Waters高效液相色谱维护与保养

3）将柱子反过来（回到通常的流动方向）用分析所 用流动相冲柱子，（用与上一上步骤同样的条件） 直到基线平稳方可使用。
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钙柱再生的时间
3、柱子再生的时间：根据相关的样品含有较 多重金属和过渡金属元素或是有机酸的样 品越是需要经常地对柱子进行再生，因为 它们会与柱子发生转换。 检测是否需要再生可以通过注射蔗糖来测 试柱子的置换，如果蔗糖的峰有明显拖尾， 那么柱子需要做以下处理：
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术语
8、色谱峰：色谱柱流出组分通过检测器时产生的 响应信号的微分曲线。
9、峰底：峰的起点与终点间的直线 10、峰高：在峰的两侧拐点处所作切线与峰底相
交两点之间的距离。 11、半峰宽（W1/2）：通过峰高的中点做平行与 峰底的直线，与其峰两侧相交两点间的距离。 12、峰面积（A）：峰与峰底间的面积，又称作 响应值。 13、拖尾峰：后沿较前沿平缓的不对称峰。 14、前伸峰：前沿较后沿平缓的不对称峰
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术语
21、排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是 利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗 透程度的不同，以使组分分离。它类似于分子筛 的作用，按分子大小进行分离。试样进入色谱柱 后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。 在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排 阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现， 一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒 中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上 最后出现。例如：我们常用的 ks-802色谱柱
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以下课件是我在使用、操作、高效液 相色谱仪十年中积累的经验，以及集 合外部学习的经验所写，如有讲的不 好、错误之处，请大家及时指出，我
们共同学习！ 质检：
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Waters高效液相色谱常见故障与解 析
第一部分常用术语 第二部简述HPLC的组成 第三部分主要讲液相常见故障与解析| 第四部分简谈示差检测的原理 第五部分：色谱柱的维护与保养
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B、 流动相流动正常，但没有压力显示
B、 泵内有液流出，但使没有压力显示
原因
解决方法
1、柱塞杆折断
1、更换柱塞杆
2、压力传感器损坏 2、更换压力传感器
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C、压力高
“堵”
原因
解决方法
1、流速设定过高 1、调整流速设定
2、柱前筛板堵塞 2、a、反冲色谱柱
19、淋洗体积 ：从进样开始计算的通过色谱柱的 实际淋洗体积
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术语
20、反相色谱柱 反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键
合有极性相对较弱的官能团的键合相。反 相色谱所使用的流动相极性较强，通常为 水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。样品 流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被 冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更 强的保留。常用的反相填料有C18（ODS）、 C8（MOS）、C4（B）
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第一部分术语
22、面积归一法：将所有峰的面积总和定为1， 测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外 的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面 积的百分率。是包含水分在内的一个计算 结果。
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第一大部分术语
23 .面积外标法：外表法就是用标准品的峰面积或峰 高与其对应的浓度做一条标准曲线,测出样品的峰 面积或峰高,在标准曲线上查出其对应的浓度,这是 最常用的一种定量方法
1、钙柱：此色谱柱由钙基树脂填装而成，氢 离子或其它离子会取代钙离子，或是引起 与柱中糖的转换，尤其是像蔗糖这样易于 转换的糖，因此推荐在流动相中加入一定 量的钙离子不保持平衡和防止与样品的转 换。 要保持装流动相的瓶子干净，有盖子，且 新鲜，流动相需要每24小时重新配制。
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第一部分术语
1、液相色谱法：就是用液体作为流动相的 色谱法。
2、固定相：在色谱法中，静止不动的一相 （固体或液体）称为固定相
3、流动相：能运动的一相（一般是气体或 液体）称为流动相
4、色谱图：色谱柱流出物通过检测器时所 产生的响应信号对时间的曲线图。纵坐标 为信号强度（通常我们所说的样品浓度）， 横坐标为保留时间。 5、基线：在无组分通过色谱柱时，检测器 的噪音随时间变化而产生的曲线 Waters高效液相色谱维护与保养
解决方法
1、a、溶剂脱气 b、从泵中除去气体
2、超声或更换单向阀 3、更换泵密封 圈 4、确定漏液位置并维修 5、由于流动相粘度的变化引起 ， 充分平衡系统
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从色谱图的异常情况推测
A、基线漂移
原因
解决方法
1、温度变化
1、室内恒温，或使用柱温箱
2、系统未平衡
2、充分用流动相平衡
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示差折光检测器原理
检测器的光路是由光源、凸镜、检测池、 反射镜、平板玻璃、双光敏电阻等主要部 件组成，检测池有参比，测量两个池室， 它们对光路来说是串联的。
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示差检测器原理
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第四部分色谱柱的维护与保养
手动进样：应使用液相色谱专用平头进样针 吸液至少大于5-10倍定量环体积 转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置
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2414示差检测器原理
示差检测器是基于连续测定样品流路和参 比流路之间折射率的变化来测定样品含量 的。光从一种介质进入另一种介质时，由 于两种物质的折射率不同就会产生折射。 只要样品组分与流动相的折光指数不同， 就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高， 在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓 度成正比
从压力变化推测
A、 没有压力显示，没有流动相流动
原因 1、电源问题 2、保险丝被烧坏 3、柱塞杆折断 4、泵头内有空气 5、流动相不足
6、吸滤头堵 7、单向阀损坏 8、漏液
解决方法 1、接通电源，开机 2、更换保险丝 4、更换柱塞杆 5、启动泵抽出空气 5、补充流动相 6、更换或超声入口滤头 7、更换单向阀 8、拧紧或更换手紧接头
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第四部分色谱柱的维护与保养
4柱子的再生步骤：
1） 配制500ml的再生溶液（500mg EDTA_Ca/L 2） 把柱子流路方向反过来，在90℃下以 0.5ml/min的流速冲洗一整夜； 3） 再生之后回到正常方向使用。 当柱子反冲时，很重要的一点是需要保持溶剂的温 度从而确保正确的冲洗，用冷的溶剂将会延缓冲洗 的过程。
3、流动相不互溶

3、选择互溶的流动相
4、混合器混合效果不好 4、维修或更换混合器，
或者不走梯度时用单一泵
5、氘灯能量不足
5、更换氘灯
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C.保留时间变化
原因
1、温度变化 2、系统未平衡 3、流动相组成变化 4、色谱柱污染 5、色谱柱寿命 6、流速变化 7、柱压变化
术语
6、基线噪声:没有溶质通过检测器时，检测器输 出信号的随机扰动变化。（就是没有打进样品而 直接查看基线时所产生的杂峰）
7、基线漂移：基线随时间的增加朝单一方向的偏 离称为漂移。反映的是信号连续的递增和递减。 产生原因：电源电压不稳、色谱系统未达到平衡、 固定相流失、流动相的变化、温度和流量的波动
检测系统
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进样系统
手动进样
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N2000色谱工作站
数据处理系统
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第三部分液相常见故 障及解决方案
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从泵的压力变化推测
A、 泵内没有压力显示，没有流动相流动
b、更换色谱柱
3、流动相使用不当 3、a、使用恰当的流动相
或缓冲盐的结晶沉
b、冲洗色谱柱
淀
4、色谱柱选择不当 4、选择恰当的色谱柱
5、柱温过低
5、提高温度
6、保护柱阻塞
6、清洗或更换保护柱
7、在线过滤器阻塞Waters7高、效液相清色谱洗维护或与保养更换在线过滤器 22
D、压力低
“漏”
原因
1、流速设定过低
分离系统 -色谱柱
数据分析 系统
检测系统
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数据处理系统
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Waters515泵
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输液系统——输
输出流量恒定 压力平稳 足够的动力
高压输液泵
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Waters2414示差检测器
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新的钙柱使用注意事项
2新色谱柱的使用：为了保证新柱子能在分析使用之 前得到足够的钙离子的平衡
1）将柱子按照通常使用的反方向安装（标签上的箭 头指向柱子的入端口）；
2）用至少100ml的0.001M EDTA钙盐溶液在90℃ 用 0.5ml/min流速反冲柱子，500mg/L的钙盐的浓度 大约为0.001M；
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术语
15、死时间（t0）:不被固定相滞留的组分，从进 样到出峰最大之所需的时间
16、保留时间（tR）：组分从进样到出峰最大之 所需的时间。
17、死体积（V0）：不被固定相滞留的组分，从 进样到出峰最大之所需的流动相的体积
18、柱外体积 ：从进样系统到检测器之间色谱柱 以外的液路部分中流动相所占有的体积。
气泡运行状态
判断
措施
一走一停
正常
一走一停一退 一走一退
入口单向阀受到污染， 单向效果不好，有部 超声清洗 分回流
入口单向阀失效，无 单向作用
清洗或更换
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进样的注意事项
样品处理：使用流动相溶解样品，保证样品的溶解度，减少 溶剂峰； 进样前使用0.45um 或更小的膜进行过滤。
原因 1、电源问题 2、保险丝被烧坏 3、柱塞杆折断 4、泵头内有空气 5、流动相不足
6、吸滤头堵 7、单向阀损坏 8、漏液
解决方法 1、接通电源，开机 2、更换保险丝 4、更换柱塞杆 5、启动泵抽出空气 5、补充流动相 6、更换或超声入口滤头 7、更换单向阀 8、拧紧或更换手紧接头
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使用钙柱注意的事项
5、通常推荐压力不超过2000psi，最大流速不超过 0.6ml/min(70℃)。 ⊙不要在流动相中使用氯化钙，硝酸钙以及其它强酸的钙 盐，这样会腐蚀柱子，破坏填料。
⊙柱子的温度不要超过95℃。通常高温会带来高的分辨率， 但在90~95℃之间几乎没有变化，70℃以下对许多糖的异 构体的分离不能提供足够的分离度，对于乙醇的定量，柱 温应在75℃
通过进标样建立一个校正曲线（一般是6针标样）。 校正曲线的横坐标是标样的浓度（含量），纵坐 标是峰面积；校正曲线就相当于：Y=aX+b的公式。 校正曲线建立好后样品的峰面积带入方程就可以 得到相应的浓度（含量）。
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第二部分HPLC的组成
输液系统 泵以及流 动相
进样系统 进样阀
3、流动相组成变化 3、溶剂瓶密封，现用现配
4、梯度洗脱
4、空白梯度充分平衡系统
5、色谱柱键合相流失 5、更换色谱柱
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B、基线噪声
“气泡，污染”
原因
解决方法
1、系统内存在气泡（流动 1、流动相脱气，冲洗系
相，检测器，管路，泵） 统
2、系统污染
2、逐一排查，冲洗系统
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KS-802钠型柱新色谱柱
“柱压，流速”
解决方法
1、室内恒温，或使用柱温箱 2、充分用流动相平衡 3、溶剂瓶密封，现用现配 4、强溶剂洗脱 5、更换色谱柱 6、排查引起流速改变的因素 7、排查引起柱压改变的因素
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如何判断入口单向阀是否正常的简易方法？
在泵运行过程中将溶剂吸滤头从流动相中拿出， 放进一小段气泡进入溶剂管路，进行观察。
解决方法
1、调整流速
2、系统漏液
2、确定漏液位置并维修
3、色谱柱选择不当
3、选择恰当的色谱柱
4、柱温过高
4、降低温度
5、压力传感器或工作站 5、更换压力传感器，重
失常
装工作站或系统。
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H、 压力波动
E、压力波动
原因
1、泵中有气体
2、单向阀损坏 3、泵密封损坏 4、系统漏液 5、使用梯度洗脱