嵌合体的制备

嵌合体的制备
嵌合体偶尔在妊娠期间可自然产生，但大部分是人工制作的。

目前，制作嵌合体的方法有两种，即聚合法（包括早期胚胎聚合法和卵裂球聚合法）和囊胚内细胞团（inner cell mass，ICM）注入法，可根据实验目的和实验条件进行选择。

（一）囊胚注入法
囊胚注入法指，当动物胚胎发育到囊胚，即分化为两种明显不同的组织：内细胞团和滋养层细胞时，将目的细胞或细胞团注入囊胚腔，使之与内细胞团结合并发育，最终得到嵌合体个体的方法。

注射的细胞可以是卵裂球、内细胞团细胞、EC细胞、ES细胞、EG细胞，甚至是已经分化了的细胞。

此外，也有人将某一囊胚的ICM完全用另一囊胚的ICM代替，这种方法称之为囊胚重组，曾被成功地用来进行种间怀孕，制备的嵌合体为胎儿的周围组织来自另外一种动物。

这种方法可广泛应用于研究基因型已知的ICM的发育能力和具有不同基因型
的滋养层细胞之间在个体发育中的相互关系。

此法最早由Gardner于1968年提出，经过多方改良，成功率较高，适用范围较广，可用于种内或种间嵌合，供体和受体的发育阶段可同步，也可以不同步，它还适用于不能去透明带的动物，如兔等。

该法是将几个ES细胞（一般5～15个）注入囊胚腔中。

但囊胚注射法需要购买昂贵的仪器（显微操作仪等），而且技术难度较大，需要一定的时间才能掌握，不利于一般的推广。

该方法适用于研究细胞的
发育潜能和胚胎的调整能力；注射细胞可获得较高的嵌合体效率，有可能对每个细胞的命运做较为详细的分析；适用于胚胎稀少的，经济价值高的动物嵌合体的制作；这种方法的突出作用是为应用ESC制作嵌合体奠定了基础。

（二）聚合法
1.聚合法的分类
用聚合法制作嵌合体，操作简便，不需要特殊的仪器设备，是一种常用的嵌合体制作方法，尤其是在没有试验条件利用囊胚注入法来制作嵌合胚和嵌合体动物的情况下，更是一种有效的方法，利于掌握和推广。

根据聚合对象的不同，可分为以下3种。

（1）胚胎聚合法：
该方法指的是将发育到一定时期（一般为8-细胞至桑椹胚）的胚胎去掉透明带后，将两个或两个以上的胚胎聚合，形成一个胚胎后体外培养至囊胚，再移植入受体动物体子宫内，最终获得嵌合体个体的方法。

（2）卵裂球聚合法：
卵裂球聚合法则需在去透明带后将胚胎打散，从双方胚胎卵裂球中各取出一部分细胞（至少2～4个细胞）进行聚合，培养后移植，直至获得嵌合个体。

（3）卵裂球或细胞与胚胎聚合法：
该方法是将一个胚胎的卵裂球解离后，或用其他游离的细胞与另一个或两个胚胎聚合。

当采用两个胚胎时，可用类似“三明治”方式，两个胚胎把细胞夹于中间进行聚合。

以ESCs与胚胎嵌合为例：首先将ESCs集落消化成单细胞悬液，0.2%～0.5%链霉蛋白酶或机械法去除胚胎的透明带，ESCs与去除透明带的胚胎共同培养。

将这种ESCs 与胚胎的聚合体在体外培养至囊胚期，转移至假孕动物的子宫内进一步发育。

2.聚合法的操作过程
（1）胚胎的获得：
在哺乳动物嵌合体的早期研究阶段，胚胎主要来源于动物体内的早期胚胎，现在，随着卵母细胞体外成熟技术和体外受精技术的发展，用于嵌合体研究的胚胎主要来源于体外受精胚和核移植胚胎。

（2）透明带的去除和卵裂球的获取：
透明带的去除和卵裂球的获取方法有机械分离法、酸化法、酶消化法等。

机械分离法目前主要是用显微操作仪通过显微操作剥离早期胚胎的透明带，分离卵裂球。

酶消化法是将胚胎置于含0.25%～0.5%链霉蛋白酶的无蛋白PBS中作用片刻，待透明带分为两层，且外层消失、内层透明带膨胀后，用内径略大于胚胎但小于透明带外径的吸管吹吸胚胎数次后，移入不含酶的胚胎培养液中洗涤干净。

（3）聚合
1）植物凝集素（PHA）聚合法：
Mintz最早将PHA用于胚胎聚合。

具体操作为：将含有0.05%～1%PHA的胚胎培养液在硅化的培养皿中做成30～50µl的聚合微滴，上面覆盖液体石蜡，把已去除透明带的待聚合胚胎移入微滴中，然后用细玻璃棒使两个胚胎紧密接触，进行聚合。

也可以选择血凝滴定板，将待聚合的胚胎放入含PHA培养液的滴定板的小孔中，用细玻璃棒使两个胚胎相互靠拢聚合。

将培养皿或血凝滴定板置于37℃培养箱中，培养10～30分钟后用新鲜培养液洗涤两次，再继续培养到囊胚，然后移植到受体进一步发育。

2）凹窝聚合法：
在培养皿底倒一层加温的1%琼脂溶液，待冷却后，在琼脂上用加热的铂金丝做成略大于两个胚胎的小凹陷，用培养液覆盖琼脂，胚胎放入小凹陷内彼此紧靠，达到聚合的目的。

此法最高可获得90%以上的聚合率。

在实际操作过程中，应先将琼脂配制成双倍浓度，高压蒸汽灭菌（121℃）后，降温至40℃，与预先配好的双倍浓度的培养液按1∶1比例混合，再倾倒入容器制作琼脂平板。

（4）聚合胚胎的培养和移植：
胚胎的培养目前有两种方法，体内培养和体外培养。

体内培养就是将聚合胚用琼脂包埋，然后移植到中间受体的输卵管内，发育到囊胚后再移植到该种动物的子宫内；体外培养是将洗涤后的聚合胚放入胚胎培养液或与颗粒细胞共培养，发育至囊胚后移植到受体体内。

由
于体内培养的成本较高，操作复杂，技术难度大，目前多采用体外培养。