临床化学检验中干扰物质的筛选

临床化学检验中干扰物质的筛选
1.常见干扰物质及其干扰机制
对临床化学检验有潜在干扰作用的物质主要有如下几种：①患者病理情况下的代谢产物，如多发性骨髓瘤患者体内的异常单克隆免疫球蛋白等。

②患者治疗过程中使用的药物，如非肠道维生素、血浆扩容剂、抗凝剂等。

③患者摄入的物质，如酒精、营养品、饮料等。

④样本在处理过程中的添加物，如抗凝剂、防腐剂、稳定剂等。

⑤样本在处理过程中由操作者引入的污染物，如护手霜、手套粉尘等。

⑥样本基质本身，如与理想新鲜血清不同的物理和化学特性等。

上述干扰物可以通过多种方式干扰分析过程：①物理作用：干扰物具有与分析物相似的物理特性，如颜色、光散射（光吸收）、电极响应、洗脱位等。

②化学作用：干扰物可以竞争试剂、抑制指示反应、改变分析物形态等。

③酶抑制作用：干扰物可以螯合酶活化所必须的金属离子、结合酶催化部位、氧化酶分子内所必须的巯基等。

④非特异性：干扰物能与分析物以相同的方式与试剂进行反应，在免疫化学方法中干扰物能和抗体发生交叉反应等。

⑤水的取代：样本中非水溶性物质（蛋白质、脂质）通过取代水溶性血浆体积从而影响分析物测定。

⑥基质效应：干扰物可以改变样本基质的物理特性，如粘性、表面张力、离子强度等。

2.干扰物质筛选实验
EP7-A文件阐述了两种基本方法评价检测系统或分析方法对干扰的敏感性，第一种方法是比较测试混合液和控制混合液之间是否存在偏差，称为配对差异实验；第二种方法是用高特异性对比方法作比较，评估被选择的患者样本的偏差，称为用患者样本评估干扰实验。

两种方法都有各自的优点，但也有其内在局限性，因此建议一起合并使用以相互补充。

3.配对差异实验
3.1选择合适的分析物浓度
实验过程中改变分析物的浓度，干扰物所产生的干扰作用可能会有差异，因此实验者应在分析物的两个医学决定水平处对干扰物的干扰作用进行评估，否则实验可能会得出错误的结论。

EP7-A文件的附录B给出了CLSI工作组推荐的分析物测试浓度，如选择白蛋白为分
析物时，上述两个医学决定水平分别为35g/L、50g/L，不同的分析物有不同的要求，实验者在实验时可以参考EP7-A文件。

3.2选择合适的干扰物浓度
在测定分析物过程中，不同浓度的干扰物所产生的干扰作用有一定的差异，因此在进行配对差异实验时有必要选择合适的干扰物浓度。

选择原则如下：①药物和代谢物：血清、血浆、全血等样品应选择该药物一个治疗剂量后急性峰浓度的3倍作为测试浓度，或选择已知的最高预期浓度。

如果预期的血药浓度未知，则可以假设药物均匀分布于5L溶剂中，选择该浓度的3倍作为测试浓度。

②内源性物质：应已知该物质在患者群体中的最高浓度，选择该浓度作为测试浓度。

③抗凝剂和防腐剂：血清、血浆、全血等样品应选择抗凝剂或防腐剂生产商推荐添加浓度的5倍作为测试浓度。

④饮食物质：血清、血浆、全血等样品应选择该饮食物质最大预期浓度的3倍作为测试浓度。

此外，由于不同的机制，干扰物对分析物产生负效应的同时也有可能产生正效应，如血红蛋白既具过氧化氢酶活性，又在可见光范围内强烈的光吸收，为避免在实验过程中这种正负效应相互抵消的可能性，实验者最好在干扰物的两个不同浓度水平处进行测试。

3.3确定临床可允许的最大干扰范围
临床可允许的最大干扰范围可根据该分析物测定时的总允许误差（可参考美国临床实验室修正法规即CLIA’88）确定，但是有些分析物的总允许误差还尚未公布则可用下述方法确定：①根据分析物的生理变异确定：使用该方法时总允许误差的设置应使分析物的分析差异相对于该分析物在个体或群体中的固有差异缩减到最小，具体计算步骤、公式可以参考第3版《全国临床检验操作规程》。

②根据临床经验确定：分析物的总允许误差不应影响临床医生对疾病的诊断和治疗，因此可以收集临床医生对分析物的意见确定合理的准确度和总允许误差。

③根据分析方法的不精密度确定：分析方法的不精密度与分析物的总允许误差密切相关，故可根据分析方法的总的长期不精密度确定分析物的总允许误差。

3.4计算实验需要重复测定的次数
如果备择假设没有说明干扰的方向，如肌酐浓度为1.0mg/dL时的偏差为±0.2mg/dL，此
时应选用双侧检验，实验需要的重复次数可用如下公式计算：()2
1/21max 2z z s n d β--⎡⎤+=⎢⎥⎢⎥⎣⎦
α。

如果备择假设说明了干扰的方向，如α-酮基丁酸在肌酐浓度为1.0mg/dL 时引起+0.2mg/dL 的偏差，此时应选用单侧检验，实验需要的重复次数可用如下公式计算：()2
11max 2z z s n d αβ--⎡⎤+=⎢⎥⎢⎥⎣⎦。

式中：2/1α-z 为标准正态分布资料双侧检验可信水平为100(1-α)％时对应的百分位数；1z α-为标准正态分布资料单侧检测可信水平为100(1-α)％时相对应的
百分位数；β-1z 为标准正态分布资料功效为100（1-β）%时相对应的百分位数，2/1α-z 、1z α-、β-1z 均可通过查EP7-A 文件表1获知；s 为批内重复测定结果之间的标准差；d max 为临床可允许的最大干扰范围。

由于重复次数必须为整数，所以单侧检验、双侧检验计算的结果均应四舍五入。

3.5实验样本的准备
3.5.1 基础混合液
首先应准备基础混合液，具体步骤及注意事项如下：①从近期未用药的健康个体获取合适类型的新鲜样本。

含有防腐剂、稳定剂的控制液具有与人新鲜血清不同的干扰作用，故此类标本在本实验中是禁用的。

②考虑测试每个分析物需要的样本体积、分析物的数目、实验重复测试的次数等因素，收集足够量的混合液。

③确定基础混合液中分析物的浓度，并用合适的纯物质调整使其达到医学决定水平，但是在这过程中实验者应避免引入其他物质。

3.5.2干扰物原液
按如下操作准备干扰物原液：①获得一定纯度的干扰物或化学结构与干扰物在体内循环时最接近的物质。

如果是研究药物对生化检验的干扰，则必须注意到药物内可能含有赋形剂、防腐剂、杀菌剂、杀真菌剂、抗氧化剂、着色剂、调味品、金属氧化剂、填充物等，这些物质中的每一种都有可能对生化检验过程中产生干扰。

②选择一种能充分溶解干扰物的溶剂。

查阅化学物理手册或Merck 索引，了解干扰物在这些溶剂中的溶解度，并确认溶剂不会对评估的方法产生干扰。

③实验过程中应尽可能小地稀释样本，最好不超过5％，因此如果溶
解度允许，则应配制高浓度的干扰物原液，浓度应达到实验测试浓度的20倍。

④有机溶剂需要特别处理，挥发性溶剂必须采取保护措施，尽量减少其挥发。

值得注意的是很多有机溶剂在水中的溶解度较低或可以通过影响试剂、反应过程等而引入新的物质。

3.5.3测试混合液和控制混合液
吸取1/20体积的干扰物原液到容量瓶内，然后用基础混合液加至指定的体积，混匀即得到测试混合液，但是如果配制的干扰物原液无法达到实验测试浓度的20倍，此时应相应地改变容量瓶里加入的干扰物原液的体积，假如干扰物原液只能达到实验测试浓度的16倍，则吸取1/16体积的原液到容量瓶内再用基础混合液调制到指定体积。

制备控制混合液与测试混合液相似，只是制备控制混合液时是将干扰物原液以相同体积的溶剂代替。

3.6实验测试
在测试时，应将测试混合液和控制混合液n 等分，以交替的顺序分析测试混合液（T ）和控制混合液（C ），例如：C1T1C2T2C3T3…CnTn 。

值得注意的是，如果系统受携带影响，则可加入附加样本来保护控制样本受测试样本携带的影响，如：C1T1CxCx C2T2CxCxC3T3 ……CxCxCnTn ，这里附加控制样本（Cx ）结果丢弃。

3.7数据分析及结果解释
先计算测试混合液和控制混合液均值的差异（d obs ）：d obs ＝control test x x -，再用下面的公式计算取舍点值（cut-off value ，dc ）来确定接受哪种假设，双侧检验时：n sz d d null c 2
/1α-+=；单侧检验时：1null c d sz d n
α-+=，式中d null 是无效假设规定的值，通常＝0。

如果点评估值d obs 小于或等于取舍点的值d c ，则认为潜在干扰物引起的偏差小于d max ，该物质对此分析物不存在干扰作用，反之则认为该物质对分析物有干扰作用。

但是在解释干扰测试结果时，应考虑如下情况：①由于取样误差导致实际的干扰可能与观察到的点评估值不同。

②测试样本的性质不能反应实际干扰时的情况，实验添加物与临床标本中的干扰物可能不相同。

③实验样本基质可能并不代表典型的有问题的临床样品。

④实验过程中是否任意选择测试浓度，因为实验水平选择得太高或太低，实验结果可能不显示干扰效应。

4. 用患者样本评估干扰实验
4.1选择合适的对比方法
本实验过程中需要用一个对潜在干扰物具有低灵敏度、特性很好的方法来确定对比研究中的“真值”，因此参考方法是一个比较理想的对比方法。

如果该项目还没有建立参考方法，则可以选用精密度、特异性均良好，测试原理与评估方法不相同的方法作为对比方法。

4.2实验样本的准备
4.2.1 测试样本、控制样本的准备
测试样本应已知含有一种或多种潜在干扰物，并取自诊断为特定条件和（或）疾病的患者样本，选择原则如下：①疾病，如取自心、肝、肾失调的患者样本。

②药物，如取自已知服用某种药物的患者样本。

③尿毒症患者血液里可能含有高浓度的内源性代谢产物或药物。

④其他可确定因素，如样本中含有异常浓度的胆红素、血红蛋白、脂质等。

控制样本的分析物浓度范围必须与测试样本相近，选择原则如下：①具有相同或相似诊断的患者样本。

②已知未服用某药物的患者样本。

③干扰物浓度在正常参考范围内的患者样本。

在每批测试中均应含有控制样本。

4.2.2测试样本和控制样本的数量
测试样本和控制样本需要的数量由如下3个因素决定：①测试方法、对比方法的精密度；②干扰作用的大小；③需要的可信度。

如果干扰作用较大、两种方法具有良好的精密度，则每组10-20个样本即已足够；反之如果干扰作用太小以至于被不精密度所掩饰，则应参考最新版EP9文件-用患者样本进行方法对比实验及偏差评估和EP14文件-基质效应的评价来获得更多的确定样本数量的方法。

4.3实验测试
对比方法、测试方法应在尽可能短的时间内对每个样本进行双份测定，通常在2小时内必须完成。

在确定分析时间的时候须注意如下几点：①如果分析物、干扰物不稳定，或者测试时使用微量体积，分析速度就特别重要，应尽快完成测定。

②为减少日间精密度的影响，将这些样本分散在几天内完成。

每天应交替更换两批的顺序，在一批内交替（或随机）排列
控制样本和测试样本。

③如果方法受携带的影响，则应认真确定样本的分析顺序。

④在实验过程中注意任何可能导致错误干扰指示的系统差异。

4.4数据处理及结果分析
首先应绘制偏差图：①求出每个样本每种方法双份测定的均值。

②计算并记录每个样本的平均偏差，即测试方法结果均值减去对比方法结果均值。

③以平均偏差为纵轴，对比方法两次测定结果的均值为横轴，把每个点画到散点图上，并对测试样本和控制样本使用不同的标记。

④通过线性回归分析计算每组数据的标准误（S y● x），计算公式可以参考CLSI EP9-A2文件。

⑤标准误可以用来计算平均偏差的95%的可信区间，即95%的可信区间= 平均偏差±2S y● x。

一些典型的散点图如下：
：测试样本；：控制样本；：±2S y● x
在图A中，测试组数据显示出偏差，并且比控制组数据更变化不定；控制组数据排列较紧密，并且其相对于对比方法“真值”的偏差可以忽略不计。

这个结果说明了测试样本中某些因素存在干扰，但是由于两种方法平均偏差的可信区间相互交迭，因此这个结果也有可能是随机产生的，需通过进一步研究证实。

在图B中，两组数据都显示出正向偏差，两种方法的平均偏差成阶梯状排列，这个结果说明了测试样本和控制样本没有归因于干扰因素的差异。

在图C中，测试组数据显示出明显的负偏差，控制组数据显示出正偏差，两种方法的平均偏差相隔甚远。

此时应计算测试组数据偏差上限与控制组数据平均偏差之间的差异，并与干扰标准
进行对比，可以评估潜在干扰物是否存在临床明显干扰。

在图D中，测试组数据的平均偏差稍小于控制组，但是这种大小的干扰必须与控制组数据显示出的变异一起考虑，因此两组数据平均偏差的可信区间无统计学差异。

用患者样本进行干扰评估的局限性主要是对实验变异缺乏控制对照，因此在解释实验结果时应注意如下几点：①本方法不能确定原因与作用的关系，实际干扰物可能是与实验干扰物共同存在的某物质，例如某疾病过程中的代谢产物引起的干扰可能被错误归因于治疗这种疾病的药物；②样本中的某些不稳定组分可能会丢失；③住院患者通常使用了多种药物，并且内源性代谢物浓度可能升高，因此难于证实是何种药物或代谢产物引起的干扰作用；④对许多实验而言，按疾病和药物将病人分类是非常困难的；⑤干扰物质可能不存在于测试的患者样本中；⑥对比方法可能也同样受干扰物的干扰。

但是无论怎样，本方法能在一定程度上证实潜在干扰物是否存在干扰作用，并且也是目前惟一可检出药物代谢物干扰作用的方法。

参考文献
1.Interference Testing in Clinical Chemistry；Approved Guideline PA：Clinical and Laboratory Standards Institute.2002
2.冯仁丰主编．临床检验质量管理技术基础（第２版）．上海：上海科学技术文献出版社，2007．177-185。