培养基的成分包括哪些？ 2.配制母液时应注意什么？ 3.植物生长物质为什么要单独配制母液？ 4.详细论述培养基的配制过程。
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谢谢聆听！
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3.其他生长调节剂： （1）GA：赤霉素 ①作用： a.促进幼苗茎的伸长和不定胚发育为小植株 b.与生长素协同作用，对形成层的分化有影响：
IAA/GA比值高时，有利于木质部分化 IAA/GA比值低时，有利于韧皮部分化 c.打破休眠 d.抑制器官和胚状体的形成，但二者形成后，又可 促进其生长 ②常用浓度：0.1-0.5mg/L
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（2）ABA：脱落酸 a.促进胚状体的发生 b.促进胚状体发育成熟但不萌发 （五）凝固剂：琼脂、卡拉胶等 浓度：一般0.4%~0.7% （六）其他物质 1.活性炭（AC）：防止外植体褐变；降低玻璃苗的产生率；有利于生根，一般
0.5%~3% 2.抗生素： 3.抗氧化物质
13
三、培养基的类型及特点
开烘箱门，以防温度骤降玻璃破碎。
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（二）紫外线灭菌：紫外灯，适于接种室、培养室及超净工作台的空气和物体表 面灭菌。
（三）过滤灭菌：细菌过滤器、注射器，适用于高温高压下易分解的试剂，主要 是植物生长调节物质，如IAA、GA3、ZT的灭菌。
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二、化学方法
（一）适用范围：适用于外植体表面、接种器械表面、 环境、空气和操作人员皮肤的消毒。