分子生物学在检验医学中的应用课件

A-81 GAC-AAC Asp-Asn 外显子2丢失
A-220 AAA-GAA Lys-Glu 电荷变化
A-314 CGT-TGT Arg-Cys 电荷变化
A-20 插入C
移码突变
A-128 TGTTGT-TGT ValVal-Val 辅酶结合
A-213 丢失2 bp (CT)
移码突变
A-251 丢失20 bp
移码突变
—————————————————————————
分子生物学在检验医学中的应用
LDH-B基因变异类型
变异位置 DNA
氨基酸置换
B-6
AAA-GAA
Lys-Gly
B-35
GCC-GAG
Ala-Glu
B-103 变
8bp重复
B-131
AGT-CGT
Ser-Arg
B-139
丢失2 bp (TC)
分子生物学在检验医学中的应用
1）
2、 2、电泳异常带的分子性质研究
分子生物学在检验医学中的应用
1） LDH异常电泳酶谱
M4 H1M3 H2M2 H3M1 H4 LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1
︱︱ ︱ ︱ ︱ ︱
︱ ︱ ︱︳ ︱︳ ︱︳ ︱︳ ︱ ︱︳ ︱︳ ︱︳ ︱︳
(+)
正常 H 缺失 M 缺失 H 变异 (slow) H 变异 (fast)
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
BNIoutS/BNoutAs: sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C FraGment lenGth 195 bp
•
LDH遗传变异病例
分子生物学在检验医学中的应用
病例 21岁男性： LDH：75 U/L
(参考范围：110-240 U/L) 其余指标均正常
在三年的调查期间，LDH活力始终处于 较低水平，在 48-85 U/L之间
分子生物学在检验医学中的应用
经排除其它原因，如血中的抑制剂 的存在、药物的影响等可能因素外，我 们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据 计算红细胞中H、M亚基的比值，初步 断定为H亚基变异，采用合成的7对引物， 分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后 用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异 发生在外显子4上，由此证明该病人的 长期低酶活力是有基因变异引起的。
B-145 变
4bpTer
B-171
CGC-CCC
Arg-Pro
B-172
TTT-GTT
Phe-Val
B-173 性
CGC-CAC
Arg-His
分子生物学在检验医学中的应用
影响 电荷变化 辅酶结合
移码突
辅酶结合 移码突变
移码突
无义突变 基质结合 基质结合 P轴的安定
2、 后生性调控标志物
分子生物学在检验医学中的应用
1、DNA甲基化-后生性调控的主要方式
DNA甲基化是不改变基因序列，而 是通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第 5位碳原子上加上甲基，从而调节基因 的表达。
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
2） 启动子甲基化作为新的分子诊断 标志物的研究
分子生物学在检验医学中的应用
SARS-specific primers: Cor-p-F2 (+)
5'CTAACATGCTTAGGATAATGG 3', Cor-p-F3 (+) 5'GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC 3', Cor-p-R1 (-) 5'CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3', Product size: Cor-p-F2/Cor-p-R1 :368 bp Cor-p-F3/Cor-p-R1 :348 bp
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
一、分子生物学在检验医学中的常用技术
• 1、 PCR技术 • 2、 RT-PCR技术 • 3、 RFLP • 4、 SSCP • 5、 MSP • 6、 测序
分子生物学在检验医学中的应用
二、外源性疾病的检验与诊断：
• 1、 细菌、支原体、衣原体、寄生虫、 • 病毒等 • 2、 SARS冠状病毒的分子生物学检测
分子生物学在检验医学中的应用
H 发生变异时，产生H 和h
M4 LD-5
︱
H1M3
LD-4
H1M3 h1M3
H2M2 H3M1
LD-3 LD-2
H2M2 h2M2 hHM2
H4
LD-1
H4 h1 H3 h2 H2 h3 H1 h4
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
LDH-1 LDH-2 LDH-3 LDH-4 LDH-5
H亚基数 4
3
2
1
0
M亚基数 0
1
2
3
4
%
A
B
C
D
E
------------------------------------------------------------------------------------------
计算方法： H = A+ 3/4 B + 2/4 C + ¼ D M = 100 - H 分子生物学在检验医学中的应用
3) CK变异的分子性质及对酶活力 的影响
病例
56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科
心电图和临床症状提示AMI
实验室检查：
LDH 6900 U/L (200-400 U/L)
LDH-1/LDH-2 1.72
CK
37 U/L (15-130 U/L)
CK-MB 0 U/L
分子生物学在检验医学中的应用
RT-PCR结果
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
3） 启动子甲基化在分析LDH异常带 分子性质中的首例应用
病例 4岁儿童 遗传性Rb 转移到颈淋巴结
血清LDH 升高 异常同工酶带LD2ex 位于 LD1和LD2之间
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
血清（浆）同工酶分析 （异常形式）
红细胞、白细胞同工酶分析
正常谱型
异常谱型
免疫对流、固定、混合法鉴定
遗传变异（H或M亚基变异）
（+）
（-）
分子生物学在检验医学中的应用
LDH-Ig复合物
肿瘤产生LDH
基因分析
LDH H/M 比值的计算
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分子生物学在检验医学中的应用
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外显子2 残基54处 A–G
GAC – GGC 天冬氨酸 – 甘氨酸 位于酶结构的第4个α-螺旋
分子生物学在检验医学中的应用
4）变异酶人群的检验结果不同于常 规人群的检验结果
结合临床研究发现变异酶的检验结 果与常人存在着显著的差异，即这类人 群发病前酶活力常低于正常人的参考范 围，发病时则上升至正常人的参考范围 之内，这个现象可能给临床医生正确诊 断造成困难；
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
mRNA1
a 1234567 □□□□□□□□
DNA mRNA2
a0
□□□□□□□□ 0 1234567
分子生物学在检验医学中的应用
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COR-1,COR-2: sense 5' CAC CGT TTC TAC AGG TTA GCT AAC GA 3'
antisense 5' AAA TGT TTA CGC AGG TAA GCG TAA AA 3'
Product size: 310 bp
分子生物学在检验医学中的应用
Queen Mary Hospital The University of Hong Kong University Pathology Building Hong Kong - SAR China
2） 异常电泳酶谱的分子性质
1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变， 2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前 的氨基酸的酸碱性不同， 3）变异的氨基酸位于分子的表面。 结果：产生异常的电泳结果
分子生物学在检验医学中的应用
3） 异常谱形的分析方法
分子生物学在检验医学中的应用
LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图
分子生物学在检验医学中的应用
2n 2 3n 3 4n 4 5n 5 6n 6
分子生物学在检验医学中的应用
2 ） LDH-A 和 LDH-B 亚 基 遗 传 变 异 及
对检验结果的影响
基因变异可导致酶分子组成结构发生变化， 对酶活力和酶的物理化学性质造成影响，可给临 床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状 态下，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期 的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病 的状态，容易造成误诊。
分子生物学在检验医学中的应用
LDH-A基因变异类型
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变异位置
DNA
氨基酸置换
影响
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A-171 CGA-TGA Arg-Ter 无义突变
A-328 GAG-TAG Glu-Ter 无义突变
BNIinS/BNIAs: sense GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG antisense CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G Fragment length 110 bp
SAR1s/SAR1as: sense CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA antisense TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG Fragment length 150 bp
分子生物学在检验医学中的应用
Government Virus Unit 9/F Public Health Laboratory Centre 382 NAm Cheong Street Shek Kip Mei Kowloon, Hong Kong SAR Hong Kong - SAR China
HKU: sense 5' TACACACCTCAGCGTTG 3' antisense 5' CACGAACGTGACGAAT 3' Product size 182 bps
分子生物学在检验医学中的应用
二、内源性疾病的检验与诊断：
• 1、 临床基因变异酶的分子性质研究
•
• 1） 用PCR-SSCP技术发现我国第一例
分子生物学在检验医学中的应用
Amplicon sequence (BNI-1, Bernhard-Nocht Institute, Hamburg, Germany)
TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAA TTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCG CGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGC TTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTG TGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACA GGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGA CACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAA AACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC