人参HMGR基因的克隆与序列分析_郜玉钢

人参HMGR 基因的克隆与序列分析
郜玉钢,杨　鹤,于　英,臧　埔,李王番瑛,刘　霞
,张连学
＊＊
吉林农业大学中药材学院,长春130118
摘　要:以人参根RNA 为模板,根据其他植物HMG R 基因序列保守区设计特异性简并引物,进行RT -PCR 扩增。

纯化回收HMG R 基因RT -PCR 产物与pMD18-T 载体连接,再转化到JM109大肠杆菌中进行克隆,对阳性克隆菌重组质粒进行测序和序列分析。

结果表明:人参H MGR 核心片段的大小为458bp ,与其他植物核苷酸序列有较高的同源性,依次为杜仲86.1%、南京椴83.8%、长春花83.2%、马铃薯82.5%、苹果82.1%、景烈白兰81.6%、肾叶橐吾81.6%、南苍术81.0%、红豆杉80.4%、水稻80.3%。

关键词:人参;生物合成;H MGR ;克隆
中图分类号:Q785;R284.1 文献标识码:A 文章编号:1000-5684(2010)05-0500-05
Cloning and Sequence Analysis of HMGR Gene in Ginseng
G AO Yu -gang ,YAN G He ,YU Ying ,ZAN G Pu ,LI Fan -ying ,LIU Xi a ,ZHANG Lian -xue College of Chinese Medicinal Mate rials ,Jilin Agricultural University ,Changchun 130118,China Abstract :Using R NA from ginseng roots as templates ,designing specific degenerate primers based on conserved H MGR gene from various plants ,RT -PCR was performed .The pr oducts of RT -PCR were recovered ,purified and cloned into pMD18-T vector ,then transfor med into competent Esche richia c oli
JM109.Inserts included in the plasmid were sequenced and analyzed .The results showed that the gene of HMGR was 458bp ,the nucleotide sequence showed high homology with other plants .The identities of nucleotide sequences were Cortex Euc ommiae 86.1%,Tilia miqueliana Maxim 83.8%,Catharanthus roseus (L .)Don 83.2%,Solanum tube rosum 82.5%,Malus pumila Mill 82.1%,Michelia chapensls 81.6%,Ligularia hodgsoni Hook .var .sutc huenensis (Franch .)Henry 81.6%,Rhizoma A tractylodis 81.0%,Taxaceae 80.4%,O ryza sativa 80.3%.Key words :Panax ginseng ;biosynthesis ;HMGR ;cloning 人参皂苷是五加科人参属(Panax )植物的主要活性物质,也是植物萜类次生代谢的重要产物,为异戊二烯单位构成的四环三萜达玛烷类化合物,属于萜类化合物中的三萜苷类,由三萜苷元和糖、糖醛酸以及其他有机酸组成[1-3]。

人参皂苷在人参类植物体内含量较低,一些单体含量甚微,成为其开发利用的制约性因素。

目前,人参皂苷化合物人工合成异常困难,尚未实现全化学合成,无
论总皂苷还是单体皂苷均从人参等植物中提取。

生物技术和基因调控手段有望成为生产这些低含量次生代谢产物的有效手段。

可以利用一些诱导物来提高人参皂苷生物合成途径中的限速步骤相关酶(即关键酶)的表达量和活性,也可利用一些抑制剂来降低分支途径关键酶的表达量和活性,以提高有用皂苷类化合物的生物合成水平。

因此,从关键酶的基因水平上对生物合成进行人工
通讯作者
基金项目:国家自然科学基金项目(30570185),国家科技支撑计划项目(2007BAI38B01),中国博士后科学基金项目(20090461042)
作者简介:郜玉钢,男,博士,副教授,研究方向:生药学。

收稿日期:2010-07-10 修回日期:2010-08-20
吉林农业大学学报　2010,32(5):500～504http ://xue bao .jlau .edu .cn Journal of Jilin A gricultural University E -mail :jlndxb @vip .sina .com
调控才是最根本的方法。

在萜类生物合成方面国内外均做了大量有价值的工作。

甲羟戊酸途径是公认的皂苷三萜苷元合成的必由途径,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)是萜类化合物合成过程中最先起作用的关键酶[4-10]。

但HMGR是人参皂苷生物合成的关键性酶尚缺乏有力的直接证据,其基因也未见报道。

因此本试验进行了H MGR基因的克隆与序列分析,其结果对于在分子水平上实现人参皂苷生物合成的定向调节具有重要意义,对进一步揭示资源植物中萜类次生代谢产物生物合成机理、促进相关资源为人类健康服务亦具有参考价值。

1　材料与方法
1.1　材料
AMV逆转录酶、dNTPs、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、Ex Taq、Marker DL2000、pMD18-T载体、T4DNA Ligase酶、Bam HⅠ和Hin dⅢ酶、琼脂糖均为Promega公司产品,H MGR基因特异性引物由大连宝生物技术公司合成。

JM109感受态菌、LB培养基、质粒提取、电泳药品等均购自北京鼎国生物技术有限公司。

凝胶回收试剂盒购于宝泰克公司。

鲜人参根取自吉林农业大学药用植物园。

10种植物苹果、红豆杉、长春花、马铃薯、景烈白兰、肾叶橐吾、杜仲、水稻、南苍术、南京椴的HMGR基因序列在Genebank上获得。

1.2　主要仪器
WD-9402A基因扩增仪,WD-9403C紫外分析仪,DYY-6B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂),SW-CJ-1D超净工作台(苏州净化设备有限公司),MDF-382E超低温冰箱(日本SANYO),TGL-20LM高速冷冻离心机(湖南星科科学仪器有限公司)。

1.3　方法
1.3.1　人参皂苷生物合成关键酶基因R T-PCR 扩增　以CTAB法[11]提取人参根组织的RNA。

根据已报道的其他植物H MGR基因序列设计合成特异性简并引物。

上游引物:5′-GG[N]GATGC [N]ATGGG[N]ATGAA[N]ATG-3′,下游引物:5′-AC[N]GT[N]CC[N]ACCTC AAT[N]GA[N]GGC AT-3′,扩增出的目的片段长度应为458bp。

取R NA提取液2μL,70℃水浴5min,再依次加入RNA酶抑制剂1μL、5倍反转录缓冲液5μL、dNTP2μL、特异性下游引物2μL、反转录酶1μL、高压灭菌去离子水12μL,42℃反应1h进行反转录。

取反转录产物5μL,100℃下作用5min,再依次加入10倍PCR缓冲液5μL、dNTP2μL、特异性上下游引物各2μL、R NA酶抑制剂2.0μL、MgCl2 4μL、高压灭菌去离子水29μL、液体石蜡50μL。

95℃下预变性8min,冰浴后加Ex Taq酶1μL。

置PCR仪中,选择以下循环参数:94℃预变性4min;94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环,最后72℃延伸10min。

将PCR 产物6μL与上样缓冲液1μL混匀后,在1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.3.2　人参皂苷生物合成关键酶基因克隆及序列分析　用凝胶回收试剂盒纯化HMGR基因RT-PCR产物,再将纯化回收的目的片段与pMD18-T载体连接成重组质粒pMD18-T/HMGR。

取pMD18-T/HMGR重组质粒转化到JM109大肠杆菌中进行克隆,以X-gal和IPT G筛选白色菌落。

之后按碱裂解法小提质粒,重组质粒以质粒分子量大小和PCR及酶切(Bam HⅠ和Hin dⅢ双酶切)进行快速鉴定,对阳性克隆菌重组质粒进一步测序鉴定。

用DNAStar软件对人参HMGR基因序列进行分析。

2　结果与分析
2.1　人参HMGR基因的RT-PCR结果
提取的人参RNA经琼脂糖甲醛变性凝胶电泳,可见28S及18S rRNA2条明显的区带,RNA 完整性好(图1)。

用HMGR基因特异性引物经RT-PCR扩增出458bp的目的片段(图2),该片段长度与HMGR基因相应片段长度相同,说明得到的基因可能是目的基因HMGR。

图1　人参根组织中提取的总RN A
Fig.1.Total RNA extraction from ginseng roots
501
郜玉钢等:人参H MGR基因的克隆与序列分析吉林农业大学学报Journal of Jilin Agricultural University
M .DL2000Marker ;1.目的片段Target fragment
图2　HMGR 基因的R T -PCR 结果Fig .2.RT -PCR of the HMGR gene
2.2　人参HMGR 基因重组质粒鉴定结果
质粒电泳结果见图3。

1～4泳道质粒的分子量大,说明pMD18-T 载体有外源片段的插入,可能是阳性克隆。

重组质粒经Bam H Ⅰ和Hin d Ⅲ双酶切得到2个片段(图4),与预期结果完全相符。

1～4.阳性质粒Positive pl as mid ;5.DL 2000Marker ;6.空载体对照Empty vector control ;7.阴性质粒Negative plas mid
图3　重组质粒分子量大小鉴定结果
Fig .3.Identification of the formula weight of recombi -nant plasmid
重组质粒经H MGR 基因特异性引物的PCR 鉴定结果见图5,得到1个约458bp 的片段,与预期结果完全相符。

重组质粒测序结果见图6,下游和上游引物对应序列分别为42～67,476～499部位碱基序列,证明得的重组子是正确的。

2.3　人参HMGR 基因序列分析
人参HMGR 基因与其他植物的HMGR 基因核苷酸序列有较高的同源性,依次为杜仲86.1%、南京椴83.8%、长春花83.2%、马铃薯82.5%、苹果82.1%、景烈白兰81.6%、肾叶橐吾81.6%、南苍术81.0%、红豆杉80.4%、水稻
80.3%。

各植物间同源性均较高,说明该段基因序列有较高的保守性。

人参HMGR 基因与其他
植物相关基因分子系统发育树见图7。

1～2.pMD18-T /HMGR 阳性质粒Pos itive plas mid of pMD18-T /HMGR ;M .DL2000Marker
图4　重组质粒酶切鉴定结果
Fig .4.Macrores triction identification of recombinant
plasmid
1.阳性质粒PCR 产物PCR products of positive plasmid ;M .DL2000Marker
图5　重组质粒PCR 鉴定结果
Fig .5.PCR identification of recombinant
plasmid
图6　重组质粒测序鉴定引物位置
Fig .6.Identification of the sites of primers of recombi -nant plasmid
502
吉林农业大学学报　2010年9月Journal of Jilin A gricultural Unive rsity 2010,Sep .
图7　人参H MGR基因系统发育树
Fig.7.Phylogenetic tree of ginseng root HMGR gene systerm
3　讨　论
3.1　关于HMG-CoA还原酶
由于甲羟戊酸的形成是一个不可逆过程,因此,H MGR被认为是该途径中第一个限速酶,是萜类化合物代谢中的重要调控点[5-6],同时它还与植物的光合作用、抗病性、生长发育等密切相关,其基因家族成员的差异表达对甲羟戊酸代谢“碳流”的调控起重要作用[12]。

H MGR的生成除了受到它的底物正向调节和终端产物的反馈调节外,还受各种激素以及转录水平、mR NA稳定性、翻译和共价修饰等因素的调节[13]。

人们最先在豇豆(Vigna vexillata)中检测到该酶的活性,随后在菊芋(Helianthus tube rosus)、胡萝卜(Daucus c arota)、假荆芥(Ne peta cataria)等植物中检测到其活性[14]。

1986年该酶被分离提纯,证明其是一类黄色体膜结合的疏水蛋白质[15]。

自Caelles等在拟南芥(A rabidopsis thaliana)中首次发现植物H MGR 基因后,HMGR基因已从巴西橡胶树(H evea brasiliensis)、马铃薯(Solanum tube rosum)、番茄(Ly-copersicon esculentum)等植物中克隆成功[16-20]。

本试验首次成功克隆了人参HMGR基因,并且发现人参HMGR基因与其他植物HMGR基因核苷酸序列有较高的同源性,说明甲羟戊酸途径也是人参皂苷生物合成的途径之一,HMGR是人参皂苷生物合成的关键酶。

3.2　萜类化合物生物合成与HMGR的关系
Choi等应用3种马铃薯HMGR基因(hmg1, hmg2,hmg3)作为基因探针,证明受伤诱导的固醇积累与H MGR1基因表达的诱导有关。

真菌提取物诱导的倍半萜植物抗毒素积累与H MGR2和HMGR3基因有关,但不诱导HMGR1基因的表达[21]。

这两项研究结果表明大量同功酶催化不同类型的类异戊二烯的合成。

终产物形成的调节依赖于每个代谢单位的调节,而代谢单位的调节通过3个方面来实现:①选择性同功酶的积累;
②同功酶插入到正确的代谢单位中;③经不同的翻译后修饰调控酶的活性水平[22]。

Wititsuwan-nakul等报道,巴西橡胶树中的钙调蛋白可能是通过调控H MGR的可逆磷酸化作用来控制H MGR 的活性,从而间接影响橡胶的生物合成[23]。

Schaller等获得1株导入橡胶树hmg1基因的转基因烟草,该植株在形态上没有变化,但H MGR活性增加4～8倍,植物的甾醇含量增加6倍,说明巴西橡胶树中的HMGR基因在天然橡胶及其他类异戊二烯化合物生物合成中可能起着关键调控作用[24]。

Chappell在研究中发现,HMGR活性的急剧升高可以诱导倍半萜环化酶活性,同时提高倍半萜植物抗毒素的产量[25]。

HMG-CoA还原酶既然作为萜类物质的合成前体能提高H MG-CoA 还原酶的活性,应该可以提高类异戊二烯的含量。

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(上接第499页)
3　讨　论
目前对于人参皂苷美白作用的研究较为少见。

杨亚军等[3]试验得出人参皂苷Rb能促进黑色素细胞的生长,对于酪氨酸酶同样有促进作用。

程基焱等[4]研究认为人参皂苷Rb1浓度<50μg/mL对黑色素细胞的生长增殖没有影响,但对培养黑色素细胞一氧化氮合酶的表达有抑制作用。

本试验结果表明,Rb1在小剂量时对B16黑色素细胞增殖有促进作用,大剂量时对B16黑色素细胞增殖有抑制作用;对于体外酪氨酸酶活性无影响。

可见,在人参皂苷Rb家族中的各个成员对于黑色素细胞的增殖和酪氨酸酶活性的影响可能是不同的。

Rb1对于体外酪氨酸酶活性没有影响,可能通过其他途径(一氧化氮合酶)参与黑色素合成代谢过程。

在后续的试验中,需进一步确定Rb1对于黑色素细胞内酪氨酸酶活性及黑色素的影响。

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