突变体质粒构建—PCR法-2012

实验题目：突变体质粒构建——PCR 法
背景与原理：
蛋白与蛋白间，蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一，而体外突变技术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。

通过PCR 方法可向目的DNA 片段中引入任何所需的变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。

PCR 定点突变迅速、高效并且重复性
好，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

其基本原理可简述如下图：
产物I
产物II
第一轮PCR
第二轮PCR
退火
延伸
8个循环后加入引物1/引物4
本实验拟在某基因编码区（CDS）内，通过PCR定点突变引入一个EcoRI酶切位点。

该基因片段长724bp，上下游分别以XhoI和BamHI两个酶切位点插入真核表达载
体pcDNA3.1，即pcDNA3.1-CDS。

此基因内部含有一个EcoRI酶切位点，我们通过PCR法诱变又形成一个EcoRI酶切位点，可以通过EcoRI单酶切验证突变是否成功。

具体设计如
下：
仪器、试剂及药品配方：
1.
仪器：PCR仪，电泳槽，水浴锅，凝胶成像仪，离心机，振荡培养箱，温箱，超净工作台，冰箱
2.
试剂及配方：
2.1
试剂：DNA回收试剂盒，限制性内切酶（BamHI，EcoRI，XhoI），T4连接酶，DNA 电泳marker
2.2
PCR反应体系：
primex12.5 ¼l
模板1 ¼l
上游引物（2 ¼M）2 ¼l
下游引物（2 ¼M）2 ¼l
水7.5 ¼l
2.3
primex配制：本次实验使用的是商品化的rTaq premix,无需自己配制
primex
Taq酶0.125 ¼l
10×Taq酶buffer 2.5 ¼l
dNTP（2.5 ¼M）2 ¼l
水7.875 ¼l
2.4
DNA电泳buffer（TAE）：
工作液（1×）储存液（50×）
40mM Tris-乙酸242g Tris/57.1ml冰乙酸
1 mM EDTA100ml 0.5M EDTA（pH8.0）
2.5
LB液体培养基（1000ml）
蛋白胨10g
酵母抽提物5g
NaCl5g
2.6
LB固体培养基（100ml）
蛋白胨1g
酵母抽提物0.5g
NaCl0.5g
琼脂粉1g
3.
实验方法：
3.1
PCR制备突变体片段：
3.1.1第一轮PCR反应体系：
反应条件：
94℃1min
94℃30S30循环
55℃45min
72℃30S
72℃5min
3.1.2 第二轮PCR反应体系：(50 ¼l 体系)
primex 25 ¼l
产物I 2～3 ¼l
产物II 2～3 ¼l
引物1（2 ¼M） 2 ¼l
引物4（2 ¼M） 2 ¼l
水补足至50 ¼l 注：引物1/引物4在PCR反应进行8个循环后加入。

反应条件：
94℃1min
94℃30S 35循环（第8个循环后暂停加入引物）
55℃1min
72℃50S
72℃5min
凝胶回收：
3.2
配制琼脂糖凝胶；
a.
DNA琼脂糖凝胶电泳；
b.
紫外灯下截取相应的DNA片段凝胶，置于1.5ml dorf 管内；
c.
每管加入500 ¼l 溶液A，55℃水浴融化10min，其间可振荡助融2-3次；
d.
融化后，每管加入15 ¼l 溶液B，混匀，加入离心柱；
e.
离心12000rpm，30s；
f.
弃下管液，每管加入500 ¼l 溶液C，离心12000rpm，30s；
g.
重复步骤g（弃下管液，每管加入500 ¼l 溶液C，离心12000rpm，30s）
h.
弃下管液，离心12000rpm，30s；
i.
将离心柱置于新的dorf管中，室温敞开离心管盖2-3min，每管加入25 ¼l 溶液D，室温放j.
置2min；
离心12000rpm，1min。

k.
酶切体系：
3.3
3.3.1构建质粒酶切体系：
3.3.2酶切验证体系：
3.4 连接体系：
载体（100ng）¼l
片段（68ng）¼l
T4连接酶 0.5 ¼l
10×buffer1 ¼l
水补足至10 ¼l
制备感受态：
3.5
取培养的菌液1ml转至100ml LB液体培养基，菌体振荡培养至OD600＝0.35（可凭经a.
验）；
将100ml菌液转至两个冰预冷的灭过菌的50ml离心管内，冰浴10ml；
b.
离心，4℃ 4000rpm，10min；
c.
弃上清，每管加入10ml 冰预冷的灭过菌的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀；
d.
离心，4℃ 4000rpm，10min；
e.
f.
弃上清，每管加入2ml 冰预冷的灭过菌的0.1mol/L CaCl2，重悬沉淀，再分别加入2ml灭过菌的40％甘油，混合均匀；
按每管150 ¼l分装，-80℃贮存备用。

g.
3.6
转化：
超净工作台内，将连接体质粒加入感受态细胞，冰浴30min；
a.
b.
热击，42℃，90秒；
c.
冰浴1～2min；
超净工作台内，加入800 ¼l LB液体培养基，振荡预培养50min；
d.
e.
离心，8000 rpm，1.5min，弃上清，余100 ¼l左右，吹散沉淀；
f.
涂布LB固体培养基平板，37℃正置培养1h；
翻转平板倒置培养过夜。

g.
3.7
小提质粒：
a.
离心收集菌体，12000rpm，30S；
b.
弃上清，150 ¼l 溶液I（25mM Tris-Cl，10mM EDTA）重悬菌体；
c.
加入150 ¼l 溶液II（2％SDS：0.4M NaOH ＝ 1：1）轻混；注：溶液II现用现配。

d.
加入150 ¼l 溶液III轻混；
乙酸钾（5M）60ml
冰乙酸11.5ml
水28.5ml
离心，12000rpm，5min；
e.
f.
收集上清至新管，加入等体积酚：氯仿（1：1），振荡；
离心，12000rpm，5min；
g.
h.
移上清至新管，二倍体积无水乙醇沉淀20min；
i.
离心，12000rpm，10min；
j.
弃上清，室温干燥，20 ¼l TER溶解；
k.
电泳验证。

日程安排：
6. 3. 5.
2000bp→
1000bp→
750bp→
500bp→
250bp→
100bp→
←446bp 图
2000bp→
1000bp→
750bp→
500bp→
250bp→
100bp→
←314bp 图2
2000bp →1000bp →750bp →500bp →250bp →100bp →
←446bp
图3
2000bp →1000bp →750bp →
500bp →250bp →100bp →
←314bp
图4：产物II 电泳回收←
736bp
2000bp →1000bp →750bp →500bp →250bp →100bp →
图5
2000bp →1000bp →750bp →500bp →250bp →100bp →
←736bp
图6：全长突变片段电泳回收6623bp →
4254bp →
5427bp
图7：载体酶切电泳
2000bp →1000bp →750bp →500bp →250bp →100bp →
←736bp
图8
：片段醇沉回收
6623bp →4254bp →
←5427bp
图9：载体酶切电泳回收2000bp →1000bp →750bp →500bp →250bp →100bp →
←5427bp
←736bp
图10：BamHI/XhoI 双酶切验证
2000bp →1000bp →750bp →500bp →250bp →100bp →
←245bp
←5918bp
图11：EcoRI 单酶切阳性结果
2000bp →1000bp →750bp →500bp →250bp →100bp →
←6163bp
图12：EcoRI 单酶切阴性结果
注意事项与建议：
实验准备工作一定要提前做好。

1.每一步实验都需要电泳验证，得到阳性结果以后才可以进行下一步实验。

2.具体实验步骤，如酶切时间，醇沉时间等可以灵活掌握。

3.思考题：
PCR 原理；
1.限制性内切酶原理及双酶切buffer 选择问题；
2.转化原理。

3.参考文献：
分子克隆实验指南 (第三版) 〔美〕J．萨姆布鲁克 D．W．拉塞尔著黄培堂等译北京科学出版社 2002.8。