延龄草提取物对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏代谢组学的影响

延龄草提取物对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏代谢组学的影响谢慧臣;黄谨;袁林;黄琼
【摘要】目的应用代谢组学技术研究延龄草提取物对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠肝脏代谢的影响,探讨延龄草干预NAFLD的作用机制.方法腹腔注射四氯化碳溶液结合复合高脂饮食建立NAFLD大鼠模型,并随机分为正常组、模型组、延龄草提取物高、中、低剂量组,灌胃4周后逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测肝细胞能量代谢调节相关基因的表达,应用生化气相色谱-质谱联用技术和模式识别及多元统计分析方法考察延龄草对NAFLD大鼠肝脏代谢组学的影响.结果与模型组比较,延龄草提取物各剂量组大鼠肝细胞低密度脂蛋白受体(LD-LR)、解偶联蛋白
1(UCP-1)基因表达不同程度升高(P＜0.01),脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)基因表达不同程度下降(P＜0.01),OPLS-DA结果显示延龄草能明显降低非酒精性脂肪肝模型大鼠尿液中的苹果酸、柠檬酸、延胡索酸、甘氨酸、缬氨酸和软脂酸甘油脂的含量;升高丁酸、棕榈酸、花生四烯酸和十六碳烯酸,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);结论延龄草提取物可能通过调节肝细胞能量代谢相关基因的表达发挥抗非酒精性脂肪肝的作用,并由此导致肝脏代谢物酶谱的变化.【期刊名称】《湖北民族学院学报（医学版）》
【年(卷),期】2017(034)004
【总页数】5页(P1-5)
【关键词】延龄草提取物;非酒精性脂肪肝;代谢组学;能量代谢调节基因
【作者】谢慧臣;黄谨;袁林;黄琼
【作者单位】湖北民族学院医学院湖北恩施445000;湖北民族学院医学院湖北恩施445000;湖北民族学院医学院湖北恩施445000;湖北民族学院医学院湖北恩施445000
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
延龄草是土家族地区常用珍稀药材，作用非常广泛，临床用于高脂血症、肿瘤、免疫系统功能紊乱等[1]，疗效突出，但其作用机制的研究目前还较少报道[2]。

为加快民族药的开发与研究，拟采用动物实验方法观察其防治非酒精性脂肪肝(NAFLD)的疗效。

鉴于肝脏是机体物质代谢的中枢器官，各种代谢过程均在肝脏进行，本实验在前期药效学研究[3]的基础上，采用代谢组学研究方法，通过分析经延龄草提取物干预后的NAFLD大鼠尿液代谢表型的变化情况，进一步阐明延龄草提取物对NAFLD的作用机制，为其应用于临床及后续的开发利用提供理论依据。

1.1 动物健康雄性清洁级SD大鼠50只，体质量(180 ±20 )g，由华中科技大学实验动物中心提供，许可证号SYXK(鄂)2016-0036。

1.2 药物与试剂制备延龄草提取物：延龄草饮片500 g ，批号20160507，购于湖北中联药业公司，加500 mL水浸泡30 min，煮沸后文火煎30 min，过滤，250 mL水再煎，过滤，合并两次滤液，浓缩得浸膏196 g，低温保存备用。

脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、解偶联蛋白1(UCP-1)mRNA实时荧光定量PCR试剂盒(批号分别为20160104、20160206、20160101、20160202)均购于上海酶联生物科技有限公司； PCR引物及序列、分子量和扩增条件见表1。

叠氮钠(NaN3)、四氯化碳、吡啶、乙腈、甲氧胺盐酸盐等均购于上海酶联生物科技有限公司。

1.3 仪器 DTC-3T梯度PCR基因扩增仪(上海启前电子科技有限公司)；abi7500
荧光定量PCR仪(ABI公司)；GC-8890B气相色谱柱、GC-MS 6800 气相色谱质
谱联用仪(江苏天瑞仪器股份有限公司)；N-1300V 旋转蒸发仪(长春乐镤科技有限公司)，FA1004N电子分析天平(上海丙林电子科技有限公司)，FZCC恒温振荡器(长沙诺达仪器设备有限公司)。

1.4 方法
1.4.1 制备高脂饲料颗粒参考文献[4]，胆固醇、胆酸钠、丙硫氧嘧啶、基础饲料、蔗糖及猪油占比(质量比)分别为
2.0∶0.5∶0.2∶82.3∶5.0∶10.0，饲料颗粒由
9KJ-25型多功能颗粒机制备(广东华达机器有限公司)，环摸孔径 12 mm，配方采用压缩比5∶1，蒸汽熟化温度为35℃。

1.4.2 模型制备参照王俊杰等[5] 创立的方法，向模型大鼠腹腔注射低浓度(0.01 mL/g)四氯化碳食用油溶液，1 mL/次，2次/ 周，同时给予模型大鼠复合高脂饮
食建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，共计6 周，造模过程中自由进食饮水，并记录
动物一般情况的变化。

1.4.3 分组及给药 50只大鼠随机分为正常组、模型组、延龄草提取物高、中、低
剂量组，每组10只，正常组基础饲料饲养，模型组，延龄草提取物高、中、低剂量组按上法造模，第7周开始灌胃给药，改喂基础饲料，用药量按临床等效剂量
及体表面积公式计算，延龄草提取物中剂量为每日10.0 g/kg，低剂量及高剂量为其一半剂量及2倍剂量，每日灌胃量2 mL/只，正常组和模型组每天生理盐水灌
胃2 mL/只，用药4周。

1.4.4 指标检测①延龄草提取物对模型大鼠肝细胞能量代谢调节相关基因表达的影响:FAS、ACC1、UCP-1、LDLR、LPL mRNA表达采用RT-PCR (逆转录聚合酶链反应) 法检测，取100 mg肝组织，匀浆器研磨，TRIzol试剂提取总RNA，cDNA逆转录合成，扩增PCR，反应条件、反应时间、循环次数及具体方法按说
明书操作，肝细胞FAS、ACC1、ACC2、UCP-1、LDLR mRNA的相对表达量结
果用ΔΔCT法处理，数据用“2-M”表示，M=X-Y， X=CT1(待测目的基因-待测内标基因)，Y=CT2(对照目的基因-对照内标基因)。

②延龄草提取物对模型大鼠尿液内源性代谢产物的影响: 用药第4周末，收集大鼠24 h尿液，放入冰水浴中，
加入1%NaN3溶液0.1 mL，0℃离心10 min(5 000 r/min)，取上清液， -80℃
保存。

大鼠尿液中内源性代谢物检测采用氯甲酸乙酯衍生化GC/MS法。

③尿液上清液37℃ 快速解冻，置0.3 mL于玻璃管中，依次加内标液0.1 mL、去离子水0.3 mL、吡啶0.1 mL、无水乙醇4 mL、氯甲酸乙酯0.05 mL，然后涡旋10 s，
超声1 min；然后加氯仿0.3 mL，涡旋30 s，3 000 rpm离心5 min；然后加NaOH溶液0.1 mL，氯甲酸乙酯0.05 mL，涡旋10 s，超声1 min，3 000 rpm 离心5 min，取出下层氯仿层，水分用无水硫酸钠除净，置于GC/MS进样瓶，取1 μL在GC/MS中进样。

色谱及质谱参数如下：氦气100 μL/min，全扫描范围50～600 m/z，进样口及接口温度均为250℃，通过GC/MS分析后，数据导入判峰程序，进行峰辨识、对齐及归一化等计算，结果得到一三维矩阵，由峰序列号、观测点和峰强度构成，导入SIMCA-P 软件，用OPLS-DA法分析正常组、用药组与模型组的代谢物谱，得出主成分，寻找相关的生物标记物，用t1和 t2作 PCA
得分图，对各组疗效进行比较，将GC-MS 检测的结果在数据库中进行比对鉴定，常见生物对照品有天然氨基酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、磷酸、肌醇、硬脂酸等。

1.5 统计学处理采用SPSS 17.0软件分析所得数据，计量资料以均数±标准差表示，均数两两比较用q检验，多组间样本均数比较用单因素方差分析和显著性检验，
P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 延龄草提取物对模型大鼠一般情况的影响实验过程中大鼠无一只死亡。

正常
组大鼠精神及饮食一直保持较好，行动灵敏，皮毛光滑顺泽，体质量升高缓慢而均
衡，而模型组及各治疗组在实验进行到第4周时，大鼠精神状态较正常组比较稍
变差，饮食量也有下降，行动欠灵活，活动度减弱，皮毛色泽较正常组欠光亮，略显灰暗杂乱。

当实验进行到第6周时，各组造模动物活动及饮食情况较前更差，
皮毛光泽度较前更显灰暗且杂乱。

从第7周开始用药治疗后直至治疗结束，各治
疗组大鼠上述情况均有明显好转。

2.2 延龄草提取物对各组大鼠肝细胞能量代谢调节相关基因表达的影响与正常组
比较，模型组大鼠肝细胞脂代谢合成相关基因FAS、ACC1 mRNA表达显著增加，而能量代谢相关基因UCP-1、LDLR mRNA表达显著下降(P<0.01) ；与模型组比较，延龄草各剂量组大鼠肝细胞脂代谢合成相关基因FAS、ACC1 mRNA表达不
同程度降低，而能量代谢相关基因UCP-1、LDLR mRNA表达不同程度升高
(P<0.05或P<0.01)；与延龄草低剂量组比较，延龄草中、高剂量组肝细胞脂代谢合成相关基因FAS、ACC1 mRNA表达不同程度降低，而能量代谢相关基因
UCP-1、LDLR mRNA表达不同程度升高(P<0.05或P<0.01),见表2。

2.3 延龄草提取物对各组大鼠尿液生物标记物的影响与正常组比较，模型组大鼠
尿液中丁酸、棕榈酸、花生四烯酸和十六碳烯酸的含量显著下降(P<0.01)，苹果酸、柠檬酸、延胡索酸、甘氨酸、缬氨酸和软脂酸甘油脂含量都明显上升
(P<0.01)；与模型组比较，不同剂量治疗组的尿液中丁酸、棕榈酸、花生四烯酸
和十六碳烯酸的含量有所升高，苹果酸、柠檬酸、延胡索酸、甘氨酸、缬氨酸和软脂酸甘油脂的含量都明显下降(P<0.05或P<0.01)；延龄草提取物不同剂量组之间上述生物标记物的含量比较亦有显著差异(P<0.05或P<0.01),见表3。

NAFLD包括单纯性脂肪肝及脂肪性肝炎，后者可以进展为肝纤维化和肝硬化，其发病机制尚不十分清楚。

其主要成因除了与环境、遗传等因素有关外,还与饮食习
惯密切相关。

高脂高糖饮食习惯往往是NAFLD后天形成的关键因素[6]。

大量研
究表明，NAFLD 与胰岛素抵抗、氧化应激、脂肪细胞能量代谢紊乱等因素密切相
关[7]。

因此，纠正肝细胞能量代谢紊乱、改善胰岛素抵抗等，从源头上降低上述代谢疾病的危险因素一直是临床治疗的重点之一[8]。

线粒体功能结构都很敏感且复杂，易受各种损伤因子如氧化物等攻击，导致脂肪肝的发生[9]。

高胆固醇高脂饮食可诱导内质网应激，并进而导致肝细胞内脂质沉积和脂肪肝的发生[10]。

FAS和ACC1作为生物酶，对脂肪生成具有重要作用，ACC1在肝脏中高表达，可催化乙酰CoA生成长链脂肪酸，FAS是一种多酶复合体，是脂肪酸合成的限速酶，在脂肪代谢中作用非常关键，研究表明FAS基因的表达与体脂水平关系非常密切[11]。

UCP位于线粒体内膜上，主要作用参与调节机体能量代谢，抑制ATP合成，氧化脂肪酸，并且促使机体能量释放[12]。

LDLR 在机体细胞中广泛存在，而肝细胞含量最多，对脂蛋白的代谢具有重要作用，有研究表明LDLR基因可调节LDL摄取，对胆固醇代谢具有重要作用[13]。

Real-time PCR 结果表明延龄草提取物能够明显抑制FAS、ACC1等脂代谢合成相关基因的表达，同时还可以显著促进LDLR、UCP-1等能量代谢相关基因的表达，从而促进脂肪的分解与代谢，减少脂肪在NAFLD大鼠肝脏中的蓄积，逆转NAFLD大鼠的肝内脂肪变性，有利于肝脏形态结构及功能的恢复。

由此可以推断，对肝细胞能量代谢相关基因的表达的调控可能是延龄草提取物抗大鼠非酒精性脂肪肝脂肪变性及肝纤维化作用的重要途径之一。

目前，气相色谱质谱联用技术(GC-MS)分离效率、检测灵敏度及分辨率都较高，有标准谱图库，其MS图谱主要由计算机进行自动分析，迅速鉴识样品，并在标准谱图库中进行自动检索核对，可定性分析代谢组分[14]。

分析时，为利于GC分离并增加样品挥发性与稳定性，首先衍生化处理样品，第二步是用MS高速扫描每一个气相色谱峰，通过质谱数据库和碎片峰类型与质/荷比来鉴定每个峰所代表的化合物分子结构，并通过峰面积定量该化合物的含量[15]。

肝脏作为人体最主要的代谢器官，代谢功能紊乱涉及面广，代谢物特征可作为预测肝损模型严重程度的
指标，而且在肝病研究方面已开展了大量的相关工作，如孙启慧等[16]采用
HPLC-TOF-MS探讨麻黄细辛附子汤治疗流感小鼠的作用机制。

马致洁等[17]采用液相色谱质谱方法测定服用何首乌大鼠的血清代谢指纹谱，探讨何首乌致大鼠肝脏损伤的代谢组学动态变化。

尿液代谢可准确全面的反映机体内有组织的相互影响及带来的生理病理改变，且样品采集、样品处理、仪器分析简便易行，尿液内源性代谢物成分及含量在一定时间(24 h)内相对稳定[18]，本课题选用动物尿液代谢物作为检测对象，取所有动物24 h尿液进行比较，以消除个体误差、组间误差，并降低由于生物节律导致的实验误差。

本组结果显示延龄草提取物对非酒精性脂肪肝引起的肝损伤具有一定的保护作用。

从代谢组学角度来说，其主要表现是尿液中氨基酸、糖类、脂肪酸类和有机酸类等各种代谢物谱发生了相应的改变，而GC-MS 分析后所得数据显示多种代谢物的含量在正常组与模型组之间差异显著，说明模型制作是成功的，也体现了正常组与模型组生理病理状况不同的物质基础，从代谢物谱变化的这一整体状况反映了肝损伤的机理。

生物标记物差异表进一步显示，模型组大鼠与正常组大鼠相比尿液中丁酸和棕榈酸含量显著下降，其原因可能是氧化应激抑制了肝脏的合成功能，导致内源脂肪酸不能外运，而苹果酸、柠檬酸和延胡索酸含量则上升明显，而上述3种物
质参与了三羧酸循环，而氧化应激会抑制三羧酸循环，从而使上述物质在体内蓄积而含量升高；作为细胞膜的主要构成成分，模型组尿液中花生四烯酸和十六碳烯酸含量亦下降，是因为氧化应激导致细胞膜脂质过氧化和磷脂的合成增加而导致以上2种物质大量消耗所致，糖异生反应受到抑制则导致模型大鼠尿液中甘氨酸和缬氨酸含量升高。

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