2014-APP-RLC-003-HPLC-CAD方法测定中药注射液中大分子物质

方法开发报告2014-APP-RLC-003
HPLC-CAD方法测定中药注射剂中大分子物质（LC-CAD）
一、 介绍
中药注射剂是在中医药制剂基础上发展起来的一种剂型，具有注射剂所共同的优点外，在一定程度保留了中医药的特色，在医疗实践中发挥了巨大的作用。

由于注射剂绕过皮肤、黏膜这两道保护人类的天然屏障和肝脏的首过作用，直接进入人体分布到组织、器官，生物利用度很高，如有过敏源之类异物极易进入，难于清除，危害较大，而中药本身组成较复杂，虽然在制药过程中进行了处理，但是中药注射剂的不良反应还是大量存在，尤其是近十年来，中药注射剂不良反应的报告呈几何级数增加，据统计，2012年药品不良反应发生共14万人次，中药占14%，中药注射剂又占其中的75%；并且SFDA于2006年6月1日发出《关于暂停使用和审批鱼腥草注射液等个注射剂的通告》。

在中药注射剂不良反应的
引发因素中，大分子化合物（蛋白质、淀粉、鞣质、树脂等）是重要热源物质，容易聚合成更大的分子或多分子团粒，通过静注和肌注的方式进入人体后，容易导致不良反应的发生。

目前，2010版药典采用蛋白沉淀法，方法比较简单，但结果稳定性差，灵敏度低，直接通过视觉的判断很难得到统一有效的结果；针对这些问题，有报道采用高效液相色谱和示差折光检测器对这些大分子化合物进行分析，大大提高了测定结果的稳定性和灵敏度，在此基础上，本实验结合实验室电喷雾检测器（Charged Aerosol Detector ）的优势，采用HPLC-CAD 方法测定中药注射剂中的大分子化合物，优化了HPLC-CAD 的各种分析条件，同时考察了方法的检测限、重现性等等，并以几种中药注射剂进行实际分析，确定其中的大分子化合物分布。

（2） 柱后乙腈的不同加入速度对右旋糖酐D2灵敏度的影响
不同甲酸铵浓度对灵敏度的影响
柱前加入乙腈对分离的影响
（5） 不同分子量右旋糖酐的色谱图
D3谱图（定量限
7） 吐温80谱图（3.045 m
（8） 重现性谱图（右旋糖酐D3重复进样9针）
不同量右旋糖酐的线性谱图
） 参麦注射剂谱图
） 香丹注射剂谱图
） 丹香注射剂谱图
（
） 醒脑静注射剂谱图
（1） 流动相中不同甲酸铵浓度的影响
Flow rate /mmol/L
Retention Time/min Peak Area/pA*min
百分比/% Peak high/pA 百分比/% 10 14.744 259.1579 --- 183.81 --- 25 14.758 252.5881 2.5 181.36 1.3 40
14.689
249.3317
3.8
178.92
2.6
百分比/%=（10mmol/L Peak Area （Peak high ）-40mmol/L Peak Area （Peak high ））/10mmol/L Peak Area （Peak high ）*100%
（2） 柱后加入乙腈对灵敏度的影响
Flow rate /ml/min Retention
Time/min
Peak
Area/pA*min
百分比/% Peak
high/pA
百分比/%
014.755 30.0905 --- 20.85 ---
0.1 14.552 233.9865 677 164.93 691
0.2 14.757 290.5406 865 207.97 897
0.3 14.626 267.5711 789 221.31 961
百分比/%=（Peak Area（Peak high）of High flow rate - Peak Area（Peak high）of low flow rate）/ Peak Area （Peak high）of low flow rate *100%
（3） 右旋糖酐D1-D8保留时间和分子量分布
右旋糖酐D1 D2 D3 D6 D7 D8
五、可行性建议
实验目的是测定中药注射液中大分子化合物，选择体积排阻的色谱柱MAbPac SEC-1（客户提供的色谱柱菲罗门冲洗一段时间后背景较高）对右旋糖酐D1、D2、D3、D6、D7和D8依据分子量的大小顺序出峰，如表3所示。

考察了不同流动相条件对CAD检测器测定右旋糖酐及吐温的响应值，包括流动相中盐浓度，柱前或者柱后加入乙腈对分离和响应值的影响等。

首先考察了
流动相中不同的甲酸铵浓度（10、25、40mmol/L甲酸铵）对响应值的影响，随着甲酸铵浓度的增加，右旋糖酐的响应值略有降低，25mmol/L甲酸铵时的峰面积比10mmol/L甲酸铵时的峰面积降低2.5%，40mmol/L甲酸铵时降低3.8%，因此在保证分离度和柱效的前提下，降低盐浓度有助于提高检测灵敏度；其次考察了柱后加入乙腈的影响，流经分析柱的流速为0.2 ml/min，比较了柱后不加乙腈，和加入不同流速的乙腈（0.1、0.2、0.3 ml/min）对灵敏度的影响，由表2可知，加入乙腈，能显著提高右旋糖酐的灵敏度，柱后加入0.1 ml/min的乙腈，峰面积增加677%，峰高增加691%，随着加入乙腈流速的增加，峰面积和峰高都有所提高，因此柱后加入乙腈，能够显著增加右旋糖酐的灵敏度，但是针对D8、D7和D6分子量较大的右旋糖酐，乙腈含量增加导致峰形显著变差，所以一般选择0.1-0.2ml/min的流速加入乙腈；同时考虑在柱前加入乙腈对分离和响应值的影响，由图4所示，柱前加入乙腈会导致糖的峰形变异，所以在该色谱柱条件下，不建议柱前加乙腈。

在优化了色谱条件的基础上，以右旋糖酐D3为标准品，考察了定量限、重现性和线性关系，当进样量为0.08 m g时，峰高为0.9 pA，信噪比（S/N）10（图6），因此定量限为0.08 m g，检出限为0.03 m g。

重复性实验时，重复进样D3样品9针，保留时间、峰面积和峰高的RSD分别为0.34%、0.69%和1.21%，满足色谱分析要求（＜2%）。

线性关系如表5所示，D3在0.36-72 m g范围内，线性相关系数为0.9991。

同时测定了吐温80样品，如图7所示。

图10-图15为不同中药注射剂样品的色谱分离图谱，参麦在吐温80和D1的位置有色谱峰；热毒宁、香丹和丹香在D1之前没有大分子物质，而在D1位置有较大的色谱峰，说明在注射液中有与D1分子量接近的物质存在；苦黄注射液在D6 和D1的位置也有相应的色谱峰，说明注射液中有分子量接近D6和D1的物质；醒脑静注射液在吐温80和D1的位置有相应的色谱峰。

因为本实验是基于体积排阻色谱的原理，因此能够说明注射液中有分子量接近的大分子物质存在，具体是什么物质（聚糖、蛋白、树脂等等）还需要进一步确认。