酶电极中酶固定化方法研究进展_孔维琴

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酶电极中酶固定化方法研究进展
孔维琴 陈志伟
（山东理工大学 化学工程学院，中国 淄博 255049）
摘要 酶电极是最常用也是最早开发的生物传感器，而固定化酶作为酶电极的关键也得到了广泛的关注。

本文介绍了酶电极及固定化酶的特点，重点讨论了制作酶电极的关键技术即酶固定化的方法，包括吸附法、包埋法、共价键合法和交联法等传统方法和静电纺丝法、纳米技术处理等一些新型的固定化方法，并进一步探讨了各种固定化方法的优缺点。

关键词 酶电极，固定化酶，研究进展
作者简介：
孔维琴（1986-），女，硕士研究生，应用化学。

E-mail:kongweiqin1986@
通信作者：陈志伟（1972-），男，教授，主要从事生物化学及分析测试方面的研究。

E-mail:12chen@
引言
酶电极是指将活性物质酶固定在电极表面，探测电流型或电位型催化反应信号。

酶电极是最常用也是最早开发的生物传感器。

早在1962年Clark [1]等人将酶片和电极结合起来，产生了酶电极的雏形，并在1967年由Updike和HickS [2]用聚丙烯酰胺凝胶固定葡萄糖氧化酶（GOD）成膜和氧电极组装在一起，制成了第一种生物传感器，即葡萄糖酶电极生物传感器。

因为酶与电化学电极的匹配很容易，所以对酶电极的研究最成熟。

到目前为止，酶电极被广泛应用于食品[3]、医药、化学分析、环境监测甚至军事等领域，中国专利CN 1452717A（2003）还公开了利用酶电极测定三磷酸腺苷（ATP）浓度的方法[4]。

酶是一类具有催化功能的活性物质，和化学催化剂相比，具有反应速度快、选择性好、反应条件温和、底物专一性强、可在水溶液和中性pH下操作等优点，同时酶本身可以被微生物降解，符合绿色化学的要求。

但是游离酶也有对外界因素非常敏感容易失活、不易分离和纯化等问题。

为了克服这些缺点，酶固定化技术应运而生。

酶的固定化是用一定的材料将活性酶束缚或限制于一定的区域内，但仍能进行酶所特有的催化反应，并可回收及重复使用的一种新技术。

酶的固定化是决定酶电极特性的关键技术。

它既要保持活性物质酶本身的特性，又要避免游离酶应用上的缺
陷。

与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一、温和及酶的活性可调节控制等酶催化反应特性之外，还具有下列优点：（1）极易将固定化酶与底物、产物分开；（2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；（3）在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；（4）酶反应过程能够加以严格控制；（5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；（6）较游离酶更适合于多酶反应；（7）可以增加产物的产率，提高产物的质量；（8）酶的使用效率提高，成本降低[5]。

本文介绍了酶电极及固定化酶的特点，重点讨论了制作酶电极的关键技术即酶固定化的方法，包括吸附法、包埋法、共价键合法和交联法等传统方法和静电纺丝法、纳米技术处理等一些新型的固定化方法，并进一步探讨了各种固定化方法的优缺点。

1 传统酶固定化方法
传统的酶固定化方法主要有四种：吸附法、包埋法、共价键合法和交联法。

1.1 吸附法
吸附法是指通过酶分子极性键、氢键、疏水键以及静电等作用，将酶吸附于不溶性载体上或直接吸附于电极材料表面。

吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少等优点，因而酶活力损失少，但是它也有酶与载体相互作用力弱、易脱落
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0.12倍。

1.4 交联法
交联法指利用双或多功能交联剂（如戊二醛）使酶分子内或分子间发生交联，形成不溶于水的三维交联体附着在固体表面而使酶固定化。

Schulze等[15]以戊二醛为交联剂，将人乙酰胆碱酯酶（huAChE）交联固定在丝网印刷电极上，并通过加入1 %（V/V）吐温-20（Tween-20）防止电极基体效应。

将该传感器应用于婴儿食品检测，不需样品前处理即可检测。

康天放等[16]以7,7,8,8-四氰基醌二甲烷（TCNQ）为电化学催化剂，采用戊二醛交联的方法将乙酰胆碱酯酶（AChE）固定在再生丝素粉末上，再将以上混合物固定于碳糊电极，制备成用于有机磷农药和氨基甲酸酯农药检测的生物传感器。

以上四种方法各有其优缺点，表1对这几种方法的优缺点进行了比较。

在实际应用中，可根据具体情况采用任意一种固定化方法，有时也可两种或数种固定化方法联用。

刘润等[18]先将乙酰胆碱酯酶（AChE）吸附在多壁碳纳米管（MWCNTs）修饰的玻碳电极表面，再通过戊二醛交联就取得了良好的固定化效果。

2 新型酶固定化方法
开发新型酶固定化方法的原则是：实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，尽量减少或避免酶活力的损失。

通过纳米技术、磁处理、静电纺丝和等离子体技术等新方法均可制备高活性固定化酶。

2.1 纳米技术处理
纳米材料作为一种新型材料，随着对其研究的不断深入，其应用范围也越来越广。

纳米技术处理是指将酶与纳米材料相结合，制备成纳米固定化酶。

由于纳米材料的特殊理化效应，纳米固定化酶可以提高酶活性、优化酶的理化性质、加快酶反应
速度、提高酶稳定性等，进而可提高酶的利用率和
表1 四种传统固定化方法的比较[32]
Table1 Comparison of four traditional immobilization methods
等缺点。

蔡称心等[6]制备了碳纳米管（CNTs）修饰的玻碳电极，利用吸附法将葡萄糖氧化酶固定到玻碳电极表面，形成葡萄糖氧化酶玻碳电极。

Lin [7]和Joshi [8]等将酶吸附在碳纳米管修饰的丝网印刷电极上，碳纳米管大的比表面积和特殊金属性增强了酶吸附和电子转移能力。

1.2 包埋法
包埋法是指将酶包埋在凝胶或聚合物的格子结构或微囊结构中，这样底物仍能渗入格子内与酶接触，同时还减少了酶蛋白的流失。

常见的载体有多糖类载体和聚合物载体，前者主要包括甲基纤维素[9]
、壳聚糖等；后者主要包括藻酸盐[10]、聚乙烯醇、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺[11]、树脂等。

包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，酶分子仅仅是被包埋起来，所以酶的高级结构几乎不发生改变，酶本身的特性也基本不发生变化。

但是在包埋时容易发生化学聚合反应，酶容易失活，必须巧妙设计反应条件。

而且由于大分子不能通过高分子凝胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为改变，降低酶活力，因此，包埋法只适合于小分子底物和产物的酶。

侯红萍和王家东[12]以共混凝胶为载体包埋固定糖化酶，用戊二醛进行交联，并通过正交试验确定最佳固定条件，其研究结果表明：壳聚糖和海藻酸钠共混凝胶是固定糖化酶的良好载体。

1.3 共价键合法
共价键合法是酶与载体以共价键结合的固定化方法。

共价键合法有两类：一是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；另一种是在载体上连接一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。

最常用的双功能试剂是戊二醛，此外也有文献报道利用有机黏土共价键合酶。

Vakurov等[13]用4-硝基偶氮苯将电极还原，辅以聚乙烯胺修饰，使电极含有活性氨基，再与乙酰胆碱酯酶（AChE）侧链基团共价键合实现对酶的固定。

聚乙烯胺修饰引起酶内部扩散受限，提高了米氏常数（K m ），对敌敌畏检测限能达到4×10- 9 mol/L，灵敏度为10-10 mol/L。

该方法固定过程简单，制备的电极储存稳定性好，可对有机磷农药实现快速、高灵敏度检测。

陈芳艳等[14]以壳聚糖凝胶颗粒为载体，采用共价键合法固定绿豆乳糖酶。

对壳聚糖固定化绿豆乳糖酶的酶学性质的研究表明：固定化绿豆乳糖酶的最适温度为60 ℃；表观米氏常数为0.04 %，是游离酶米氏常数的
生产效率。

为提高葡萄糖生物传感器的灵敏度，孟宪伟等[19]利用纳米增强效应，以Au、Ag、Pt、SiO2纳米颗粒及金属-无机复合纳米颗粒与聚乙烯醇缩丁醛（PVB）构成复合固定酶膜基质，采用溶胶-凝胶法固定葡萄糖氧化酶(GOD)，组成葡萄糖生物传感器。

研究表明，纳米颗粒可以大幅度地提高固定化酶的催化活性，增加电极的电流响应灵敏度，改进生物传感器的抗干扰性能，使信噪比提高了32倍。

中国专利CN 1766599A（2006）[20]公开了一种树状大分子封装金属纳米粒子与酶自组装形成多层膜传感器界面的纳米生物酶电极。

纳米颗粒由于空间效应被封装在树状大分子内部，能保持其良好的活性；电极表面形成含有分散性好的含有纳米金属颗粒的多层膜，可缩短相应时间，提高酶传感器的感应度；还可延长生物酶电极使用寿命，并可根据不同的应用需求选用不同种类的氧化酶，制得多样化的超灵敏的纳米生物酶电极。

2.2 静电纺丝法
静电纺丝是聚合物溶液或熔体借助于高压静电作用进行喷射拉伸而形成超细纤维的纺丝方法。

通过静电纺丝可最终在接收屏上形成纳米级长丝[21]。

通过静电纺丝的方法制备超细纤维同时固定酶，制备的活性酶膜面积大，制备方法简单，适用于批量化生产，在生物传感器及生物燃料电池电极的制备方面将有很现实的意义。

中国专利CN 101290301A（2008）[22]公开了一种基于静电纺纤维膜的安培酶电极及其制备方法。

以二甲基甲酰胺为溶剂，铂电极、金电极、玻碳电极或碳糊电极为接受电极，丙烯腈共聚物为原料，通过静电纺丝法在电极表面沉积共聚物纤维膜层，先通过共价法在纤维膜表面构建单层的氧化还原酶，然后向酶溶液中加入双功能试剂，使酶聚集体共价固定于电极表面的酶膜。

许鑫华等[23]通过聚乙烯醇（PVA）和葡萄糖氧化酶（GOD）共同静电纺丝的方法在金电极表面获得了固定化酶膜，用于构筑安培型葡萄糖生物传感器。

对固定化酶膜的红外光谱、紫外-可见光谱和扫描电镜的分析表明：酶成功固定在静电纺丝形成的纳米纤维膜中。

循环伏安法测试表明固定化酶在静电纺丝纳米纤维膜中保持了活性。

2.3 磁处理
磁性物质四氧化三铁（Fe3O4）与聚苯乙烯、含醛基聚合物等载体一起溶解混合后，再除去溶剂，可获得磁性载体。

磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物（如铁、钴、镍及其氧化物）从而具有磁响应性的超细粉末，可作为磁性载体。

磁性载体固定化酶具有磁响应性，因此可借助外部磁场简便地进行酶回收。

中国专利CN 101329296A（2008）[24]将碳纳米管超声分散在含三价铁离子和二价铁离子的壳聚糖酸水溶液中，制得由碳纳米管、Fe3O4和壳聚糖组成的三组分纳米磁性复合材料；将其分散在葡萄糖氧化酶水溶液中，吸附葡萄糖氧化酶，再分散在戊二醛水溶液中，通过伯氨基反应交联，将葡萄糖氧化酶固定在磁性复合材料的表面。

Lin Lei等[25]在含有四氧化三铁的甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、甲基丙烯酸(MAA)和二乙烯基苯(DVB)的混合溶液中通过悬浮聚合作用制备磁性微球，然后利用环氧树脂将脂肪酶共价固定在磁性微球上制得磁性固定化脂肪酶。

2.4 等离子体处理
采用等离子体辉光放电技术处理聚合物（如聚乙烯、聚丙烯、聚氨酯、聚四氟乙烯等）时，产生的各种能量粒子与固体表面作用，在表面引入羟基、羧基、羰基、氨基等官能团，达到改变表面化学结构的目的，再通过各种化学手段将酶蛋白固定在改性的载体上，形成固定化酶。

等离子体用于固定化酶具有操作简单、条件温和、载体单位面积固定化酶的量增多、酶结合牢固等优点。

Jun-Yong Lee等[26]将氧气等离子体处理的多壁碳纳米管（MWCNT）膜固定在聚二甲硅氧烷（PDMS）基质上，再固定化葡萄糖氧化酶得到GOD/MWCNT/Au/ PDMS电极。

该电极的灵敏度为18.15 μA mm-2 mM-1，检出限为0.01 mM。

与未经处理的碳纳米管相比，氧气等离子体处理过的碳纳米管膜在固定酶量、酶催化活性及电子迁移等方面都有较大提高。

M u g u r u m a等[27]利将葡萄糖氧化酶（G O D）吸附在氮气等离子体处理过的等离子体聚合薄膜（PPFs）表面，然后通过等离子体聚合作用将PPF 表面密集排列的GOD分子包埋起来。

原子力显微镜（AFM）图像表明葡萄糖氧化酶被包埋在PPF里面。

电化学测试表明固定化的酶活性损失很少。

3 其他固定化方法
除上述酶固定化方法外，也有文献报道利用超
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声波处理、电处理及微波辐射等技术固定化酶并取得了较好的效果。

黄卓烈等[28]发现经超声波处理后酶活力普遍升高，用15 kHz、50 W超声波处理胰蛋白酶3 min，酶活力可提高45.4 %。

蔡强等[29]采用电化学聚合法制备聚苯胺膜，并通过静电吸附固定辣根过氧化物酶（HRP），形成聚苯胺修饰的HRP电极。

这种酶电极对H2O2的电流响应高达25 μA,响应时间小于15 s。

梁足培等[30]在微波辐射下以戊二醛为交联剂，将壳聚糖球交联引入醛基，然后将交联的壳聚糖球浸泡在脲酶溶液中24 h，制备了壳聚糖球固定化脲酶，其酶比活为10.83 U/g载体。

研究表明，该固定化脲酶具有良好的重复使用性和贮存稳定性。

4 总结
近几十年来，一些新技术新材料的加入使得酶的固定化方法得到很好的发展和完善。

与传统方法制得的固定化酶相比，新技术制得的固定化酶具有更高的活性和稳定性。

然而，现阶段仍有许多问题亟待解决。

如很多固定化方法仅能在在实验室条件下成功，距离商业化还有很长的一段路。

尽管如此，酶的固定化作为酶电极的核心步骤，今后仍将是该领域的热点和重点。

研究探索新的酶固定化技术、提高固定化酶活性收率、延长半衰期、降低成本将成为固定化酶研究领域的主要研究内容。

参考文献
[1] L. C. Clark Jr. , C.Lyons. Electrode systems for continuous
monitoring in cardiovascular surgery[J]. Annals of the New York Academy of Sciences. 1962, 102: 29-45.
[2] S. T. Updike, G. P. Hicks. The enzyme electrode[J]. Nature,
1967, 214(92): 986-988.
[3] Subramanian Viswanathan, Hanna Radecka, Jerzy Radecki,
et al. Electrochemical biosensors for food analysis[J].
Monatshefte für Chemie/Chenical Monthly. 2009, 140(8): 891-899.
[4] 伊仓义昭, 野村昌行. 酶电极[P]. 日本: CN 1452717A,
2003-10-29.
[5] 岳振峰. 固定化酶法生产低聚异麦芽糖及其纯化研究[D].
广州: 华南理工大学, 2001.
[6] 蔡称心, 陈静, 陆天虹. 碳纳米管修饰电极上葡萄糖氧化
酶的直接电子转移[J]. 中国科学(B辑), 2003, 33(6): 511-518.
[7] Yuehe Lin, Fang Lu, Joseph Wang. Disposable carbon
nanotube modified screen-printed biosensor for amperometric detection of organophosphorus pesticides and nerve agents[J].
Electroanalysis, 2004, 16(1-2): 145-149.
[8] Kanchan A. Joshi, Jason Tang, Robert Haddon, et al. A
disposable biosensor for organophosphorus nerve agents based on carbon nanotubes modified thick film strip electrode[J].
Electroanalysis, 2005, 17(1): 54-58.
[9] 刘慧宏. 甲基纤维素水凝胶固定化酶电极及其制备方法
和应用[P]. 中国: CN 1885021A, 2006-12-27.
[10] 范家佑, 朱文适, 郁建平, 等. β-海藻酸钠固定半乳糖苷
酶的研究[J]. 食品与发酵科技, 2009, 45(4): 59-62.
[11] 高海燕, 乔毅, 徐芳萍, 等. 光固定化辣根过氧化物酶电极
的制备方法及其应用[P]. 中国: CN 101140256A, 2008-03-
12.
[12] 侯红萍, 王家东. 壳聚糖-海藻酸钠共混凝胶制备及其包
埋固定糖化酶的研究[J]. 中国食品学报, 2009, 9(3): 50-57.
[13] A. V a k u r o v, C. E. S i m p s o n, C. L. D a l y, e t a l.
Acetylcholinesterase-based biosensor electrodes for organophosphate pesticide detection I. Modification of carbon surface for immobilization of acetylcholinesterase[J].
Biosensors and Bioelectronics, 2004, 20(6): 1118-1125. [14] 陈芳艳, 王林川, 李文楚, 等. 壳聚糖固定化绿豆乳糖酶
的特性及应用的初步研究[J]. 食品科学, 2009, 30(3): 227-230.
[15] H o l g e r S c h u l z e, E l l e n S c h e r b a u m, M i c h e l a n g e l o
Anastassisdes, et al. Development, validation, and application of an acetylcholinesterase-biosensor test for the direct detection of insecticide residues in infant food[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2002, 17(11-12): 1095 -1105.
[16] 康天放, 刘润, 鲁理平, 等. 再生丝素固定乙酰胆碱酯酶生
物传感器[J]. 应用化学, 2006, 23(10): 1099-1103.
[17] 何钥, 林庆胜, 郝卫宁, 等. 生物固定化技术及其应用研究
进展[J]. 生物技术通报, 2009, (s1): 88-93.
[18] 刘润, 郝玉翠, 康天放. 基于碳纳米管修饰电极检测有机
磷农药的生物传感器[J]. 分析实验室, 2007, 26(9): 9-12. [19] 孟宪伟, 冉一国, 苟立, 等. 金属与非金属纳米颗粒增强
葡萄糖生物传感器[J]. 材料科学与工艺, 2004, 12(2): 163-166.
[20] 朱以华, 杨晓玲, 朱辉钰, 等. 纳米生物酶电极[P]. 中国: CN
1766599A, 2006-05-03.
[21] Zheng-Ming Huang, Y. -Z. Zhang, M. Kotaki, et al. A
review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites[J]. Composites Science and Technology, 2003, 63(15): 2223-2253.
[22] 徐志康, 王振刚, 黄小军, 等. 基于静电纺纤维膜的安培酶
电极及其制备方法[P].中国: CN 101290301A, 2008-10-22.
[23] 许鑫华, 任光雷, 刘强, 等. 聚乙烯醇静电纺丝法固定葡萄
糖氧化酶[J]. 天津大学学报, 2006, 39(7): 857-860.
[24] 陈刚, 陈挚, 张鲁燕. 一种基于磁性碳纳米管的葡萄糖电
极及其制备方法[P]. 中国: CN 101329296A, 2008-12-24.
[25] Lin Lei, Yongxiao Bai, Yanfeng Li, et al. Study on
immobilization of lipase onto magnetic microspheres with epoxy groups[J]. Journal of Magnetism and Magnetic
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Research Advance of Enzymatic Immobilization in Enzyme Electrode
Weiqin kong，Zhiwei Chen
（School of Chemical Engineering, Shandong University of Technology, Zibo, PRC，255049）
Abstract: Enzyme electrode is a biosensor, which was applied widely and developed earliest. The immobilization enzyme, which was one of the key of enzyme electrode, has been given more attentions in recent years. In the paper, the characteristics of enzyme electrode and im-mobilization enzyme were reviewed. The critical technology, enzyme immobilization methods, was discussed. The traditional immobilization tmethods included absorption, entrapment, covalent binding, cross-linking methods. Some new immobilization methods included electrospin-ning and nano technology. The virtues and defects of various immobilization were discussed and the prospect was predicted. Key words: enzyme electrode, immobilization enzyme, research advance
Materials,2009, 321(4): 252-258.
[26] Jun-Yong Lee, Eun-Jin Park, Cheol-Jin Lee, et al. Flexible
electrochemical biosensors based on O 2 plasma functionalized MWCNT[J]. Thin solid film, 2009, 517(14): 3883-3887.
[27] Hitoshi Muguruma, Yoshihiro Kase. Structure and biosensor
characteristics of complex between glucose oxidase and plasma-polymerized nanothin film[J]. Biosensors and Bioelectrinics. 2006, 22(5): 737-743.
[28] 黄卓烈, 陈小丽, 巫光宏, 等. 超声波对胰蛋白酶活力影响
的机理研究[J]. 中国生化药物杂志. 2009, 30(4): 230-235. [29] 蔡强, 宋保栋, 何苗, 等. 聚苯胺修饰的辣根过氧化物酶电
极的研究[J]. 环境化学, 2005, 24(1): 22-26.
[30] 梁足培, 桑明心, 李建, 等. 戊二醛交联壳聚糖糖球固定化
脲酶的制备[J]. 青岛科技大学学报, 2006, 27(2): 123-126.
在即将过去的“十一五”期间，中国质检大力实施科技兴检战略，收效显著。

2006年到2010年，中国质检系统共承担各类科研课题12000多项。

其中，铯原子喷泉钟基准、量子化霍尔电阻基准等成果，使中国时间频率计量达到世界一流水平，精确度相当于1500万年不差一秒;电阻计量领域在国际上处于领先地位。

期间，中国还主导制定国际计量标准345 项，参加计量国际关键比对231 项，获得国际互认测量能力735 项。

支树平介绍说，“十一五”时期，一系列质量安全科技项目的启动实施，为淘汰20%的落后产能、节能技术进步、第三代通信产业规范发展、钢铁、汽车等十大重点产业振兴等都提供了支持。

此外，“十一五”时期，中国不合格进出口商品检出率、疫病疫情检出率、有害生物截获率明显提高。

这些为有效规避贸易风险，打破国外技术贸易壁垒;防控非洲猪瘟、舞毒蛾等外来疫病疫情传入，都提供了技术支撑。