细胞凋亡的显示 (实验)

实验项目名称细胞凋亡的显示
一、实验目的
1．了解细胞凋亡的形态学观察
2．掌握荧光显微镜的使用方法
二、实验原理
1.细胞凋亡，是由基因编辑控制的细胞主动参与的自杀过程，是一种生理性调节机制。

细胞发生凋亡时，在组织中是呈单个细胞发生;细胞体积浓缩:细胞器完整，细胞膜完好;细胞核浓缩、碎裂(染色质浓缩)，有规律性的断裂成核碎片。

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:1期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;b期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

2.顺铂等肿瘤化疗药物可以作为细胞凋亡诱导剂诱导细胞凋亡。

三、实验仪器与试剂
1.材料：A549肺癌细胞
2.仪器：荧光显微镜
3.试剂：0.01mM PBS, 4%多聚甲醛，DAPI染料
4．其它:盖玻片、载玻片、细胞培养板、移液枪、封口膜、烧杯、滤纸、滴管,吸水纸等。

四、实验步骤
（一）荧光显微镜使用步骤
○1将已处理好的样本放到载物台上
○2将10X物镜转入光路，调节载物台纵横移动手轮，将标本移入光路
○3调节滤光片转换器，选择3档UV光观察:
○4调节粗条手轮，看清荧光图片轮廓后，再调节微调手轮调节，直至看到清晰的荧光图像。

○5推出摄影/目视切换杆，电脑拍照
（二）观察细胞凋亡
1. 盖玻片置于细胞培养皿中，二氧化碳培养箱培养A549肺癌细胞24h，形
成细胞爬片；随后加入浓度为3ug/ml的顺铂培养24h，诱导细胞凋亡；
2. 取出细胞培养皿，吸出培养基；
3. PBS洗涤2次：加入2ml PBS，静置2min，吸出；重复操作一次；
4. 加入2ml 37℃预温过的 4%多聚甲醛固定细胞10min；
5. 在干净的封口膜中滴加20ul稀释好的DAPI，小心取出细胞爬片，细胞面
向下避光孵育10min；
6. PBS 洗涤2次：吸水纸吸干DAPI，在爬片一端用注射器加入PBS约0.1ml，
吸水纸在爬片另一端吸出PBS（虹吸法）；重复操作一次。

全程尽量避光，且不要移动细胞爬片，防止细胞掉落。

7. 取出爬片平移到载玻片上（讲台领）（1块载玻片可放2张爬片）；
8. 荧光显微镜紫外光（UV）观察细胞凋亡的三个时期并拍照。

9. 使用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡的三个时期并拍照
10. 实验结果请务必按照老师的示范图进行排版并彩色打印出来。

注意事项：
1.注意爬片的正反面
2.封口膜上孵育时切勿产生气泡
3.镜检前爬片干了可用注射器滴加PBS润湿
五、实验结果
荧光显微镜实验结果图
Control Stage I
Stage lla Stage Ilb
细胞不同凋亡时期的细胞形态
各个时期图片中显示的特征：
Control ：细胞形态较正常，结构完整，染色质未浓缩，但是可以看出细胞有所皱缩
Stage I：细胞膜起泡、出芽，细胞核呈波纹状，部分染色质出现浓缩状态Stage lla：（未找到较明显的该形态细胞）细胞核的染色质高度凝聚、边缘化Stage Ilb：细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体，染色质断裂成片段，染色质片段及线粒体等细胞器被反折的细胞膜包围并逐渐分开，形成单个的凋亡小体。

凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体。

六、分析与讨论
1.视野中没有发现比较经典的Stage lla 时期细胞图像，探究原因？
○1样本处理与染色：在使用DAPI染色时，可能操作有所不到位，例如在将细胞爬片放到DAPI上时有气泡，可能影响染色效果和细胞形态的清晰度。

○2等待时间长，样本在荧光显微镜下观察前未保持湿润，干燥可能导致细胞形态发生变化，影响观察结果。

○3 Stage IIa是细胞凋亡过程中的一个短暂阶段，因此处于该阶段的细胞较少，本身便难以观测到。

○4细胞凋亡过程中的形态变化可能受到多种因素的影响，如细胞内的信号传导途径、基因表达调控等，这些因素可能导致某些细胞在凋亡过程中不经历
典型的Stage IIa形态。

○5在观察过程中可能对细胞形态的记录和比较不够仔细，难以区分不同凋亡阶段的细胞。

○6实验过程中可能存在一些误差和偶然性，如细胞分布不均、染色不均等，这些都可能影响观察结果。

2.为什么选择DAPI作为细胞凋亡观察的荧光标记物？
○1DAPI是一种能够与DNA结合的荧光染料，可以穿透细胞膜，与细胞核中的双链DNA结合（结合于DNA的AT碱基对）后发出强烈的蓝色荧光。

这种特性使得DAPI成为观察细胞核形态和DNA结构变化的理想工具。

○2细胞凋亡过程中的核变化：在细胞凋亡过程中，细胞核会发生明显的形态学变化，如染色质浓缩、核碎裂等。

DAPI能够清晰地显示出这些变化，从而帮助研究者准确判断细胞凋亡的阶段。

○3DAPI的安全性和易用性：DAPI是一种相对安全、无毒的荧光染料，对细胞的毒性较小，半通透细胞，不会影响细胞的正常生理活动。

此外，DAPI的使用方法简单，染色效果稳定，易于观察和记录。

○4DAPI的广泛应用：DAPI广泛用于细胞周期、染色体和细胞核的观察。