菌丝霉素抗菌肽高密度发酵生产及其特性研究

菌丝霉素抗菌肽高密度发酵生产及其特性研究
作者：宋士良陆克文
来源：《安徽农业科学》2022年第07期
摘要 [目的]开发菌丝霉素抗菌肽，以替代抗生素在饲料生产中添加使用。

[方法]以高产菌丝霉素毕赤酵母基因工程菌PPle-BC01为供试菌株，在15 L实验室发酵罐优化发酵工艺的基础上，通过50 L、5 t、60 t发酵罐高密度发酵工艺进一步优化放大试验，实现了60 t罐规模的稳定生产。

经层析柱分离、纯化，得到相对纯度≥90%的纯品。

纯品水解后的游离氨基酸样品，经PITC衍生化处理后，再经过HPLC检测及氨基酸组成摩尔百分比计算与氨基酸混合标准品比对，分析其氨基酸组成。

纯品经多肽蛋白质相对分子质量分析测试，测得plectasin单同位素相对分子量。

纯品经蛋白浓度、抗菌效价测定、比活计算以及产品抗菌效价测定，获得产品中plectasin含量，同时测试了解其产品特性。

[结果]60 t发酵罐稳定3批次试生产发酵液菌体湿重峰值分别为43.34%、43.78%和43.78%，抗菌效价峰值分别为10 566.99、10 986.45和10 788.56 U/mL;喷雾干燥产品收率分别为12.19%、12.30%和12.50%，抗菌效价分别为100 672.10、103 561.20和99 765.50 U/g。

3批次试生产产品中plectasin含量分别为2.26%、2.32%和2.24%。

纯品经检测符合plectasin由40个氨基酸组成的多肽的理论氨基酸残基个数值，分子量为4.440 7 kD。

产品在95 ℃温度以下具有良好的热稳定性;pH 3.0～9.0具有良好的酸碱稳定性;在0.03%～0.30%猪胆盐浓度具有较好的胆盐耐受性;对胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K
均具有良好的抗降解性。

[结论]发酵终产品收率达10%，产品抗菌效价达8万U/g以上，产品中plectasin含量达2%以上，实现了60 t罐规模的产业化稳定生产。

关键词菌丝霉素抗菌肽;高密度发酵工艺;菌丝霉素含量检测;产品特性
中图分类号 Q939.92 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2022）07-0078-10
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.019
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on High-density Fermentation Production and Characteristics of Plectasin Antimicrobial Peptide
SONG Shi-liang，LU Ke-wen
（Shanghai Bornsun Bioengineering Co.，Ltd.， Shanghai 201506）
Abstract [Objective]To develop plectasin antimicrobial peplide to replace antibiotics in feed production.[Method]In this study， a high-yield plectasin-producing Pichia pastoris strain PPle-BC01 was used as the experimental strain，the steady production of 60-ton fermenters were realized by the scale-up experiments of high-density fermentation process in 50 L ，5 t and 60 t fermentor that based on the optimization of fermentation process in 15-liter fermentor.The purified sample of plectasin with relative purity above 90% was obtained by chromatographic column separation and purification.The amino acid composition of the purified sample were analyzed by HPLC determination，calculation of molar percentage of amino acid composition and comparison with reference standards for amino acid
mixtures after it’s hydrolyzed free amino acid sample and reference standards for amino acid mixtures were derivatized by PITC.The single-isotope relative molecular weight of plectasin was measured by the relative molecular mass analysis of polypeptide proteins.The content of plectasin in spray-dried products were obtained by determining the concentration， antibacterial titer of pure protein and the antibacterial titer of spray-dried products.The characteristics of spray-dried products were known through the property test.[Result]Peak values of wet weight and antibacterial titer of fermentation broths were 4334%，43.78%，4378% and 10 566.99，10 986.45，10 788.56 U/mL，the yield and antibacterial titer of spray-dried products were 1219%，1230%，12.50% and 100 672.10，103 561.20，99 765.50 U/g ，the content of plectasin in spray-dried products were 2.26%，232% and 224%， respectively in stable three batchs trial production of 60-ton fermentors.The purified sample was determined to be composed of 40 amino acids and the molecular weight was 4.440 7 kD.The spray-dried product had good thermal stability under 95 ℃， had good acid-base stability in the pH 3.0-9.0 range，had good tolerance at the salt concentration of 0.03%-0.30% in pig bile，had good anti-degradability to pepsin， trypsin and proteinase K.[Conclusion]The yield of the final spray-dried products reached 10%，the antibacterial titer was over 80 000 U/g，the content of plectasin in spray-dried products was more than 2%.The industrial and stable production of 60-ton fermenters was realized.
Abstract Plectasin antimicrobial peptide;High-density fermentation process;Determination of plectasin content;Product characteristics
2019年7月10日，《農业农村部公告第194号》指出，2020年7月1日起，除中草药外，饲粮中禁用其他促生长类药物饲料添加剂。

因此，开发替代抗生素的绿色、生态、安全、高效的新型饲料添加剂是我国畜禽养殖业的热点及重点。

益生菌、中草药、多糖、抗菌肽等无抗药性、无残留、毒副作用小，具有良好的市场开发及应用前景，是高效、绿色环保型饲料添加剂[1]。

抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）是由12～50个氨基酸组成的小生物分子肽，是先天免疫系统的重要组成部分，具有分子量小、易溶于水、耐热性、抗菌谱广和不易产生耐药性等特点[2];还具有一定的免疫学活力[3]。

因此，开发利用抗菌肽取代传统抗生素，对提高畜产品品质、推动绿色畜牧业的发展、保障食品安全具有重要意义。

目前获得抗菌肽的方式主要有从生物体内直接分离提纯有生物活性的抗菌肽，再对其结构和功能进行研究。

这种方法比较烦琐，且得到的抗菌肽含量普遍很低，不适合规模化生产。

人工合成抗菌肽。

根据已知的抗菌肽基因序列，用化学方法合成抗菌肽。

这种方法成本高，不适于普及应用。

酶解法。

主要是通过将有抗菌活性的蛋白用特定的蛋白酶切割下其有抗菌活性的部分进行纯化，继而得到抗菌肽。

这种方法得到的抗菌肽活性较高，但产量低，成本高。

利用基因工程菌生产抗菌肽，可以在一定程度上解决这些困难，通过这种方法得到的抗菌肽目的性强，技术上有提高产量的空间，成本低，应用广，是生产抗菌肽的一条理想途径[4]。

目前用于基因工程的异源表达系统
在生产不同大小、折叠和复杂性的异源抗菌肽方面取得了很大的进步，抗菌肽生产的主要表达系统是细菌和酵母表达系统。

毕赤酵母是酵母表达系统中应用最广泛的表达系统[4]。

乔莹等[5]通过Eco31 I限制性内切酶定向连接方法合成大黄鱼与美国红鱼抗菌肽Piscidin串联基因，以
毕赤酵母的穿梭表达载体pPICZαA构建重组表达质粒pPICZαA-PSP，转化入毕赤酵母
SMD1168菌株中，实现了PSP重组串联肽的诱导表达和纯化，初步鉴定Piscidin抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和爱德华氏菌等均有抑制生长的活性。

邓赣奇等[6]将优化的目的蛋白碱基序列与标签MBP基因序列融合，通过双酶切将重组基因序列插入到毕赤酵母pGAPZaA 表达载体上并进行连接反应，成功获得一种能分泌菌丝霉素的毕赤酵母，对其分泌蛋白进行Western blot检测、纯化、活性分析和质谱鉴定，得到的重组蛋白为55 ku左右，浓度为700 mg/L，纯度达80%以上，质谱鉴定结果表明，蛋白序列的覆盖率达98%，纯化后的蛋白对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。

到该研究实施前为止，重组菌丝霉素抗菌肽尚处于研发阶段，国内尚未见产业化报道。

通过毕赤酵母表达系统生产抗菌肽是一种有效的生产方法，相对于细菌表达系统生产抗菌肽，表现出更多的优势。

因此，开展重组菌丝霉素基因工程抗菌肽产业化研发具有现实意义。

该研究通过高产菌丝霉素毕赤酵母基因工程菌高密度发酵工艺优化及其特性研究，完成菌丝霉素抗菌肽工艺放大试生产、产品试制、试运行，成果转化达到产业化目标。

如何提高基因工程菌丝霉素抗菌肽菌株发酵生物表达量，提高生产效率、降低成本，实现廉价、规模化生产，已成为目前抗菌肽研究开发产业化过程中，亟待需要解决的关键问题。

笔者通过补料高密度发酵工艺优化试验，并完成菌丝霉素结构、分子量及产品中菌丝霉素成分含量检测，实现在实验室15 L发酵罐基础上发酵菌体鲜生物量提高到400 g/L、抗菌效价表达量提高到8 000 U/mL以上，使发酵终产品收率达10%、产品抗菌效价达8万U/g、产品中菌丝霉素含量达2%以上，实现60 t罐规模的产业化稳定生产的要求。

该产业化成果，经上海科学技术情报研究所科技查新，国内外未见有同类研究。

1 材料与方法
1.1 试验地点
试验于2017年1月—2018年12月在上海邦成生物工程有限公司微生物及发酵研究所发酵实验室及发酵中试、生产车间进行。

1.2 主要仪器
超低温冷冻柜（DW-86L338J，青岛海尔特种电器有限公司）;生物显微镜（XSP-BM-
2CA，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司）;超净工作台（YJ-1340，苏州苏信环境科技有限公司）;隔水式恒温培养箱（GHF-9270，上海一恒科学仪器有限公司）;立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-50SⅡ，上海博迅实业有限公司）;冷冻干燥机（TF-FD-1，上海田枫实业有限公司）;分析天平（Sartorius SQP，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）;pH计（PHS-3C，上海雷磁仪器有限公司）;电导率仪（DDS-307，上海雷磁仪器有限公司）;恒温摇床（TS-211C，常州冠军仪器制造有限公司）;紫外分光光度计（752N，上海仪电分析仪器有限公司）;实验室喷雾干燥机（WPG-1500，常州市永昌制粒干燥设备有限公司）;水分测定仪（SYF-6D，深圳冠亚水分仪科技有限公司）;低速台式离心机（TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂）;高速台式离心机（TCL-18G-C，上海安亭科学仪器厂）;核酸蛋白检测仪（HD-21-88，上海琪特分析仪器有限公司）;酶标仪（Multiskan MK3，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司）;电热恒温水浴锅
（HWS28，上海一恒科学仪器有限公司）;高效液相色谱仪（LC-20AT，日本岛津公司）;质谱仪（AB Sciex 5800 MALDI-TOF/TOF，美国爱博才思公司）;实验室发酵罐（15 L、50 L，上海洋格生物工程设备有限公司）;中试、试生产发酵罐（50 L、100 L、0.5 t、1 t、5 t、10 t、60 t，镇江东方生物工程设备技术有限责任公司）;压力喷雾干燥设备（水分蒸发量1 000 kg/h，无锡市现代喷雾干燥设备有限公司）。

Abstract Plectasin antimicrobial peptide;High-density fermentation process;Determination of plectasin content;Product characteristics
2019年7月10日，《农业农村部公告第194号》指出，2020年7月1日起，除中草药外，饲粮中禁用其他促生长类药物饲料添加剂。

因此，开发替代抗生素的绿色、生态、安全、高效的新型饲料添加剂是我国畜禽养殖业的热点及重点。

益生菌、中草药、多糖、抗菌肽等无抗药性、无残留、毒副作用小，具有良好的市场开发及应用前景，是高效、绿色环保型饲料添加剂[1]。

抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）是由12～50个氨基酸组成的小生物分子肽，是先天免疫系统的重要组成部分，具有分子量小、易溶于水、耐热性、抗菌谱广和不易产生耐药性等特点[2];还具有一定的免疫学活力[3]。

因此，开发利用抗菌肽取代传统抗生素，对提高畜产品品质、推动绿色畜牧业的发展、保障食品安全具有重要意义。

目前获得抗菌肽的方式主要有从生物体内直接分离提纯有生物活性的抗菌肽，再对其结构和功能进行研究。

这种方法比较烦琐，且得到的抗菌肽含量普遍很低，不适合规模化生产。

人工合成抗菌肽。

根据已知的抗菌肽基因序列，用化学方法合成抗菌肽。

这种方法成本高，不适于普及应用。

酶解法。

主要是通过将有抗菌活性的蛋白用特定的蛋白酶切割下其有抗菌活性的部分进行纯化，继而得到抗菌肽。

这种方法得到的抗菌肽活性较高，但产量低，成本高。

利用基因工程菌生产抗菌肽，可以在一定程度上解决这些困难，通过这种方法得到的抗菌肽目的性强，技术上有提高产量的空间，成本低，应用广，是生产抗菌肽的一条理想途径[4]。

目前用于基因工程的异源表达系统
在生产不同大小、折叠和复杂性的异源抗菌肽方面取得了很大的进步，抗菌肽生产的主要表达系统是细菌和酵母表达系统。

毕赤酵母是酵母表达系统中应用最广泛的表达系统[4]。

乔莹等[5]通过Eco31 I限制性内切酶定向连接方法合成大黄鱼与美国红鱼抗菌肽Piscidin串联基因，以
毕赤酵母的穿梭表达载体pPICZαA构建重组表达质粒pPICZαA-PSP，转化入毕赤酵母
SMD1168菌株中，实现了PSP重组串联肽的诱导表达和纯化，初步鉴定Piscidin抗菌肽对大
肠杆菌、金黄色葡萄球菌和爱德华氏菌等均有抑制生长的活性。

邓赣奇等[6]将优化的目的蛋
白碱基序列与标签MBP基因序列融合，通过双酶切将重组基因序列插入到毕赤酵母pGAPZaA 表达载体上并进行连接反应，成功获得一种能分泌菌丝霉素的毕赤酵母，对其分泌蛋白进行Western blot检测、纯化、活性分析和质谱鉴定，得到的重组蛋白为55 ku左右，浓度为700 mg/L，纯度达80%以上，质谱鉴定结果表明，蛋白序列的覆盖率达98%，纯化后的蛋白对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。

到该研究实施前为止，重组菌丝霉素抗菌肽尚处于研发阶段，国内尚未见产业化报道。

通过毕赤酵母表达系统生产抗菌肽是一种有效的生产方法，相对于细菌表达系统生产抗菌肽，表现出更多的优势。

因此，开展重组菌丝霉素基因工程抗菌肽产业化研发具有现实意义。

该研究通过高产菌丝霉素毕赤酵母基因工程菌高密度发酵工艺优化及其特性
研究，完成菌丝霉素抗菌肽工艺放大试生产、产品试制、试运行，成果转化达到产业化目标。

如何提高基因工程菌丝霉素抗菌肽菌株发酵生物表达量，提高生产效率、降低成本，实现廉价、规模化生产，已成为目前抗菌肽研究开发产业化过程中，亟待需要解决的关键问题。

笔者通过补料高密度发酵工艺优化试验，并完成菌丝霉素结构、分子量及产品中菌丝霉素成分含量检测，实现在实验室15 L发酵罐基础上发酵菌体鲜生物量提高到400 g/L、抗菌效价表达量提高到8 000 U/mL以上，使发酵终产品收率达10%、产品抗菌效价达8万U/g、产品中菌丝霉素含量达2%以上，实现60 t罐规模的产业化稳定生产的要求。

该产业化成果，经上海科学技术情报研究所科技查新，国内外未见有同类研究。

1 材料與方法
1.1 试验地点
试验于2017年1月—2018年12月在上海邦成生物工程有限公司微生物及发酵研究所发酵实验室及发酵中试、生产车间进行。

1.2 主要仪器
超低温冷冻柜（DW-86L338J，青岛海尔特种电器有限公司）;生物显微镜（XSP-BM-
2CA，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司）;超净工作台（YJ-1340，苏州苏信环境科技有限公司）;隔水式恒温培养箱（GHF-9270，上海一恒科学仪器有限公司）;立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-50SⅡ，上海博迅实业有限公司）;冷冻干燥机（TF-FD-1，上海田枫实业有限公司）;分析天平（Sartorius SQP，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）;pH计（PHS-3C，上海雷磁仪器有限公司）;电导率仪（DDS-307，上海雷磁仪器有限公司）;恒温摇床（TS-211C，常州冠军仪器制造有限公司）;紫外分光光度计（752N，上海仪电分析仪器有限公司）;实验室喷雾干燥机（WPG-1500，常州市永昌制粒干燥设备有限公司）;水分测定仪（SYF-6D，深圳冠亚水分仪科技有限公司）;低速台式离心机（TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂）;高速台式离心机（TCL-18G-C，上海安亭科学仪器厂）;核酸蛋白检测仪（HD-21-88，上海琪特分析仪器有限公司）;酶标仪（Multiskan MK3，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（HWS28，上海一恒科学仪器有限公司）;高效液相色谱仪（LC-20AT，日本岛津公司）;质谱仪（AB Sciex 5800 MALDI-TOF/TOF，美国爱博才思公司）;实验室发酵罐（15 L、50 L，上海洋格生物工程设备有限公司）;中试、试生产发酵罐（50 L、100 L、0.5 t、1 t、5 t、10 t、60 t，镇江东方生物工程设备技术有限责任公司）;压力喷雾干燥设备（水分蒸发量1 000 kg/h，无锡市现代喷雾干燥设备有限公司）。

Abstract Plectasin antimicrobial peptide;High-density fermentation process;Determination of plectasin content;Product characteristics
2019年7月10日，《农业农村部公告第194号》指出，2020年7月1日起，除中草药外，饲粮中禁用其他促生长类药物饲料添加剂。

因此，开发替代抗生素的绿色、生态、安全、高效的新型饲料添加剂是我国畜禽养殖业的热点及重点。

益生菌、中草药、多糖、抗菌肽等无抗药性、无残留、毒副作用小，具有良好的市场开发及应用前景，是高效、绿色环保型饲料添加剂[1]。

抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）是由12～50个氨基酸组成的小生物分子肽，是先天免疫系统的重要组成部分，具有分子量小、易溶于水、耐热性、抗菌谱广和不易产生耐药性等特点[2];还具有一定的免疫学活力[3]。

因此，开发利用抗菌肽取代传统抗生素，对提高畜产品品质、推动绿色畜牧业的发展、保障食品安全具有重要意义。

目前获得抗菌肽的方式主要有从生物体内直接分离提纯有生物活性的抗菌肽，再对其结构和功能进行研究。

这种方法比较烦琐，且得到的抗菌肽含量普遍很低，不适合规模化生产。

人工合成抗菌肽。

根据已知的抗菌肽基因序列，用化学方法合成抗菌肽。

这种方法成本高，不适于普及应用。

酶解法。

主要是通过将有抗菌活性的蛋白用特定的蛋白酶切割下其有抗菌活性的部分进行纯化，继而得到抗菌肽。

这种方法得到的抗菌肽活性较高，但产量低，成本高。

利用基因工程菌生产抗菌肽，可以在一定程度上解决这些困难，通过这种方法得到的抗菌肽目的性强，技术上有提高产量的空间，成本低，应用广，是生产抗菌肽的一条理想途径[4]。

目前用于基因工程的异源表达系统
在生产不同大小、折叠和复杂性的异源抗菌肽方面取得了很大的进步，抗菌肽生产的主要表达系统是细菌和酵母表达系统。

毕赤酵母是酵母表达系统中应用最广泛的表达系统[4]。

乔莹等[5]通过Eco31 I限制性内切酶定向连接方法合成大黄鱼与美国红鱼抗菌肽Piscidin串联基因，以
毕赤酵母的穿梭表达载体pPICZαA构建重组表达质粒pPICZαA-PSP，转化入毕赤酵母
SMD1168菌株中，实现了PSP重组串联肽的诱导表达和纯化，初步鉴定Piscidin抗菌肽对大
肠杆菌、金黄色葡萄球菌和爱德华氏菌等均有抑制生长的活性。

邓赣奇等[6]将优化的目的蛋
白碱基序列与标签MBP基因序列融合，通过双酶切将重组基因序列插入到毕赤酵母pGAPZaA 表达载体上并进行连接反应，成功获得一种能分泌菌丝霉素的毕赤酵母，对其分泌蛋白进行Western blot检测、纯化、活性分析和质谱鉴定，得到的重组蛋白为55 ku左右，浓度为700 mg/L，纯度达80%以上，质谱鉴定结果表明，蛋白序列的覆盖率达98%，纯化后的蛋白对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。

到该研究实施前为止，重组菌丝霉素抗菌肽尚处于研发阶段，国内尚未见产业化报道。

通过毕赤酵母表达系统生产抗菌肽是一种有效的生产方法，相对于细菌表达系统生产抗菌肽，表现出更多的优势。

因此，开展重组菌丝霉素基因工程抗菌肽产业化研发具有现实意义。

该研究通过高产菌丝霉素毕赤酵母基因工程菌高密度发酵工艺优化及其特性研究，完成菌丝霉素抗菌肽工艺放大试生产、产品试制、试运行，成果转化達到产业化目标。

如何提高基因工程菌丝霉素抗菌肽菌株发酵生物表达量，提高生产效率、降低成本，实现廉价、规模化生产，已成为目前抗菌肽研究开发产业化过程中，亟待需要解决的关键问题。

笔者通过补料高密度发酵工艺优化试验，并完成菌丝霉素结构、分子量及产品中菌丝霉素成分含量检测，实现在实验室15 L发酵罐基础上发酵菌体鲜生物量提高到400 g/L、抗菌效价表达量提高到8 000 U/mL以上，使发酵终产品收率达10%、产品抗菌效价达8万U/g、产品中菌丝霉素含量达2%以上，实现60 t罐规模的产业化稳定生产的要求。

该产业化成果，经上海科学技术情报研究所科技查新，国内外未见有同类研究。

1 材料与方法
1.1 试验地点
试验于2017年1月—2018年12月在上海邦成生物工程有限公司微生物及发酵研究所发酵实验室及发酵中试、生产车间进行。

1.2 主要仪器
超低温冷冻柜（DW-86L338J，青岛海尔特种电器有限公司）;生物显微镜（XSP-BM-
2CA，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司）;超净工作台（YJ-1340，苏州苏信环境科技有限公司）;隔水式恒温培养箱（GHF-9270，上海一恒科学仪器有限公司）;立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-50SⅡ，上海博迅实业有限公司）;冷冻干燥机（TF-FD-1，上海田枫实业有限公司）;分析天平（Sartorius SQP，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）;pH计（PHS-3C，上海雷磁仪器有限公司）;电导率仪（DDS-307，上海雷磁仪器有限公司）;恒温摇床（TS-211C，常州冠军仪器制造有限公司）;紫外分光光度计（752N，上海仪电分析仪器有限公司）;实验室喷雾干燥机（WPG-1500，常州市永昌制粒干燥设备有限公司）;水分测定仪（SYF-6D，深圳冠亚水分仪科技有限公司）;低速台式离心机（TDL-5-A，上海安亭科学仪器厂）;高速台式离心机（TCL-18G-C，上海安亭科学仪器厂）;核酸蛋白检测仪（HD-21-88，上海琪特分析仪器有限公司）;酶标仪（Multiskan MK3，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（HWS28，上海一恒科学仪器有限公司）;高效液相色谱仪（LC-20AT，日本岛津公司）;质谱仪（AB Sciex 5800 MALDI-TOF/TOF，美国爱博才思公司）;实验室发酵罐（15 L、50 L，上海洋格生物工程设备有限公司）;中试、试生产发酵罐（50 L、100 L、0.5 t、1 t、5 t、10 t、60 t，镇江东方生物工程设备技术有限责任公司）;压力喷雾干燥设备（水分蒸发量1 000 kg/h，无锡市现代喷雾干燥设备有限公司）。

Abstract Plectasin antimicrobial peptide;High-density fermentation process;Determination of plectasin content;Product characteristics
2019年7月10日，《农业农村部公告第194号》指出，2020年7月1日起，除中草药外，饲粮中禁用其他促生长类药物饲料添加剂。

因此，开发替代抗生素的绿色、生态、安全、高效的新型饲料添加剂是我国畜禽养殖业的热点及重点。

益生菌、中草药、多糖、抗菌肽等无抗药性、无残留、毒副作用小，具有良好的市场开发及应用前景，是高效、绿色环保型饲料添加剂[1]。

抗菌肽（antimicrobial peptide，AMPs）是由12～50个氨基酸组成的小生物分子肽，是先天免疫系统的重要组成部分，具有分子量小、易溶于水、耐热性、抗菌谱广和不易产生耐药性等特点[2];还具有一定的免疫学活力[3]。

因此，开发利用抗菌肽取代传统抗生素，对提高畜产品品质、推动绿色畜牧业的发展、保障食品安全具有重要意义。

目前获得抗菌肽的方式主要有从生物体内直接分离提纯有生物活性的抗菌肽，再对其结构和功能进行研究。

这种方法比较烦琐，且得到的抗菌肽含量普遍很低，不适合规模化生产。

人工合成抗菌肽。

根据已知的抗
菌肽基因序列，用化学方法合成抗菌肽。

这种方法成本高，不适于普及应用。

酶解法。

主要是通过将有抗菌活性的蛋白用特定的蛋白酶切割下其有抗菌活性的部分进行纯化，继而得到抗菌肽。

这种方法得到的抗菌肽活性较高，但产量低，成本高。

利用基因工程菌生产抗菌肽，可以在一定程度上解决这些困难，通过这种方法得到的抗菌肽目的性强，技术上有提高产量的空间，成本低，应用广，是生产抗菌肽的一条理想途径[4]。

目前用于基因工程的异源表达系统
在生产不同大小、折叠和复杂性的异源抗菌肽方面取得了很大的进步，抗菌肽生产的主要表达系统是细菌和酵母表达系统。

毕赤酵母是酵母表达系统中应用最广泛的表达系统[4]。

乔莹等[5]通过Eco31 I限制性内切酶定向连接方法合成大黄鱼与美国红鱼抗菌肽Piscidin串联基因，以
毕赤酵母的穿梭表达载体pPICZαA构建重组表达质粒pPICZαA-PSP，转化入毕赤酵母
SMD1168菌株中，实现了PSP重组串联肽的诱导表达和纯化，初步鉴定Piscidin抗菌肽对大
肠杆菌、金黄色葡萄球菌和爱德华氏菌等均有抑制生长的活性。

邓赣奇等[6]将优化的目的蛋
白碱基序列与标签MBP基因序列融合，通过双酶切将重组基因序列插入到毕赤酵母pGAPZaA 表达载体上并进行连接反应，成功获得一种能分泌菌丝霉素的毕赤酵母，对其分泌蛋白进行Western blot检测、纯化、活性分析和质谱鉴定，得到的重组蛋白为55 ku左右，浓度为700 mg/L，纯度达80%以上，质谱鉴定结果表明，蛋白序列的覆盖率达98%，纯化后的蛋白对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。

到该研究实施前为止，重组菌丝霉素抗菌肽尚处于研发阶段，国内尚未见产业化报道。

通过毕赤酵母表达系统生产抗菌肽是一种有效的生产方法，相对于细菌表达系统生产抗菌肽，表现出更多的优势。

因此，开展重组菌丝霉素基因工程抗菌肽产业化研发具有现实意义。

该研究通过高产菌丝霉素毕赤酵母基因工程菌高密度发酵工艺优化及其特性研究，完成菌丝霉素抗菌肽工艺放大试生产、产品试制、试运行，成果转化达到产业化目标。

如何提高基因工程菌丝霉素抗菌肽菌株发酵生物表达量，提高生产效率、降低成本，实现廉价、规模化生产，已成为目前抗菌肽研究开发产业化过程中，亟待需要解决的关键问题。

笔者通过补料高密度发酵工艺优化试验，并完成菌丝霉素结构、分子量及产品中菌丝霉素成分含量检测，实現在实验室15 L发酵罐基础上发酵菌体鲜生物量提高到400 g/L、抗菌效价表达量提高到8 000 U/mL以上，使发酵终产品收率达10%、产品抗菌效价达8万U/g、产品中菌丝霉素含量达2%以上，实现60 t罐规模的产业化稳定生产的要求。

该产业化成果，经上海科学技术情报研究所科技查新，国内外未见有同类研究。

1 材料与方法
1.1 试验地点
试验于2017年1月—2018年12月在上海邦成生物工程有限公司微生物及发酵研究所发酵实验室及发酵中试、生产车间进行。

1.2 主要仪器
超低温冷冻柜（DW-86L338J，青岛海尔特种电器有限公司）;生物显微镜（XSP-BM-
2CA，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司）;超净工作台（YJ-1340，苏州苏信环境科技有限公。