美乳类产品中部分雌性激素的检测

美乳类产品中局部雌性激素的检测
一、雌激素——纸层析法
1 应用范围
本方法适用于化装品中雌激素的测定。

2 原理
雌二醇和雌酮在一定温度下与对苯二酚生成橙色化合物，其颜色强度与雌二醇和雌酮浓度相关，经过比色测定，求出化装品中雌激素的含量。

3 试剂
3．1 呈色液：经碘饱和的石油醚〔Petroleum ether〕溶液。

3．2 标准品：雌二醇〔Estradiol 17β〕标准品，雌酮〔Estrone〕标准品，溶于乙醇中备用。

3．3 对苯二酚〔又称氢醌，Hydroquinone，C6H4〔OH〕2〕溶液：称取2g对苯二酚溶于100ml65％〔V/V〕硫酸中，遮光贮存。

4 仪器
4．1 层析用滤纸：2×40cm。

4．2 分光光度计。

5 分析步骤
5．1 氧化铝〔Alumina〕滤纸的制备：滤纸2×40cm浸入经加温至60℃的20％硫酸铝铵〔AlNH4〔SO4〕2·12H2O〕溶液中30s，再置于贮有28％氨水、内部经氨饱和的密闭容器内，放置1h取
出，置流水中洗涤6h，于约20℃枯燥一夜备用。

5．2 样品预处理
称取1g样品置烧杯中，加10ml氯仿煮沸，加少量乙醇溶解杯壁上的水滴，冷却过滤，用10ml氯仿洗涤烧杯及滤纸，合并滤液和洗液，于水浴上馏去氯仿，加10～20ml异辛烷〔Isooctane〕溶解黄色油状之残留物，用70％〔V/V〕乙醇每次10ml，萃取4次。

萃取液加5ml异辛烷振摇，分取乙醇层，浓缩至约10ml，加20ml水继续浓缩，再反复一次，馏去乙醇，得浓缩液约10～15ml。

确定此水溶液呈酸性〔必要时加盐酸使呈酸性〕后，每次以10ml 苯，萃取4次。

萃取液加5ml水摇混后，分取苯萃取液，馏去苯，残留物溶于乙醇，作待测溶液。

5．3 测定
5．3．1 定性
取样品溶液一局部，必要时浓缩之，以相当于雌酮2～10μg之量点样于氧化铝〔Alumi－na〕滤纸距一端5cm处。

另以雌酮及雌二醇标准品2～10μg点样于同一氧化铝滤纸上作为对照。

将氧化铝滤纸用10％氢氧化钠饱和苯按上升法于20℃展开约5h。

风干后，用经碘饱和之石油醚溶液喷雾，如有雌酮或雌二醇存在，那么在与对照试验相当之位置显现斑点。

试验中R f值较大之斑点为雌酮。

5．3．2 定量
经定性试验确定，仅含雌酮或雌二醇二者之一时，可以用此法测定其含量。

取样品溶液及雌酮标准溶液或雌二醇标准溶液分别置试管中，馏去乙醇，每试管各加对苯二酚〔古伯溶液〕溶液2ml，于100℃加热30min后，水冷却，各加0．5ml水摇混，再于100℃加热5min后，水冷却，于波长515nm测定其吸光度，计算样品中雌酮或雌二醇之含量。

6 计算
式中：A t——样品的吸光度；
A S——雌酮或雌二醇标准品的吸光度；
S——比色所用标准品的量。

三、雌二醇和雌酮——高效液相色谱法
1 应用范围
本法适用于含有雌性激素的各类化装品。

测定范围0～75μg/ml，最低检出浓度，雌二醇为0．258μg/g，雌酮为0．234μg/g。

2 原理
氢氧化钠与化装品中的油脂进展皂化反响，用石油醚除去剩余的油脂和蜡等干扰物质。

雌二醇和雌酮游离溶解在氢氧化钠溶液中，被二氯甲烷萃取，通过高效液相色谱进一步别离并定量测定。

3 试剂
3．1 雌二醇、雌酮混合标准储藏溶液：准确称取雌二醇和雌酮
各10．000mg，用无水乙醇溶解并稀释至100ml，1ml含雌二醇、雌酮各100．0μg。

3．2 溶剂：乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、己烷、石油醚均为分析纯，无水乙醇为优级纯。

3．3 5％氢氧化钠溶液。

4 仪器
4．1 高效液相色谱仪：美国Waters分司810系列〔HPLC〕具510型泵，UOK进样器和490E紫外－可见光检测器。

4．2 PT系列处理小柱〔硅胶柱〕：津杨滤材厂〔XX省〕。

5 分析步骤
5．1 样品预处理称取1g样品于小烧杯中，加10ml5％氢氧化钠溶液，充分搅拌溶解后，倾入分液漏斗，用5ml5％氢氧化钠溶液洗烧杯一次，倾入分液漏斗。

加20ml石油醚〔1〕萃取1min，分层后将醚层倾入另一分液漏斗，反复萃取三次，合并醚层并加5ml5％氢氧化钠溶液洗醚层一次，弃醚层。

合并氢氧化钠层，加10ml二氯甲烷萃取1min，分层后放出二氯甲烷于蒸发皿中，萃取三次，合并二氯甲烷层并蒸发近干。

残渣用2ml无水乙醇溶解，必要时离心别离，此溶液为样品A。

氢氧化钠层用盐酸调pH值到5以下〔2〕，加10ml二氯甲烷萃取1min分层后，放出二氯甲烷于蒸发皿中，反复萃取三次，弃氢氧化钠层，合并二氯甲烷，蒸干。

残渣用2ml无水乙醇溶解，离
心别离，上清液为样品B。

合并A、B液，浓缩至2ml作为待测溶液。

当样品中干扰物质含量较高时，用硅胶色谱预处理小柱进展净化。

将待测溶液注入硅胶柱，吸附后先用10～20ml己烷＋乙酸乙酯〔95＋5〕将极性较弱的干扰物质洗脱下来，然后用15ml 己烷＋乙酸乙酯〔50＋50〕，将雌酮、雌二醇洗脱下来。

洗脱率为75～100％。

5．2 色谱条件
色谱柱：HP ODS200mm×4．6mm。

流动相：乙腈＋水〔36＋64〕。

流速：1．6ml/min。

检测器：Waters490E紫外可见光检测器。

检测波长：280nm。

5．3 定性
吸取雌酮、雌二醇标准溶液20μl注入HPLC，记录保存时间。

吸取待测溶液20μl注入HPLC，记录保存时间，和标准保存时间比拟进展定性。

5．4 定量
5．4．1标准曲线
取1.0、2.0、0.3、4.0、5.0ml雌酮、雌二醇标准贮备液于50ml 容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，分别取20μl注入色谱仪，绘制峰高—浓度标准曲线。

5．4．2 测定
取待测溶液20μl注入色谱仪，记录峰高，由标准曲线求出样品中雌酮、雌二醇的浓度A〔μg/ml〕。

6 计算
式中：c——雌酮、雌二醇的含量，μg/g；
A——由标准曲线查出的样品中雌酮、雌二醇的浓度，μg/ml；V——样品溶液总体积，ml；
m——样品质量，g。

8 精细度和准确度
单个实验室测定美乳类样品12件，参加不同浓度的雌二醇和雌酮标准溶液，充分混合后，按本法测定，回收率为80～100％。

当雌二醇和雌酮浓度各为10μg/g时，雌二醇标准偏差为0．43，雌酮为0．36，相对标准偏差分别为6．1％和5．2％〔n＝7〕。

注解：
〔1〕如果石油醚乳化，加少量丙酮，如果乳化严重，必须重称样品，加氯仿并加热溶解，过滤，挥发除去氯仿，残渣用2ml 乙醇溶解，加20ml5％氢氧化钠溶液转入分液漏斗，以下步骤同前。

〔2〕雌二醇具有羟基，呈弱酸性，当pH大于11的碱性溶液中，二氯甲烷萃取雌二醇回收率为40％以下，雌酮80％，因此在碱性条件下萃取后，将溶液pH调至酸性〔pH3～5〕再萃取雌二醇，
二次萃取总回收率为80～100％。