TNFAIP8在子痫前期胎盘组织中的甲基化情况及表达

福建医科大学学报
J Fujian Med Univ
2020August,Vol.54No.4255 TNFAIP8在子痫前期胎盘组织中的甲基化情况及表达
林靓，柳之彦，林容，阮舆鑫，董洁琼，郑晶
摘要：目的探讨子痫前期胎盘组织中TNFAIP8甲基化情况及其在胎盘和外周血的表达水平。

方法
应用Illumina Human450K甲基化芯片检测早发型组(EOPE组)、晚发型组(LOPE组)及对照组胎盘组织，焦磷酸
测序验证TNFAIP8甲基化差别情况。

采用RT-PCR检测TNFAIP8-mRNA,Western-blot检测TNFAIP8蛋白，
进一步验证其在胎盘和外周血中的表达。

结果与对照组比较，甲基化芯片检测和焦磷酸测序验证检测结果均
提示LOPE组及EOPE组TNFAIP8甲基化水平均明显降低，差别有统计学意义(P<0.05)；而LOPE组与对照组
比较，差别无统计学意义(P>0.05)03组胎盘组织及外周血的TNFAIP8-mRNA及蛋白表达差别均有统计学意
义(PC0.05)。

结论TNFAIP8基因在EOPE胎盘组织中明显低甲基化。

子痫前期胎盘及外周血中TNFAIP8-mRNA及蛋白显著过表达，可能参与子痫前期发病机制。

关键词：先兆子痫；甲基化；肿瘤坏死因子类；基因
中图分类号：R714.24；R714.244；R977.6文献标志码：A文章编号：1672-4194(2020)04-0255-05
子痫前期(preeclampsia,PE)是一种妊娠期特发的可能导致多器官多系统损害的高血压疾病，发病机制与早期胎盘形成缺陷有关。

DNA甲基化是一种相对稳定的表观遗传修饰，为解释胎盘基因的异常表达以及相关信号通路的变化机制提供了良好的切入点。

肿瘤坏死因子诱导蛋白8(tumor necro­sis factor a-inducing protein8,TNFAIP8)是一种参与调节细胞增殖和分化的蛋白，在维持细胞稳态和调控自身免疫方面起着重要作用。

本研究拟通过人类全基因组芯片筛选胎盘组织候选基因，探讨PE 发病机制的表观遗传背景，为子痫的防治和管理提供理论基础。

1对象与方法
1.1对象选取2016年3月一2017年8月在笔者医院产科分娩的46例孕妇，其中早发型PE组(early-onset preeclampsia,EOPE)16例，晚发型PE 组date-onset preeclampsia,LOPE)12例，正常足月分娩孕妇组(normal pregnancy,NP)18例。

PE诊断参考《妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)》的诊断标准,在妊娠34周前因PE终止妊娠者为PE。

排除标准：(1)妊娠合并症及并发症：妊娠合并慢性高血压病、糖尿病、肾病、免疫系统疾病、内分泌疾病及肿瘤等；(2)辅助生殖技术受孕；(3)畸胎或死胎；
收稿日期：2019-07-16
基金项目：福建省卫生计生科研人才培养项目(中青年骨干人才培养项目，2018-ZQN-22”福建省'立医院"创双高”火石基
金项目(2020HSJJ19);国家自然科学基金青年基金项目
(81800363)
作者单位：福建医科大学省立临床医学院，福建省立医院妇产科，福州350001
作者简介：林靓，女，主任医师，医学博士.Email：kitty342@163.
com (4)多胎妊娠($2胎)；(5)嗜酒、吸毒及滥用药物者。

本研究经笔者医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2方法
1.2.1外周血及胎盘组织采集入院后抽取肘静脉血液2管各3mL,置于EDTA抗凝管中。

胎盘娩出15min内从4个不同胎盘小叶取材，用无菌PBS缓冲液反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色，将组织剪碎至1mn?,置于冻存管液氮预处理，送-80°C冰箱保存。

1.2.2DNA及RNA抽提采用DNA提取试剂盒(批号：No.59124,德国Qiagen公司)抽提样本DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度($2M g)o 采用RNA提取试剂盒(Cat#CW0581,中国CWbio 公司)提取样本总RNA。

1.2.3Illumina Human450K甲基化芯片检测
从EOPE组、LOPE组、NP组中选取年龄及孕周相匹配的胎盘各3例，均为单胎自然受孕，孕次1〜2次,产次0〜1次，进行甲基化芯片检测。

1.2.3.1实验步骤对提取的胎盘组织DNA进行亚硫酸氢盐处理，针对每个甲基化位点同时设计两种探针,进行芯片杂交、洗脱、延伸、成像，并对探针杂交及亚硫酸氢盐转化效率进行质控。

1.2.3.2数据分析采用Illumina公司的Ge­nome Studio软件进行原始数据处理分析，包括差别性分析、DeltaBeta筛选及Diffscore筛选。

以下为各衡量指标的计算公式：
(1)0值是衡量该位点甲基化程度的指标，该值区间(0,1),越接近于1该位点甲基化程度越高，越接近于0该位点甲基化程度越低。

Illumina 甲基化
256福建医科大学学报2020年8月第54卷第4期
平台的计算公式为：
___________Max(Signal B,0)___________
"Max(Signal A,0)+Max(Signal B,0)+100
(2)M代表每个探针在IP DNA和input DNA
中的相对富集程度，计算公式为：
M=lg B
1.2.4焦磷酸测序验证根据候选基因位点序列
信息，采用PyroMark Assay Design2.0设计引物
序列(表1)。

每个样本各取1〜2M g DNA,用
EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit甲基化转化试剂盒
进行转化，以转化后的DNA样本做模板进行PCR
检测。

取15〜20m L PCR产物上PyroMark Q24
实时定量焦磷酸系列分析仪,PyroQ-CpG软件分析
该位点甲基化状态。

Tab1Primer name and sequence for pyrosequencing
表1焦磷酸测序引物名称及序列
引物名称弓1物序列(5'~3‘)
TNFAIP8-Fw TNFAIP8-Rv-B TNFAIP83-S GGGGAGGTTTTGATTTIAGTGGTT ATCC1ACCTTCCTIAAATTCTTCIACTT GGTIAGTIAGAGTAIArGTGAG
TNFAIP8：肿瘤坏死因子诱导蛋白&
1.2.5RT-PCR检测TNFAIP8-mRNA取5“L RNA,用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测RNA的完整性。

采用DNase I试剂盒(Cat#CW2090,中国CWbio公司)对RNA中残留的DNA进行消化处理，用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒(Cat 井CW0744,中国CWbio公司)进行反转录，上ABI 7500型荧光定量PCR仪检测，用2~AACT法进行数据相对定量分析。

表2RT-PCR引物名称及序列
TNFAIP8：肿瘤坏死因子诱导蛋白&
Tab2Primer name and sequence for RT-PCR 引物名称弓1物序列(5J3‘)
TNFAIP8-F GTTCATCAGCTTGCTArGAC
TNFAIP8-R ATGTGACTTGGCAGTGAGGT
Actin-F ACTIAGTTGCGTIACACrCTT
Actin-R GTCACCTTCACCGTTCCA
1.2.6Western-blot检测TNFAIP8蛋白制备SD&PAGE胶，提取胎盘及血液蛋白，进行蛋白样品变性电泳及凝胶转膜，测定蛋白浓度，采用Image J软件分析灰度值。

1.3统计学处理采用SPSS25.0软件分析数据。

计量资料采用丘士s表示,3组间比较符合正态分布采用On&Way ANOVA单因素方差分析，两组间比较采用Turkey HSD检验。

P<0.05为差别具有统计学意义。

2结果
2.1临床资料比较3组患者的年龄、妊娠和分娩次数、孕早期BMI比较，差别无统计学意义(P>0.05)；与NP组比较,EOPE组及LOPE组的平均动脉压和24h尿蛋白定量升高，分娩孕龄和胎儿出生体质量降低，差别有统计学意义(PV0.05)。

表3临床资料比较
Ikb3Clinical characteristics of patients
临床特征EOPE组LOPE组NP组
n161218
产妇年龄/岁30.69±5.3127.33±7.112&39±4.41
妊娠次数/次 2.56士1.21 1.92±1.16 1.78±1.00
分娩次数/次 1.63±0.72 1.17±0.39 1.39±0.50
早孕期BMI/(kg・m—2)22.32±3.7821.77±2.9421.57±3.81
分娩孕龄/周33.74+2.08a37.68±1.5239.41±0.66
MAP/mmHg125.25+14.70A119.92±16.2986.91±6.78
°24h尿蛋白/@*L_l) 5.84+4.63a 3.58±4.76—
加新生儿出生/g1605.00士470.50A2512.50±389.31327&33±241.33 EOPE：早发型子痫前期;LOPE：晩发型子痫前期;NP：正常妊娠;EMI：体质量指数;MAP：平均动脉压.与LOPE组和NP组比较,△:PV0.05.
2.2胎盘组织整体及TNFAIP8位点的甲基化芯片检测结果胎盘组织TNFAIP8位点探针主要分布在5，UTR区，甲基化芯片共检测485577个位点。

EOPE组、LOPE组和对照组的胎盘整体平均甲基化程度分别为0.47,0.46,0.46。

3组的TNFAIP8甲基化程度和富集程度比较，差别有统计学意义(F= 6.992,P=0.027；F= 6.985, P=0.027)。

与LOPE组、NP组比较,EOPE组的
林靓，等:TNFAIP8在子痫前期胎盘组织中的甲基化情况及表达257
甲基化程度和富集程度显著降低，差别有统计学意义(PV0.05)；而LOPE组与NP组比较，差别无统计学意义(P>0.05,表4)。

表43组胎盘芯片TNFAIP8甲基化水平差别
Tab4Difference of TNFAIP8methylation among the three groups by beadchip analysis
分组甲基化程度富集程度
EOPE组0.14±0.04A-2.31±0.42A
LOPE组0.28±0.05—1.09+0.42
NP组0.29±0.07—1.14±0.51表中数据为王士EOPE：早发型子痫前期；LOPE：晚发型子痫前期;NP：正常妊娠.与LOPE组及NP组比较，△:PV0.05. 2.3焦磷酸测序验证TNFAIP8位点甲基化水平2.3.1焦磷酸测序峰图设计TNFAIP8的甲基化测序序列为YGGTAATYGTTTTTGTAGTT-GGTTAT。

测序峰图中蓝色矩形阴影上方对应的黄色方块提示检测效果稳定，所标数值是以百分率表示的该位点甲基化程度(图1)。

WeU:G8
Assay:BC14085-420423
Sample ID:52
Note:
Analysis version:2.5.8
Position12
Quality Check Check
Meth(%)1210
图1TNFAIP8的焦磷酸测序峰图
Fig1Spectrum o£TNFAIP8pyrosequencing
2.3.23组的TNFAIP8甲基化程度及差别3组TNFAIP8基因的两个位点平均甲基化程度见表50 3组的位点1甲基化程度比较，差别有统计学意义(F=6.361,P=0.004)；而位点2甲基化程度比较，差别无统计学意义(F=2.984,P=0.061)。

EOPE 组中出现多例TNFAIP8未甲基化，即甲基化程度为0。

位点1中EOPE组4例(25%)未甲基化，LOPE组和NP组无此现象；位点2中EOPE组5例(31.25%)未甲基化,LOPE组1例(8.33%), NP组1例(5.56%)。

与NP组比较,EOPE组及LOPE组位点1甲基化程度显著降低，差别有统计学意义(PV0.05)；而LOPE组和NP组比较，差别无统计学意义(P>0.05)。

表53组间TNFAIP8焦磷酸测序甲基化水平差别Tab5Difference o£TNFAIP8methylation among the three groups by pyrosequencin
分组Positionl Position?
EOPE组9.49+7.08A7.25±6.23
LOPE组15.14士3.7110.41±4.12
NP组15.16±3.6611.18±3.82表中数据为丕土s.EOPE：早发型子痫前期;LOPE：晚发型子痫前期；NP：正常妊娠.与LOPE组及NP组比较,△:PV0.05. 2.4RT-PCR及Western-blot检测胎盘及外周血TNFAIP8蛋白表达3组胎盘组织的TNFAIP8-mRNA相对定量和蛋白表达比较，差别均有统计学意义(F=243.252,P=0.000；F=3&594, P=0.000)。

外周血TNFAIP8-mRNA相对定量和蛋白表达比较，差别均有统计学意义(F=405.209, P=0.000；F=143.199,P= 0.000,表6)o组间采用Turkey HSD检验比较，差别有统计学意义(PV0.05)。

胎盘和外周血TNFAIP8蛋白电泳图呈现按照EOPE—LOPE—NP顺序表达逐渐下降的趋势(图2)。

表63组胎盘和外周血TNFAIP8表达及差别
Tab6Difference o£TNFAIP8expression in placenta and blood among the three groups
分组
胎盘组织外周血液
mRNA Protein mRNA Protein EOPE组 1.41±0.04A 1.38±0.05A 1.54±0.05A 1.31±0.07A LOPE组 1.25±0,03* 1.22+0.11# 1.26±O.02# 1.01±0.06* NP组 1.06+0.06 1.03+0.14 1.05±0.060.74+0.13表中数据为王士“TNFAIP8：肿瘤坏死因子诱导蛋白& EOPE：早发型子痫前期；LOPE：晚发型子痫前期；NP：正常妊娠.
与LOPE组和NP组比较，△:P<0.05.与NP组比较，井：P<0.05.胎盘组织TNFAIP8
外周血TNFAIP8
EOPE LOPE NP
Actin
EOPE LOPE NP
Actin
TNFAIP8：肿瘤坏死因子诱导蛋白8；EOPE：早发型子痫前期；LOPE：晚发型子痫前期；NP：正常妊娠.
图2胎盘组织和外周血TNFAIP8电泳条带
Fig2Electrophoretic bands of TNFAIP8in the placen­ta and peripheral blood
3讨论
PE是一种妊娠期特有的母亲一胎儿一胎盘疾病，各种发病机制通路之间复杂的相互作用很大程
258福建医科大学学报2020年8月第54卷第4期
度上阻碍了有效干预靶点的探寻。

胎盘在以母体全身性炎症、内皮损伤、高血压和蛋白尿为特征的终末通路中起着关键作用新近研究不断揭示表观遗传机制在PE发生发展中的作用,特别是DNA甲基化成为胎盘源性疾病研究的焦点所在。

甲基化介导的转录失调基序(methylation-mediated transcrip­tional dysregulation motifs,methTDMs)可能参与PE的发病机制図，因此，建立DNA甲基化与PE之间的关联将为探索PE的临床监测指标和药物靶点提供科学依据。

本研究通过人类全基因组Illumina Human 450K甲基化芯片筛选异常甲基化候选基因并用焦磷酸测序验证。

虽然3组胎盘总体甲基化程度相近,但是本课题组前期研究显示，特定基因的甲基化程度却各有显著性差别，并涉及免疫及生长发育的多条途径⑷。

同源盒基因在人类胎盘中广泛表达，调控胚胎和胎盘发育，而且大多数同源盒基因在整个妊娠过程中都是低甲基化的⑷。

本研究结果与此相似,PE尤其是EOPE胎盘组织中TNFAIP8基因显著低甲基化甚至未甲基化。

约70%的CpG岛位于人类基因启动子的5,端区域，大多数CpG岛未甲基化，而未甲基化则代表基因具有潜在活性固。

PE可分为EOPE和LOPE两种亚型。

EOPE主要与胎盘重塑、胎盘功能障碍有关;LOPE主要与代谢紊乱、肥胖、糖尿病、脂代谢紊乱和炎症影响内皮功能有关旧。

本研究TNFAIP8的甲基化焦磷酸测序验证结果也显示，相对于LOPE和NP组,EOPE组胎盘的甲基化程度显著降低；但是LOPE和NP组却未显示出差别，这可能与两种亚型发病机制存在不同有关。

既往认为两者是同一种疾病的两种阶段，但是现在更多的研究结论倾向于两者是机制截然不同的两种疾病。

1997年，Patel等在人类头颈鳞状细胞癌株上首先发现并鉴定出TNFAIP8蛋白⑺，也称为SCC-S2.GG2-1和NDED,它是一种和细胞凋亡密切相关的免疫调节蛋白。

TNFAIP8包含一个假定的死亡效应域，可影响各种类型细胞的凋亡和自噬TNFAIP8的表达与前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌等多种癌症的发病机制密切相关凹，且影响化疗耐药性及生存预后〔如。

在胎盘形成早期，滋养细胞的行为极其类似于肿瘤细胞，具有形成血管、迁移、侵袭等功能。

有研究显示，降低肿瘤细胞TNFAIP8的表达，将降低血管内皮生长因子受体VEGFR-2,基质金属蛋白酶MMP-1及MMP-9的表达口口。

若用小干扰RNA沉默成纤维细胞上TNFAIP8的表达，MMP-1产生水平也明显降低垃。

既往研究已证实，系列MMPs分子与PE发病相关,MMP-3与EOPE有关，而与LOPE无关；升高的MMP-2和MMP-13及降低的MMP-9均与早发及晚发型重度PE有关购。

本研究中，PE尤其是EOPE胎盘组织中TNFAIP8-mRNA和蛋白的过表达导致系列MMPs分子异常表达，影响母胎界面血管床重塑障碍出现胎盘形成缺陷。

另外,PE孕妇外周血管过表达MMPs受体,MMP可通过该受体发挥强大的收缩血管功能，准确模拟PE全身外周血管痉挛的病理特征;而MMPs介导的胶原蛋白不平衡性刺激溶胶原活性，也会造成血管壁通透性增加引起PE特有的症状水肿和蛋白尿网。

因此,TNFAIP8作为MMPs分子导致PE发病的上游原因之一，可作为深入探索发病机制以及纠正血管和胶原蛋白功能的切入点，改善PE预后。

本研究还发现，与NP组比较,EOPE组和LOPE组的外周血中TNFAIP8蛋白表达差别也很显著。

Xiang等发现，正常孕妇外周血中TNFAIP8家族成员TIMP-3完全甲基化，而发生PE时胎盘中TIMP-3则明显低甲基化或未甲基化匚旧，由此，检测母血中由胎盘释放的异常甲基化TIPM-3浓度有望实现早期诊断和预测PE。

本研究也证实了外周血TNFAIP8的表达水平能切实反映胎盘的病理性甲基化情况，后续研究将探讨不同孕周孕妇外周血中TNFAIP8的甲基化情况，进一步验证TN-FAIP8作为诊断和预测的外周血生物学指标的可行性。

PE是妊娠期特有的严重影响母婴预后的疾病之一,TNFAIP8在胎盘中的表达以及和PE是否存在关联，目前研究还很有限。

本课题组在后续已完成的胎盘组织miRNA测序研究中也发现了TNFAIP8的上游微调控开关，后续将把TNFAIP8作为关键蛋白，推测异常转录翻译的信号通路，探索上游和下游的调控机制，丰富PE的发病理论，并验证其作为预测指标的可行性，这对于完善PE的分子生物学机制具有重要的理论意义和潜在的应用价值。

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DNA Methylation Profile and Expression of Tumor Necrosis Factor
Alpha Induced Protein8(TNFAIP8)in Preeclampsia Placenta
LIN Liang,LIU Zhiyan,LIN Rong,RUAN Yuxin,DONG Jieqiong,ZHENG Jing
Department of Gynecology and Obstetrics)Provincial Clinic College of Fujian Medical University,
Fujian Provincial Hospital,Fuzhou350001,China
ABSTRACT:Objective To explore the methylation profile and protein expression of TNFAIP8in both the preeclampsia placenta and peripheral blood・Methods The placental tissues of early-onset pre­eclampsia(EOPE),late-onset preeclampsia(LOPE)and normal pregnant group(NP)were tested by Illu­mina Human450K methylation beadchip.Differences in TNFAIP8methylation profile among three groups were verified by pyrosequencing.The expression levels of TNFAIP8mRNA and protein expres­sion were examined by RT-PCR and Western-blot analysis.Results Both the methylation beadchip anal­ysis and pyrosequencing showed that TNFAIP8hypomethylation in EOPE group was significantly different compared with LOPE group or NP group(PV0・05).However,there was no significant difference be­tween LOPE group and NP group(P>0.05).The three groups have statistically significant difference in TNFAIP8mRNA and protein expression(P<0.05).Conclusions Significant hypomethylation of TN-FAIP8occurs in placenta of early-onset preeclampsia・NFAIP8mRNA and protein overexpression are probably associated with preeclampsia pathogenesis・
KEY WORDS：pre-eclampsia；methylation；tumor necrosis-factors；genes
（编辑：张慧茹）。