犬弓首蛔虫西宁株线粒体基因nd1和nd4序列分析

犬弓首蛔虫西宁株线粒体基因
ND1和ND4序列分析
黄　龙
（青海省动物疫病预防控制中心，青海西宁　810001）
摘　要：为了解犬弓首蛔虫在国内外的进化特点，从位于青藏高原的青海省西宁市城区流浪犬及宠物犬粪便中获取虫体，针对不确定性因素影响，采用降落PCR并作出相应调整，扩增出西宁株ND1和ND4基因片段，经DNAstar软件包比对序列同源性和进化关系分析发现，犬弓首蛔虫西宁株线粒体基因ND1和ND4大小分别为360、400 bp。

与在线BLAST检索收集的国内外6条弓首属不同种基因序列进行序列同源性和进化关系比对发现：ND1基因片段与我国广东犬分离株的序列同源性最高，为99.5%；与日本犬分离株的同源性最低，为82.6%，甚至低于伊朗的猫分离株（88%）。

进化关系上，ND1基因与广东珠处于进化树的同一分支上，ND4基因仅与广东犬分离株高度同源（99.5%），而与其他序列的同源性都很低。

两个基因的进化树分析结果与序列同源性分析结果基本一致。

不同种的序列在进化上不在同一分支，表明种属和地域差异可影响犬弓首蛔虫的进化特点。

本研究证实，西宁株犬弓首蛔虫属于我国大陆流行的遗传分支，并非独立株。

这为进一步针对青藏高原区域犬弓首蛔虫的分子遗传学和分子诊断学研究奠定了基础，同时为公共卫生防治提供了依据。

关键词：犬弓首蛔虫；ND1；ND4；进化关系
中图分类号：S852.7 文献标识码：B 文章编号：1005-944X（2020）04-0090-06
DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2020.04.018
Sequence Analysis on Mitochondrial ND1 and ND4 Genes of
Xining Strain of Toxocara canis
Huang Long
（Qinghai Animal Disease Control Center，Xining，Qinghai　810001，China）
Abstract：In order to recognize the evolutionary characteristics of canine Toxocara canis（T. canis）in the domestic and overseas，the samples of parasites were collected from the feces of stray dogs and pet dogs in Xining City of Qinghai Province where was located in Qinghai-Tibet Plateau，then ND1 and ND4 genes of Xining strain were amplified and adjusted by touchdown PCR based on the influence of some uncertain factors，and the lengths of the two genes were 360 bp and 400 bp respectively. Through comparison of sequence homology and analysis on evolutionary relationship of 6 gene sequences of different species of Toxocara genus from online BLAST retrieval，it was found that，the sequence homology of ND1 gene between Xining strain and Guangdong dog-derived isolate was the highest （99.5%），and it was lowest with Japanese dog-derived strain（82.6%），which was even lower than that with Iranian strain isolated from cat（88%）. For the phylogenetic relationship，for ND1 gene，the Xining strain and Guangdong isolate were located in the same branch of evolutionary tree，while for ND4 gene，Xining strain was highly homologous with Guangdong dog-derived isolate（99.5%），but very low with other sequences. The analysis results of
收稿日期：2019-12-12　修回日期：2019-12-30
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evolutionary tree were generally consistent with those of sequence homology. Evolutionarily ，the sequences of different species were in different branches ，indicating that the evolution characteristics of Toxocara canis might be influenced by species and regional diversity. It was confirmed that Xining strain was not an independent branch ，instead ，it belonged to the genetic branch prevalent in the mainland of China. The research would lay a foundation for further study on molecular genetics and diagnostics of T. canis in the region of Qinghai-Tibet Plateau and provide a basis for public health control.
Key words ：Toxocascaris canis ；ND1；ND4；evolution relationship
犬弓首蛔虫（T. canis ）是一种世界性的人兽共患寄生虫病病原[1]
，主要造成幼儿的虫体移行症等[2]。

青海省西宁市宠物以犬、猫、鸟和鱼居多[3]
，动物与人接触密切，因此犬弓首蛔虫给西宁市居民身体健康形成较大威胁。

目前，犬弓首蛔虫的鉴定主要通过形态学和分子生物学两个途径[4]
：形态学方面，犬弓首蛔虫雄性成虫的尾端有锥形或指型的凸起[5-6]
，还有
学者关注头端、颈翼的形态区别
[7-8]
；分子生物学
方面，最常规的是PCR 扩增可备选基因片段，常用的有核糖体DNA 及其间隔序列，线粒体基因组中的多个基因，如NADH 脱氢酶亚基（ND ）系列和细胞色素c 氧化酶亚基（COX ）系列
[4，8-9]。

2015年11月，在青海省西宁市采集的新鲜犬粪中分离到1株犬弓首蛔虫，将其命名为犬弓首蛔虫西宁株。

本研究选择犬弓首蛔虫线粒体基因组中的NADH 脱氢酶亚基1基因（ND1）和4基因（ND4）作为犬弓首蛔虫西宁株与国内外及同属不同种之间亲缘关系分析的参考基因。

这主要基于真核生物线粒体基因组进化速率快，同时这两基因在物种内序列保守性很高
[10]
，常被用于真核生物特别是寄生
虫的遗传进化关系分析[4，8-10]
，都可以从种的水平
来推断某个属的系统发育关系[11]。

为了解西宁株在国内外虫株中的进化地位，通过扩增测序线粒体基因ND1和ND4，分析其序列同源性和进化关系，从而为该人兽共患寄生虫病防控提供依据。

1　材料与方法1.1　试验材料
1.1.1　虫株来源　2015年11月，在采集于西宁市人民公园后门宠物交易市场的新鲜犬粪便中分离获得，并经形态学和分子生物学双重鉴定，确认为犬弓首蛔虫雌虫。

采用线虫ND 1和ND 4的通用引物
[12]
，并委托上海生工合成。

1.1.2　试剂与耗材　动物基因组DNA 快速抽提试剂盒，购自上海生工；甲醛、DL 2 000 bp DNA Marker 、Taq PCR Mastermix 、琼脂糖、50×TAE 、核酸染液、无水乙醇等试剂，购自天根生物；1.5 mL 管、PCR 管、各规格吸头、一次性薄膜手套等耗材，购自北京索莱宝。

1.1.3　仪器设备　PCR 仪：德国Eppenndorf 公司生产；高立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KBS ）：高上海申安医疗器械厂生产；电泳仪（DYY-12型）：北京市六一仪器厂生产；凝胶成像系统（6300型）：上海天能仪器公司生产；帕斯蒂卡超纯水机（PSDKI-30-B ）：北京子涵世纪科技有限公司生产；小型高速离心机（80-2B ）：上海安亭科学仪器厂制造。

1.2　方法
1.2.1　试剂配制　①1×TAE 应用液：根据配胶量，将一定体积的50×TAE ，用蒸馏水稀释50倍。

②引物储存液：根据上海生工提供的引物合成报告，加入指定提及的灭菌双蒸水，引物浓度为100 μmol/L ，-20 ℃保存备用。

③引物应用液：把一定体积的引物储存液，用灭菌双蒸水10倍稀释，4 ℃备用。

④饱和NaCl 溶液：烧杯中加入蒸馏水，电炉加热煮沸，然后加入NaCl ，边加边搅拌，直到有大量NaCl 颗粒存在，并且不再溶解时停止
加热；趁热用两层纱布过滤到新的洁净容器中，冷却后即为饱和NaCl溶液。

为减少不确定因素干扰，饱和NaCl溶液现配现用。

⑤2.5%福尔马林：依据甲醛商标的浓度（35%或40%），按照公式（35或40）/（100+X）=5%，计算出X值即为100 mL 甲醛中添加的蒸馏水量。

⑥75%乙醇：蒸馏水和无水乙醇按照体积比1:3互溶。

1.2.2　基因组DNA提取　提取前的虫体处理：将从粪便中收集的虫体，用灭菌蒸馏水反复漂洗，直到看不到明显的粪便等残渣；用2.5%的福尔马林浸泡和漂洗约30 min，重复2次；用灭菌蒸馏水多次漂洗虫体，去除残留的福尔马林后并收集虫卵，-80℃保存备用。

基因组DNA提取，按说明书操作执行：①取25~50 mg虫体用液氮研磨成粉末，加到1.5 mL离心管中，加入400 mL Buffer Digestion，震荡混匀。

65℃水浴1 h至细胞完全裂解。

②加入200 mL Buffer PA，充分颠倒混匀，置于-20℃冰箱放置5 min。

③室温10000 r/min离心5 min，将上清液（500~550μL）转移到新的1.5 mL离心管中。

④加入等体积的异丙醇，颠倒5~8次使之充分混匀，室温放置2~3 min。

，然后室温10000 r/min离心5 min，弃上清。

⑤加入1 mL 75%乙醇，颠倒漂洗1~3 min，10000 r/min离心2 min，弃上清。

⑥重复步骤⑤1次。

⑦开盖，室温倒置5~10 min至残留的乙醇完全挥发。

⑧将得到的DNA用50~100μL 灭菌双蒸水溶解，然后分装成小份；根据需要，取1份立即进行下一步试验，其余的-20℃保存。

1.2.3　ND1和ND4基因扩增　扩增目标DNA片段的PCR反应体系（20μL）：DNA模板1.0μL，上下游引物各1.0μL，2×Det PCR MasterMix 10.0μL、ddH2O 7.0μL。

考虑到引物的退火温度和一些不确定因素，PCR 反应程序选取降落PCR 方式，并做了相应调整。

ND1片段PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性、46℃退火、72℃延伸30 s，循环2次；94℃变性、44℃退火、72℃延伸30 s，循环28次；再进行72℃延伸5 min，最后4℃保存。

ND4片段PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性、40℃退火、72℃延伸30 s，循环2次；94℃变性、38℃退火、72℃延伸30 s，循环28次；再进行72℃延伸5 min，最后4℃保存。

1.2.4　目标DNA片段扩增与测序　扩增结果用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，电压100 V；电泳时间由上样缓冲液条带移动位置确定，约30 min。

用凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。

阳性样品送上海生工与华大基因公司测序。

测序结果经过BLAST和DNAstar软件包分析，获取所需预期目标结果。

2　结果
目标片段扩增结果如图1。

两个扩增的亮带与预期片段长度相近，分别为360、400 bp。

通过在线BLAST，检索到6条包含ND1与ND4基因片段的注册序列：AM411108.1、A M412316.1、E U730761.1、F J664617.1、KC902750.1和KC200247.1。

其中AM411108.1和AM412316.1分别是中国广东和马来西亚分离的犬弓首蛔虫序列，EU730761.1和KC902750.1
M. DL 2 000 bp DNA Marker。

图1　两个目标基因片段扩增结果
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是来自澳大利亚的犬弓首蛔虫序列，KC 902750.1和KC 200247.1分别是日本的犬弓首蛔虫序列和伊朗的猫弓首蛔虫序列。

用DNAstar 软件包中的MegAlian 比对全部7条序列。

ND1和ND4基因片段的序列多重比对分别见图2和图3。

序列分析发现，ND1基因片段与AM 411108.1序列的同源性最高，为99.5%；与日本株的同源性最低，为82.6%，甚至低于伊朗的猫弓首蛔虫株（88%）。

进化关系上，ND1基因与广东株处于进化树的同一分支上。

而ND4基因仅与广东犬弓首蛔虫分离株高度同源（99.5%），与其他序列的同源性都很低。

两个基因的进化树分析结果（图4、图5）分别与序列同源性分析结果基本一致。

3　讨论
犬弓首蛔虫西宁株来自市区宠物交易市场的宠物犬粪便。

本研究着重在已有鉴定工作基础上，确认该虫体与国外报道的虫体间的遗传进化关系。

同时，本研究证实，此次分离的犬弓首蛔虫西宁株属于我国大陆流行的遗传分支，并非独立株。

本研究发现，ND1基因与犬弓首蛔虫广东株（AM 411108.1）的序列同源性最高，ND1基因序列与伊朗的猫弓首蛔虫序列同源性达到88%。

依据宋美冉等
[11]
对ND1和ND4的分析，这两个
基因进化较快，种内差异小，但种间差异不易确定，可能出现差异小的情况。

在ND4基因的比对分析中，同样是与AM 411108.1的同源性最高（99.5%），有点特殊的是，与其他4条序列的同源性极低。

本研究中，ND1和ND4的差异较突出，但还是在保证物种分类正确的基础上出现的，本研究无法评价其概率。

在进化关系上，距离最远的是澳大利亚株（KC 902750.1）。

而AM 412316.1和KC 200247.1是同属的不同种，各自处于较近的独立分支。

在进化关系上，物种分类和地域都可以影响到它们的亲缘关系。

图2　ND1基因的序列多重比对结果
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传统上的弓首蛔虫研究主要集中在虫体的形态描述、生活史以及流行病学调查、诊断和综合防治等，但这些都有很大的局限性，如对幼虫或虫卵就不能确定其种类。

但随着分子生物学技术在寄生虫分类上的应用，可以看到，其对宿主的专一性并不是那么严格
[13]。

本研究的犬弓首蛔虫是寄生于
多种脊椎动物小肠内的大型线虫，其中很多种类可感染人。

人兽共同感染后，会呈现出发育不良、消瘦、贫血及腹泻等症状。

而人是犬弓首蛔虫的非专性宿主，故在肠中不发育为成虫，从而在非特异宿主体内会引起幼虫移行症，严重者可造成死亡。

如今，越来越多的家庭饲养犬类宠物，因而加剧了人兽共患犬弓首蛔虫病的流行态势。

因此在今后的防
图4　ND1基因片段以邻近法绘制的进化树
图5　ND4基因片段以邻近法绘制的进化树
图3　ND4基因序列多重比对结果
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治过程中，对犬只的药物驱虫是必不可少的。

在最新调查研究中发现，复方非班太尔片对犬弓首蛔虫具有较好的驱除效果[14]。

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