浅谈HPLC在食品安全检测中的应用

浅谈HPLC在食品安全检测中的应用
摘要：高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，具有高效、高灵敏度、范围广、流动
相选择范围宽等优点，因此在生物化学、药物及食品卫生领域广泛应用，是现代分离测
定的重要手段。

文章针对液相色谱在食品检测中的应用进行了分析。

关键词：高效液相色谱；食品；卫生检测；应用
前言
民以食为天，食以安为先。

温饱问题得以解决、物质文明极大丰富的今天，食品质量安全问题已然成为全社会关注的热点。

据世界卫生组织（WHO）估计，全球每年发生食源性疾病约十亿人次，发达国家（包括美国）发生食源性疾病的概率也相当高，平均每年有1/3的人群感染食源性疾病，因此食品安全问题已成为人类面临的最大健康问题。

中国人口多，环境保护意识差，生存环境及质量不高；水源污染导致食源性疾患的发生；水质污染直接影响海产品的卫生质量；农畜业种植、养殖源头污染对食品安全的威胁越来越严重；农药、兽药滥用，造成食物中农兽药残留问题突出；食品中添加不符合食品卫生要求的物质而引起的食物中毒等事件屡有发生。

这就需要有一套完整的监测监督机制，建立快速调查食源性疾病和监测食品污染的措施和方法。

目前，高效液相色谱法（HPLC）作为化学分离分析的一种重要手段得到广泛应用。

本文就高效液相色谱（HPLC）技术在食品安全分析中的应用概况作一综述。

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography）是在经典液相色谱法的基础上，于20世纪60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的一种新型分离分析技术。

它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒直径小（5～10μm），均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需要高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography），又因为分离速度快又称为高速液相色谱法（High Speed Liquid Chromatography）、也称现代液相色谱。

高的分离效能源于色谱系统中流动相、固定相与组分间的协同作用[1]，采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度的检测器，因而具有高效性、高灵敏度、操作自动化等特点。

高效液相色谱仪主要部件及结构图如下：
1 液相色谱法在食品营养成分中的应用
高效液相色谱法应用于食品分析中自80年代就已经有过试验了，如国家标准《食品卫生检验方法理化部分》GB/T 5009－1996中就有关于HPLC法的相关说明。

1.1食品中碳水化合物的分析
食物中的碳水化合物是人体必需的营养素之一，是人体热能的主要来源。

化学法只能测总糖，气相色谱法虽可分别测定各种糖分，但样品需衍生化，操作麻烦。

而HPLC法操作简便，灵敏度高，可同时测定各种糖。

国际上已将HPLC法作为酒类糖份含量测定的仲裁法[2]。

许秀敏等用配有示差折光检测器的HP1100，以乙腈：水＝75：25为流动相；汤丽芬等用Waters NH2柱，以乙腈：水＝84：16为流动相，检测食品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖等都取得了很好的分析效果；郝岩平等[3]在流动相为乙晴: 水为7: 3、柱温40℃、流速为1ml/ min的条件下将大豆低聚糖成分与其他可溶性糖进行了有效的分离并缩短了保留时间。

傅博强[4]
等用HPLC法测定了食品中的低聚异麦芽糖，测得各种糖的出峰顺序为：五糖、四糖、三糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖。

李黎[5]等采用氨基色谱柱，乙腈：水（67:33）作为流动相、流速1.0ml/min、柱温75℃分离测定冲剂和干吃鲜奶片等食品中的低聚异麦芽糖，平均回收率为97.27%，样品测定值相对标准偏差为1.53%～7.89%（n=5）。

另外，采用高压排斥色谱法也能快速、简便、准确地分析出香菇中的多
糖成分。

1.2 食品中维生素的分析
维生素是人体内代谢过程中起重要作用的物质，人体所需维生素量很少，但却是构成生命活动不可缺少的营养物质。

维生素种类很多，在化学结构上并无共性，它们可分为胺类(VB1)，醛类(VB6)或醇类(V A)。

李克[6]等采用离子对反向高效液相色谱法同时测定了复合维生素片中烟酰胺、维生素B1、维生素B2、维生素B6等4种水溶性维生素的含量。

以Hypersil C18化学键合硅胶为固定相，紫外检测器于280nm波长下检测。

该方法已成功应用于复合维生素片中4种水溶性维生素的同时测定。

成志强[7]等建立了以0.05mol/L KH2PO4—甲醇为流动相的梯度洗脱反向高效液相色谱同时测定维生素C、B1、B2、B6、B12、烟酸、烟酰胺和叶酸的分析方法。

方法检出限为1.4~0.76ng，用该法测定了奶粉、玉米粉、饮料及复合维生素片中的水溶性维生素，相对标准偏差2.8~8.8%；加标回收率74.7~112.5%。

1.3 食品中氨基酸的分析
氨基酸是食品中主要的营养成分。

由几十到几千个氨基酸分子借助肽键和二硫键相互连接形成了蛋白质，测定食品中的氨基酸组成无论对营养成分的分析，还是开发新的食品资源都很有意义[8]。

1958年，Spackman等首先介绍了离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质水介生成的氨基酸，同时提出了构建氨基酸自动分析仪的细节，建立了传统氨基酸分析技术。

仲岳桐[9]等实验证明高效液相色谱法能够一次测定食品中的17种氨基酸，分析结果重复性好，灵敏度高，定性定量准确，近10年来，反相HPLC与各种柱前衍生相结合的氨基酸分析技术发展迅速，显示出各自特有的优越性，构成了具有广泛适用性的现代氨基酸分析技术。

不仅使氨基酸能在传统的荧光检测器上进行检测，也能在所有HPLC 仪都配备的紫外检测器上进行检测。

1.4 食品中脂肪酸的分析
脂肪酸和丙三醇结合成脂肪，通过测定食品中脂肪酸的含量，可为食品加工、贮存及合理配比等提供必要的数据。

段更利[10]等利用LC-6A高效液相色谱仪，配有化学发光检测器(不锈钢分析柱：150mm×4.6mm I.D；顶柱：30mm×4.6mm I.D；柱填料均为ODS-80TM5μm，日本岛津)，以适当的乙腈与水配比检测出脂肪酸
C16、C18、C20，且灵敏度极高，达到fmol级。

张萍[11]等以60% 0.2mol磷酸盐甲醇溶液为流动相，pH2.8的条件下，采用线性反相梯度洗脱，同时分离测定出甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸、丁酸、戊酸等7种短链脂肪酸。

2 HPLC在农兽药残留检测中的应用
随着农业的发展，农兽药的使用越来越普及，且品种繁多，每年都有许多新的产品投放市场，给分析工作者带来了许多新的研究课题。

Keen等人采用10%2,4—二甲基戊烷，硅烷化的硫藻土为固定相，采用60.1%水、38.8%乙醇、0.80%乙酸、0.21%氢氧化钠和0.09%氯化钾（w/w）的混合物为流动相，使用极谱检测器，对工业杀虫剂对硝基苯酚、甲基对硫磷、对硫磷的混合物进行分离分析。

Prlby采用硅胶柱、流动相采用梯度淋洗的方式，紫外检测器，波长为245nm，成功地分离了11种除莠剂。

杨蓉[12]等阐述了应用高效液相色谱对食物及生物样品中呋喃丹、氯菊酯、溴氰菊酯、抗蚜威及双甲脒五种农药残留进行分离测定的研究。

吴平谷[13]等建立了鸡肉中十种磺胺类药物残留的高效液相色谱紫外检测（HPLC-UV）分析方法。

采用C18柱，甲醇—水/甲醇—甲酸为流动相梯度洗脱，鸡肉样品经过甲醇提取，正己烷脱脂，SLW固相萃取柱净化，用HPLC法测定鸡肉中十种磺胺类药物的含量。

结果表明，当鸡肉样品添加十种磺胺类药物为
0.05～0.2 mg/kg时，方法回收率为67.4%～95.6%，变异系数为4.8%～11.5%，十种磺胺类药物最低检出浓度为0.01 mg/g。

柳菡[14]等建立了以反相高效液相色谱—电喷雾串联质谱（LC-ESIMS/MS）同时测定蔬菜中26种农药残留量的检测方法。

蔬菜样品经含0.1%醋酸的乙腈提取、浓缩、分散型固相萃取净化后采用C18柱分离，以0.2mmol/L醋酸铵水溶液—甲醇为流动相，梯度洗脱。

结果表明，二十六种农药在5.0～200μg/L范围内线性关系良好（r2>0.997）。

在豌豆、菠菜、脱水葱三种基质中的检出限和定量下限均为2.0μg/kg和5.0μg/kg。

在5.0、10.0、40.0μg/kg三个添加水平下，二十六种农药的回收率为70%～110%，精密度（RSD）小于15%。

3 HPLC在食品添加剂检测中的应用
食品添加剂是在食品生产加工过程中，为改善食品色、香、味等品质，以及为防腐和加工工艺的需要，而加入食品中的少量的化学合成或者天然物质。

主要分为乳化剂、防腐剂、甜味剂、消泡剂、增味剂、发色剂、抗氧化剂、天然或人
工合成色素、漂白剂、增稠剂、香精香料等。

食品添加剂的安全使用是非常重要的。

理想的食品添加剂最好是有益无害的物质。

食品添加剂，特别是化学合成的食品添加剂大都有一定的毒性，因此，测定食品中各种添加剂的含量以控制其使用量，对保证食品安全质量，保障人民健康具有十分重要的意义。

李敬慈、丁天惠[15]采用乙二胺作为硅胶柱改善剂的高效液相色谱法测定了奶制品和淀粉水解液中糖的含量。

对样品处理方法及色谱条件作了探讨，采用Pb（Ac）
2-Na2C2O4-K2HPO4处理样品，含0.01%乙二胺的乙腈—水（65:35，V/V）作流动相，示差折光检测器检测。

本方法操作简单、价廉、准确。

HPLC用于糖的定性和定量分析具有快速、灵敏、样品处理简单等优点[16]。

余涛[17]等采用ODSC18柱，甲醇—乙酸铵作为流动相，针对不同类型样品，采用不同前处理方法，样品处理液最后于液相色谱仪进行分析定量。

结果:乙酰磺胺酸钾、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸、阿斯巴甜在0～0.32 mg/ml浓度范围内，标准曲线线性关系良好，RSD为0.67%～6.8%；乙酰磺胺酸钾加标回收率为93.1%～99.6%、苯甲酸为90.5%～98.7%、山梨酸为91.5%～102.5%、糖精钠为91.8%～100.9%、脱氢乙酸为92.3%～99.8%、阿斯巴甜为90.3%～103.5%。

周毅刚[18]等用乙醚—石油醚从样品中提取苯甲酸和山梨酸，使之与大量胶质、色素和糖分离后，蒸馏除乙醚石—油醚，再在酸性条件下，与乙醇酯化生成苯甲酸乙酯和山梨酸乙酯，使之极性减弱，再用高效液相色谱法进行分离测定，从而计算出苯甲酸、山梨酸的含量。

与其它报道的方法相比，所拟方法线性关系与回收率良好，色谱峰形稳定，无拖尾现象，精密度及准确度较高，操作简便、快速。

用高效液相色谱法分析食品中的色素的案例也非常多，人们对食品中的苏丹红、碱性橙、姜黄素、番茄红素等都进行了测定及对分析方法的探究[19-31]。

4 HPLC在霉菌毒素检测中的应用
食品中存在多种霉菌毒素，其中黄曲毒素是生活中最为常见的一种毒素，它是食品贮存时由真菌产生的毒素，有强烈的致癌作用。

赵宁[32]等采用高效液相色谱法，使用Agilent1100色谱柱；在柱温30℃；乙腈—甲醇—水（1∶1∶2）为流动相；流速为1.0ml/min；荧光检测器；测出黄曲霉素在花生中的含量，方法重复性的RSD为0.38%，平均回收率为78.4%。

王峰莹[33]采用甲醇水溶液提取粮食中的黄曲霉毒素，提取液经过过滤、稀释后，
用免疫亲和柱净化，以甲醇为流动相洗脱，用高效液相色谱法直接测定。

方法重复性的RSD为1.5%，平均回收率为90%～105%。

郑铁松[34]等从玉米中分离伏马菌素，邱宏[35]等选用C18分离柱，用乙腈—水(23+ 77)作流动相，于20℃下等度洗脱，同时测定了食品中的黄曲霉毒素(AFT) B1、B2、G1和G2，检出限分别是：B1为0.042 ng，B2、G1和G2为0.08 ng，回收率为83.4%~ 103.1%，r> 0.9 995。

5 HPLC在其他食品检测中的应用
HPLC不仅用于上述农药残留、霉菌毒素、食品添加剂等的检测，用于食品中营养成分的分析，还可用于食用药材指纹图谱的检测。

阎正等建立了丹参药材[36]、鹿茸[37]、人参[38]等高效液相指纹图谱，研究了不同的预处理方法、流动相组成、最佳检测波长等操作因素对指纹图谱的影响。

冯丽娟[39]等建立了食品中可能出现的罂粟壳生物碱成分—吗啡、可待因、罂粟碱的提取和测定方法，用超声—微波协同萃取的方法提取罂粟壳中的生物碱，高效液相色谱法（HPLC）进行含量分析.其平均回收率分别为97.87%、96.80%、94.47%；精密度相对标准偏差（RSD）分别为0.070%、0.037%、0.029%；重现性相对标准偏差（RSD）分别为0.040%、0.209%、0.665%。

彭锦峰[40]建立了用高效液相色谱测定食用香菇中甲醛的方法。

刘云惠[41]等建立了高效液相色谱对玉米大斑病菌毒素的分离方法。

6 小结
HPLC作为一种十分有效的分析分离手段，已经越来越广泛地应用到食品检测与安全性分析中，近年又与其他的色谱、质谱、光谱、核磁等相互结合，扩大了检测范围，提高了分析水平，尤其对食品中残留的微量、痕量有毒有害物质能快速准确地分析出来，进一步提高了食品卫生质量，保障了食品安全和人民身体健康，促进了食品出口。

随着高效液相色谱分析技术的不断完善和发展，HPLC 必将在食品检测与分析领域有更广阔的发展。

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