治疗性结核DNA疫苗SDS含量检测

治疗性结核D N A疫苗S D S含量检测
孔雯雯\魏荣华1，王玮\周飞燕1,梁艳2，吴雪琼2,倪世明、黄明\丨.广州白云山拜迪生物医药有限公司，广东广州511495;2.中国人民解放军总医院第八医学中心结核病重点实验室，北京100091)
摘要：目的应用吖啶橙法来检测治疗性结核D N A疫苗中的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,S D S)的残留量方法
将S D S标准液与吖啶橙混合后，经甲苯萃取处理后在波长499 m n测定吸光度值，根据标准曲线计算供试品中S D S的含量 结果S D S浓度在0.005~0.32 mg.mL—1的范围内，相关系数；■ >0.99,线性关系良好…该法受高溫、辅料和核酸的影响较小
3批制剂的S D S残留量均小于0.02 mg.mL—1。

结论建立的方法操作简便、专属性、准确度和重现性较好，可用于结核D N A 疫苗制剂中S D S残留量的检测,：
关键词：十二烷基硫酸钠；结核；D N A疫苗；吖啶橙
中图分类号：R917 文献标志码：A 文章编号：1674-229X(2021) 01-0039-04
Doi ：10.12048/j.issn.1674-229X.2021.01.008
Determination of the Contents of Sodium Dodecyl Sulfate in Therapeutic Tuberculosis DNA Vaccine
K O N G Wenwen'.WEI Ronghua1,W ANG Wei1,ZH O U Feiyan1,LIA NG Yan2,W U Xueqiong2,NI Shiming1, HUANG M i n g1 ( 1. Guang"z/i〇u Bai Yun Shan Baidi Bio-Technology C o., L id, Guangzhou, Guangdong 5W495, C hina;2. Tuberculosis Key Laboratory , the Sth Medical Center o f PLA General Hospital, Beijing100091 , C hina)
A B S T R A C T:O B JE C T IV E T(> develop a metlunl f or the content determination of sodium
tuberculosis DNA vaccine by acridine orange. M E T H O D S The standard solution of SDS was mixed with acridine orange, then the mixture was extrac ted with toluene and determined the absorbance at the wavelength of 499 nm.The concentration of SDS in samples could be determined by standard t;urve. R E SU L T S The standard curve of SDS concentration showed good linearity at the range of 0.005-0.32mg-niL 1 (r>0.99). And the method was relatively smaller affection by high tem perature,excipients and nucleic acid.The content of SDS from three batches of preparations were all lower than 0.02 mg • mL 1. C O N C LU SIO N The developed method is sim ple,spec ific,accurate,and reproducible,which can he used for the determination of SDS residue in tuberculosis DNA vaccine.
K EY W O R D S：sodium dodecyl sulfate；tuberculosis； DNA vaccine；acridine orange
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的传染病，我国是结核病发病率较高的国家之一 目前临床使用最广泛的结核疫苗是卡介苗，它也是唯一应 用于人类结核病的预防性疫苗[4<。

卡介苗可以有 效预防新生儿及儿童的肺结核疾病,但对成人肺结 核的预防效果非常弱，其免疫保护效率为〇~ 80%[w°]，随着免疫学和分子生物学的迅速发展，新 型的结核疫苗已得到广泛研究，如灭活疫苗、活疫 苗、核酸疫苗和重组蛋白疫苗等，其中DNA疫苗以 其安全、经济、有效等优点，成为近年来结核疫苗研 究的热点之一[11—13]。

新型结核DNA疫苗是通过基因重组技术构建的嵌合型基因质粒DNA,该疫苗既保留了抗原性，又增强了诱导细胞免疫力的功能。

其在生产过程中 需加人SDS进彳了杂蛋白等的去除,SDS是一种在医 药和化T等行业广泛应用的阴离子表面活性剂，具 有良好的乳化性、起泡性、水溶性等特点[1446]。

SDS 在药品生产中可作为药用辅料、乳化剂或湿润剂等[17]。

另外，过量的SDS对鲎试剂法测定内毒素和 抑菌圈法测定抗生素残留也存在一定干扰，需将 SDS稀释后可避免试验干扰％〜。

目前尚未对SDS 残留量的法定标准，但为确保新型结核DNA疫苗的 质量和结果的可靠性，需将产品中SDS的残留量控 制在一定的范围内。

基金项目：国家科技重大专项资助（20I8ZX10731301-005-003)
作者简介：孔突突，项士研究生，工程师，研究方向：生物医药的质量控制，E-mail :enya87@
今日药学 2021 年1月第 31 卷第1期Pharmacy Today，202A January，Vol. 31 No. I
目前文献报道测定SDS含量的方法主要有光谱 法和色谱法n8_2n,光谱法中吖啶橙-紫外可见分光光 度法操作简便、快速，而高效液相色谱法或气相色谱 法操作相对复杂且需要昂贵的设备。

本文采用吖啶 橙法并结合多功能酶标仪对微量样品进行检测，并 对治疗性结核DNA疫苗中SDS的含量测定进行方 法学研究，以期为新型结核DNA疫苗质量标准的建 立提供依据。

1仪器与试药
1.1仪器
U-3310型紫外分光光度计（日本Hitachi公 司）；Spectra M ax 34〇PC384 型酶标仪（美国 Molecu­lar Devices公司 ）；BP221S 电子天平 （瑞士梅特勒公 司）；TDL-5-A大容量离心机（上海安亭科学仪器厂
1.2试药
甲苯（广州化学试剂厂，批号:20180303-2);吖啶橙（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160215);硫酸氢钠（广州化学试剂厂，批号：20140901-】）；十二烷基硫酸钠（国药集团化学试剂 有限公司，批号：20140326;阿拉丁，批号：G1604048);氯化钠（广州化学试剂厂，批号：20180803-2);磷酸氢二钠（广州化学试剂厂，批号：20160801-1,20150602-1)。

结核DNA疫苗成品（广州白云山拜迪生物医药 有限公司，批号:20170301,20170302,20170303)。

2方法与结果
2.1 试液配制
SDS标准液的配制：称取0.128 g SDS加人超纯 水溶解，定容至100 mL,制成1.28 mg*m L—1的SDS 标准品储备液。

然后加水稀释至0.32,0.16,0.08, 0.04,0.02,0.005 mg.m LH备用。

2.2样品测定方法
吸取标准液或供试品100 (xL，加入100 pL0.4%吖啶橙，再加人3 mL甲苯振荡混勻3 min，2 000 r.min—1离心5 min，吸取适量上清液置于96孔板中，在 499 nm波长的测定吸光度值（酶标仪），以各成分 进样浓度（mg*ml/1)为纵坐标（y)，吸光度值为横 坐标U)，绘制线性回归曲线，通过标准曲线计算出 供试品中SDS含量。

2.3方法学考察
2.3.1专属性辅料干扰试验:在PBS溶液中加入.40 . Pharmacy Today , 2021 January, Vol. 31 No. 1SDS标准液，使SDS的终浓度为0.16 m g.ml/1，作为 供试品溶液，供试品做3个平行样，用“2.2”项下方 法测定，计算供试品中SDS的含量。

测得供试品中 SDS平均回收率为95.4%,ftSD为2.32%。

核酸干扰试验:在水中按成品的规格加入结核质 粒DNA和SDS标准液，使SDS终浓度为0.16 mg.m L—1作为供试品，供试品做3个平行样，用“2.2”项下的方 法测定，计算供试品中SDS的含量。

测得供试品中 SDS平均回收率为98.9%，/«D为3.43%。

高温破坏试验:取制剂成品适量加入SDS标准 液，使SDS终浓度为0.16 ,平行制备2份供试品溶液。

取1份供试品溶液在高温（60 T)下震 荡处理24 h。

取经高温震荡处理的供试品和未经处 理的供试品，按“2.2”项下方法测定。

经高温震荡处 理的供试品平均回收率为99.0%,为2.81%,未 经高温震荡处理的供试品平均回收率为105%，
为2.12%。

结果表明辅料干扰、核酸干扰及高温破坏试验 下供试品冋收率分别为95.4%、98.9%和99.0%，其 中高温下样品回收率略高于其它条件的回收率，结 合/推测可能为不同条件对回收率存在一定程度的干扰或者是方法本身的误差所致。

但是从不同 条件下的回收率数据分析，该方法受到辅料、核酸及 高温的干扰较小,专属性较强。

2.3.2精密度重现性:取浓度为0.16mg.m L_l的SD S 标准液作为供试液，按“2.2”项下方法测定，平行检测3 次，SD S含量分别为 0.151,0.156,0.149 mg.ml/1为2.37% 0
中间精密度:取浓度为0.16 mg_ml/1的标准品 由不同人员按“2.2”项下方法进行测定，各做3个平 行样，测得SDS含量的/LSD均小于5.00%。

2.3.3加样回收试验取SDS标准液加入成品制 剂中，使终浓度为 0.32,0.16,0.02 mg-mL1，按“2.2”项下方法测定，每个浓度的供试品做3个平行,供试品 的平均回收率分别为115.13% ,1002%和丨05.82%。

结合专属性结果比较发现，加样回收率相对专 属性回收率较高，推测可能为辅料、核酸和高温条件 对回收率的干扰导致专属性试验中回收率低于加样 回收率。

2.3.4最低检测限取浓度为0.02和0.005 mgiml/1的SDS标准液，各做3个平行样，按“2.2”项下方 法测定，测得的SDS含f i的分别为 2.64%、4.92% 0
今H药学2021年I月第31卷第丨期
2.3.5 线性关系取0.32,0.16,0.08,0.04,0.02, 0.005 mg-m L1的SDS标准液，测定3次，通过线性 回归计算相关系数r，线性方程分别为y= 0.949.r+ 0.011(r= 0.997)，y= 0.83(k+0.013(r= 0_994)和；r= 0.753x+a〇13(r=0.995)，结果相关系数r均大于0.99。

2.3.6耐用性不同厂家的SDS:取两种不同厂家 (国药集团化学试剂有限公司和阿拉丁）的SDS配 制成2份0.16 mg.m l/1SDS供试品溶液，每个条件 下各做10个平行样，按“2.2”项下方法测定，用t检 验比较两组测定结果的差异，P= 〇.〇〇9,不同厂家的 SDS测定结果无显著性差异。

结果表面，该检测方 法对不同厂家的SDS耐用性良好。

2.3.7溶液稳定性取0.32和0.16 mg•m L—1的标 准品溶液分别于室温和2 ^~8 t的条件下放置24 h，取0 h、室温放置24 h和2 t~8 X：放置24 h的供 试品，每个条件下各做10个平行样，按“2.2”项下方 法进行测定并用 <检验比较同一供试品浓度，不同条 件下测定结果的差异，计算结果见表1。

结果表明不 同条件下测定结果差异无统计学意义，溶液的稳定性 较好。

表1溶液稳定性结果
浓度/mg.m L-1供试品比较户值
0.32O h与室温放置24 h0.007
Oh 与2 t~8t放置 24 h0.001
0.16〇h与室温放置24 h0.004
0 h与2尤〜8 X：放置24 h0.001
2.4紫外分光光度法测定
2.4.1 线性关系考察吸取0.32,0.16,0.08,0.04, 0.02，0.005 m g.m L—1SDS标准液各 100 |xL，加人 100从0.4%吖啶橙，再加人3 mL甲苯振荡混匀 3 min，2 000 r•m in 1离心5 min,吸取适量上清液置 于比色皿中，在紫外分光光度计中测定499 nm波长 下的吸光度值，并绘制线性回归曲线。

经检测，其线 性方程为y=0.382：c-0.005,相关系数r为0.95。

2.4.2重现性考察取浓度为0.16 my ml/1的SDS 标准液作为供试液，按“2.
3.7 ”项下方法平行测定3 次，检测结果的fiSD为5.80%。

2.5待测样品的SDS残留量检测
取3批结核DNA疫苗成品作为供试品，按 “2.2 ”项下方法和“2.4.1”项下方法分別进行检测，并计算SDS残留量，由结果可知，3批样品用两种方 法检测,SDS残留量均低于0.02 m g M if,符合内控 要求。

表2 3批结核DNA疫苗的SDS残留量
批号
酶标仪紫外分光光度计
SDS含量
/m g. m l;1
RSD/%
SDS含量
/mg* m l/1
RSD/% 201703010.007 2 4.810.007 5 4.32 201703020.008 7 3.930.012 0 4.89 201703030.007 9 3.200.011 0 4.56
3结论
SDS是具有亲水性和疏水性的两性分子，可用 有机物萃取方法进行定量分析。

Roger等[22]于1981 年建立了吖啶橙法对SDS含量的测定。

本文采用甲 苯萃取SDS后将混合物与吖啶橙反应，分别用紫外 可见分光光度计和酶标仪在499 nm处测定反应物 的吸光度值，通过比较，酶标仪检测的结果r值均大 于0.99。

推测由于酶标仪可使用96孔板对多组样 品进行同步测定，减小了操作误差，提高了方法的精 密度。

另外，结果显示该法在检测过程中专属性较 强，受辅料、核酸和高温的影响较小，且具有精密度、准确性、灵敏度较高，方法简便省时、耐用性好等 优点。

采用通过验证的方法对3批结核DNA疫苗成品 进行检测，结果成品的SDS含量均小于0.02 m g•ml/1，满足质控要求。

该法适用于对新型结核DNA疫苗 的SDS残留量检测，也为其它DNA疫苗的质量控制 方法提供了一定参考。

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(上接第34页）
3.3结果分析
样品含量测定结果显示，丹参素含量范围1.9〜
2.4 mg*g_1(平均2.2 mg*g_l )，丹酣酸B含量范围
3.8〜
4.8 111呂.8_|(平均含量4.3〇1§.呂_1)，两者总量范围为6.0〜7.2 m g f1(平均6.5 m g O。

13批样品 含量测定结果差异较小，表明投料用丹参药材质量 较稳定。

其中丹酚酸B的含量较高，约为丹参素含 量的2倍，以两种成分的总含量作为中风回春丸中 丹参药材的控制指标较为合理。

该方法简便易行，灵敏可靠，为原标准的补充完善提供了试验依据。

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• 42 •Pharmacy Today, 2021 January , Vol. 31 No. 1今闩药学2021年1月第31卷第1期。