慢病毒介导的RNAi技术

慢病毒介导的RNAi技术
一、概述
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

和一般的逆转录病毒载体不同，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

并且它可以有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，因此具有广阔的应用前景。

目前慢病毒被广泛地应用于RNAi的研究中。

由于体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。

采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转入细胞内转录siRNA的策略，不但对基因表达抑制效果不逊色于体外合成siRNA，而且稳定整合表达载体的细胞中，可以发挥长期阻断基因表达的作用。

但上述两种方法，一是受到转染试剂转染效率的影响，在一些细胞内无法有效敲低（Knockdown）一些基因；二是传统方法得到稳定细胞株通常需要挑取单克隆，进行克隆化，这样费时费力。

利用慢病毒介导的方法可以解决上述问题，这是因为慢病毒介导的RNAi具有下述优点：
● 慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，不存在某些细胞难以转染的问题。

● 慢病毒可以在细胞基因组上稳定整合表达siRNA的元件，siRNA表达效率比较均一，因此，无需挑取单克隆。

● 慢病毒载体具有嘌罗霉素（Puromycin）抗性基因，Puromycin可以在2-3天内杀死细胞，只有整合了病毒载体的细胞能够存活，这样缩短了得到稳定细胞株的时间。

慢病毒表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。

当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。

U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21nt RNA和～50nt RNA茎环结构（stem loop）。

在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体内的位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。

慢病毒介导的RNAi和其它方法的比较见图1。

二、pLKO.1载体
美国RNAi协作组（The RNAi Consortium）已经利用pLKO.1载体骨架构建了针对15,000个人类基因和15,000小鼠基因的shRNA库，详细信息见文献Moffat et al., Cell 2006 Mar; 124(6): 1283-98。

pLKO.1是一种复制缺陷型慢病毒载体，它可以直接通过转染操作被导入细胞，作为常规RNAi载体使用，也可被包装成慢病毒颗粒，然后感染细胞。

一旦进入细胞，整合到基因组，便可以稳定表达shRNA和具有Puromycin 抗性，Puromycin筛选可以杀死没有稳定整合慢病毒载体的细胞，得到稳定整合的细胞系。

图2，3分别为pLKO.1载体的图谱和shRNA的示意图。

元件注释
5’ LTR5’ 长末端重复序列（long terminal repeat）
RRE Rev反应元件，介导转录本出核，从而被有效包装
U6 人类U6启动子，RNA聚合酶Ⅲ可以识别，指导下游shRNA转录shRNA insert 小发卡RNA插入片断
cPPT Central polypurine tract，促进载体片断入核，提高整合效率
hPGK 人类磷酸甘油激酶启动子，指导puromycin抗性基因的组成性表达
Puro R 表达的蛋白使细胞具有puromycin抗性，方便选择
sin 3’ LTR3’ 失活长末端重复序列
F1 ori f1细菌复制起点
Amp R 氨苄青霉素抗性基因
pUC ori pUC细菌复制起点
三、shRNA寡核苷酸序列的设计和合成
A. 设计
确定一段合适的21个碱基的靶序列是有效的敲低某个基因的非常重要的第一步。

现在一些互联网上的服务器能够帮助提供一些线索。

例如，由Whitehead生物医学研究所（The Whitehead Institute for Biomedical Research）设立和维护的siRNAext程序（/siRNAext），登记个人信息后，便可免费使用。

下面为一些设计siRNA的基本原则：
1. 从起始密码ATG下游25个核苷酸后开始，寻找21个核苷酸，排列模式符合AA(N19)。

如果没有符合上述模式的序列，可以寻找符合NAR(N17)YNN这种排列模式。

N为任一核苷酸，R为嘌呤，Y为嘧啶。

2. GC含量介于36%-52%。

3. “sense”链3’端稳定性较低，在15-19核苷酸位置，至少有一个A或T。

4. 避免靶向内含子。

5. 避免21个核苷酸内有连续4个或更多重复的核苷酸，尤其避免重复的T，因为重复的T可以导致RNA 聚合酶Ⅲ转录终止。

为了避免设计的siRNA有靶向其它基因的脱靶（off-target）效应，需要进一步利用NCBI的BLAST 程序进行同源性搜索，选择至少和其它基因序列有3个错配的序列。

（通常需要选择多条序列来靶向同一基因，一是为了选择比较有效的siRNA序列，二是为了避免不可预知的脱靶效应，如果两条siRNA引起了相同的细胞表型改变，通常可以消除脱靶效应的疑虑。

B. 合成：一旦确定了靶序列，可以将靶序列放入下面的基本骨架：
正向寡核苷酸（Forward oligo）
5’ CCGG-21个碱基（靶序列）-CTCGAG-21个反向互补碱基序列-TTTTTG3’
反向寡核苷酸（Reverse oligo）
5’ AATTCAAAAA-21个碱基（靶序列）-CTCGAG-21个反向互补碱基序列3’
基本骨架内红色标记的核苷酸为必须存在的核苷酸，这样，退火（Annealling）以后，寡核苷酸两端会形成以后能够连接入载体的粘性末端。

举例如下：
如果靶序列为：AA（TGCCTACGTTAAGCTATAC）。

合成的寡核苷酸应为如下序列：
正向寡核苷酸（Forward oligo）
5’CCGG AATGCCTACGTTAAGCTA TAC CTCGAG GTATAGCTTAACGTAGGCA TT TTTTTG3’
反向寡核苷酸（Reverse oligo）
5’AATTCAAAAA AATGCCTACGTTAAGCTATAC CTCGAG GTATAGCTTAACGTAGGCATT 3’
上述寡核苷酸合成规格为100nmol，纯化方式为PAGE纯化。

四、siRNA序列克隆入pLKO.1载体
酶切pLKO.1克隆载体，合成的正向和反向寡核苷酸退火以后形成寡核苷酸双链，两端具有和酶切后的载体兼容的粘性末端，经过连接反应，便能产生含有shRNA序列的pLKO.1载体。

A.实验材料
AgeI (NEB, #R0552S)，EcoRI (NEB, #R0101S)，Buffer 2(NEB, #B7002S)，Solution I (Takara, D6022)，琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒（QIAGEN，#28704），1.5ml微型离心管（Biologix, 货号：80-1500）。

B. 寡核苷酸退火
溶解合成的寡核苷酸，终浓度20µM（高压灭菌水溶解核酸，水的体积=（合成得到的核酸nmol数X50）µl），按照表2反应体系在1.5ml微型离心管内配制反应。

在1L烧杯内准备700-800ml温度为95o C-100o C的水，将微型离心管置入烧杯，放置于试验台上，缓慢降温至室温，这个过程约需要2小时。

表2：退火反应体系
5µl Forward oligo
5µl Reverse oligo
5µl 10 x NEB Buffer 2
35µl H2O
C. 酶切pLKO.1克隆载体
1. 首先用AgeI酶切，反应体系如下：
4µg pLKO.1克隆载体
5µl 10 X NEB buffer 1
2µl AgeI
补水至总体积50µl
37o C水浴孵育1小时。

2. 用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化酶切反应产物，30µl H2O洗脱。

3. 纯化产物用EcoRI酶切，反应体系如下：
30 µl AgeI酶切产物
5µl 10 X NEB buffer for EcoRI
2µl EcoRI
13 µl H2O
37o C水浴孵育1小时。

4. 在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离酶切后载体，可看到一约7kb的片断（AgeI和EcoRI酶切会切出约60bp 的寡核苷酸，在0.8%的凝胶上无法看到），切胶，回收，30µl H2O洗脱。

5. 测量核酸浓度。

D. 连接和转化
按照下述反应体系配制连接反应：
2µl 退火的寡核苷酸双链（步骤四. B）
1µl 20ng/ µl 酶切的pLKO.1克隆载体
2µl H2O
5µl solution I
22o C孵育15分钟，然后进行转化：取5 µl连接产物加入50 µl感受态细胞内，冰上放置30分钟，42o C水浴90秒，速置于冰上2分钟，将感受态细胞涂布于氨苄平板上。

16小时后可见有白色克隆。

同时，如果第一次使用酶切载体，推荐进行一个对照连接反应，不加寡核苷酸双链，用水补齐体积，酶切良好的载体为对照连接反应没有克隆或1-2个克隆，而加入寡核苷酸的连接反应可以得到10个以上的克隆。

E. 阳性克隆的鉴定
挑取3-5个克隆，提取质粒，通过酶切和测序来鉴定阳性克隆。

1. 酶切鉴定
1 µg 质粒
2 µl 10 X NEB buffer for EcoRI
0.8 µl EcoRI
0.8 µl NcoI
补水至总体积20µl
37o C水浴孵育1-2个小时。

电泳可以见到2kb和5kb的两个片断。

2. 测序鉴定
有时因为碱基修饰的原因，质粒不能被切开，这时可以通过直截测定序列的方法来鉴定。

酶切鉴定得到阳性克隆后，进一步需通过测序的方法来证实寡核苷酸序列是否正确。

测序引物为5’ CAAGGCTGTTAGAGAGA TAATTGGA 3’。

五. 制备病毒颗粒
进行这些实验的实验室必须具有操作HIV和HIV相关病毒的资质和经验。

pLKO.1载体可以被作为常规载体使用，通过转染操作导入细胞，瞬时敲低基因。

如果希望得到稳定敲低基因的细胞系，则需要用pLKO.1载体包装成病毒颗粒，然后感染（infect）细胞，用puromycin筛选基因组稳定整合shRNA序列的细胞。

下面以转染60mm培养皿为例进行说明，如果需要更大量的病毒液，可以按比例扩大规模。

第一天：
种植细胞，在60mm培养皿内种植7x105的HEK-293T细胞，培养基体积为4ml。

第二天：
转染，在细胞种植16-24小时后进行转染操作，可以按照所在实验室常规转染293T的方法进行转染，也可选用前景科创公司的293Fect（专业转染293细胞的转染试剂），方便快速。

下面转染操作以293Fect为例说明：
第三天：
细胞过夜培养后，换用新鲜培养基（旧的培养基需要经过10%漂白剂处理后才能丢弃）。

24小时后，观察293T 细胞，如果细胞状态不好，约有20%-30%的细胞死亡，此时收集培养基（已经有慢病毒产生），置于15ml 离心管内（Biologix, 货号：10-0151），存放于4o C。

否则，可继续等待直至48小时，待细胞状态如上面描述时，收获培养基。

第四天：
收获一次慢病毒后，可继续加入4ml 新鲜培养基，24小时后再收获一次病毒。

将两次收获的病毒液合并，1250rpm，离心5分钟，将细胞碎屑离心至管底，取上清感染细胞或者冻存。

也可用孔径为0.45µm的针头滤器过滤去除293T细胞。

病毒液在4o C可以存放几天，如需长期保存，需要分装后冻存于-80o C。