结核分枝杆菌耐药分析与基因检测分析
治疗药物检测和药物基因检测对结核病精准治疗的作用
13 Journal of China Prescription Drug Vol.19 No.2·综述·尽管自国际推荐的结核病控制策略（directly observed treatment ＋short course chemotherapy， DOTS）广泛实施以来，全球结核病防治取得了重大进展。
但由于上述相关药物的代谢及转运酶的基因存在多态性，由此所导致的INH的毒性反应以及抗结核药物的多药耐药现象依然广泛存在，进而导致治疗药效的失败和不良反应的发生。
因此，寻找并建立基于药物基因多态性的抗结核药物治疗策略，对于结核病的精准药物治疗具有重要的学术意义和社会价值。
1 药物基因多态性分析及治疗药物监测是实现疾病精准药物治疗的有效途径2015年1月20日，美国前总统奥巴马在国情咨文中提出“精准医学计划”，希望精准医学可以引领一个医学新时代。
同年2月26日，美国国立卫生研究院主任弗朗西斯·柯林斯在N Engl J Med发表了《精准医疗时代的兴起》，详细阐述了精准医疗内涵[1]。
精准药物治疗也称个体化治疗，是指医生根据患者的基因型和表型的个体化差异（多态性）而完成的诊断和药物治疗过程。
其中，医生根据药物基因测试或/和治疗药物监测（therapeutic drug monitoring， TDM）结果而做出的诊断，是为个体化差异的患者选择最佳治疗方案和最合适的药物种类及剂量的关键[2]，也是实现精准医疗的有效途径之一。
自Koch-Weser首次提出药物的疗效取决于个体患者血液中的药物浓度而不是给药剂量以来，药物在患者体内的暴露量已成为医生在疾病药物治疗过程中的关注核心[3]。
药物在人体内的暴露量及治疗效果与不良反应不仅仅受环境、饮食、胃肠组治疗药物检测和药物基因检测对结核病精准治疗的作用刘占中1，闫家微2，王亮3，谢士宁1，王春颖4＊（1 徐州医科大学附属徐州传染病医院药剂科，江苏徐州221004；2 徐州医科大学附属徐州传染病医院检验科，江苏徐州221004；3 徐州医科大学医学信息学院，江苏徐州221004；4徐州医科大学附属徐州传染病医院院办，江苏徐州221004）【摘要】据WHO推荐的标准治疗方案，初治结核病患者2个月的强化期采用利福平（rifampin， RIF）＋异烟肼（isoniazid， INH）＋吡嗪酰胺（pyrazinamide， PZA）＋乙胺丁醇（ethambutol， EMB）的四联法则进行治疗。
结核病的实验室诊断方法及评价
结核病的实验室诊断方法及评价耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR 为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
结核分枝杆菌耐药基因检测在耐药肺结核治疗中的价值分析
结核分枝杆菌耐药基因检测在耐药肺结核治疗中的价值分析发布时间：2023-06-01T12:10:20.007Z 来源：《医师在线》2023年1月2期作者：叶璐[导读]结核分枝杆菌耐药基因检测在耐药肺结核治疗中的价值分析叶璐（马鞍山市第四人民医院；安徽马鞍山243000）摘要：目的观察耐药肺结核治疗中采用结核分枝杆菌耐药基因检测的价值。
方法 纳入我院94例耐药肺结核患者为研究观察对象，收治于2019年3月10日～2022年4月30日，所有患者均采取药敏试验、结核分枝杆菌耐药基因检测，所有患者均采取相同药物治疗，观察不同方式阴转率及不同方式检测后X线检查好转率。
结果 94例患者治疗后发热症状恢复正常时间（3.45±0.54）d、咳嗽消失时间（5.61±0.49）d、乏力消失时间（6.71±0.62）d。
分枝杆菌耐药基因检测阴转率明显高于药敏试验阴转率，差异显著（P＜0.05）；分枝杆菌耐药基因检测后X线检查好转率明显高于药敏试验阴转率后X线检查好转率，差异显著（P＜0.05）。
结论 耐药肺结核治疗中将结核分枝杆菌耐药基因检测应用其中价值较高，可以提高阴转率，为治疗提供参考，可推广应用。
关键词：耐药肺结核；结核分枝杆菌耐药基因检测；咳嗽消失时间；阴转率肺结核发病率高，危害大，属于重大传染性疾病之一，对患者生活质量、生命健康影响巨大。
我国结核病发病率、病死率均较高[1]。
肺结核治疗周期较长，患者治疗中可以采用药物包括利福平、乙胺丁醇、异烟肼等，有效遏制病情发展与传播。
但在治疗同时，患者病原耐药性增加，抗菌药物抗感染效率出现一定差异，影响治疗效果。
为进一步确保耐药性肺结核患者治疗效果，全面分析药物细菌耐药情况极其重要。
本文研究以94例耐药肺结核患者为研究观察对象，意在分析结核分枝杆菌耐药基因检测在此类患者治疗中的应用价值，具体报告下述。
1一般资料与方法1.1一般资料2019年3月10日～2022年4月30日于我院收治94例耐药肺结核患者为研究观察对象，所有患者均采取药敏试验、结核分枝杆菌耐药基因检测，所有患者均行相同方法治疗。
基因芯片检测结核分枝杆菌耐药基因效能分析
论著 临床研究基因芯片检测结核分枝杆菌耐药基因效能分析∗孙正松１,曾方林１,戴㊀洁１,王金富１,２ә(１．扬州市第三人民医院,江苏扬州２２５０２５;２．江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏扬州２２５００２)㊀㊀摘㊀要:目的㊀评价基因芯片检测结核分枝杆菌(MT B)耐药性的效能.方法㊀选取１４０例MT B阳性的痰标本进行基因芯片检测和传统药敏试验检测,分析基因芯片法对异烟肼(I N H)㊁利福平(R F P)耐药性检测的灵敏度㊁特异度㊁准确度.对两种结果不符合的标本进行耐药基因测序检验.结果㊀I N H耐药基因检测的灵敏度８９．５％,特异度９６．１％;R F P耐药基因检测的灵敏度８６．４％,特异度９７．９％.痰和菌株进行基因芯片检测的结果一致率为９７．１％,用痰标本进行基因芯片耐药基因检测报告时间为(３．６ʃ１．５)d,传统药敏报告时间为(６５．１ʃ４．９)d.结论㊀利用痰标本进行的基因芯片检测可作为一种高效的MT B耐药筛查方法.关键词:基因芯片;㊀结核分枝杆菌;㊀耐药检测D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７３Ｇ４１３０．２０１８．２２．０１３中图法分类号:R４４６．５;RＧ３３１文章编号:１６７３Ｇ４１３０(２０１８)２２Ｇ２７７１Ｇ０３文献标识码:AA n a l y s i s o f d r u g r e s i s t a n c e e f f i c a c y o fm y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s i n g e n e c h i p∗S U NZ h e n g s o n g１,Z E N GF a n g l i n１,D A I J i e１,WA N GJ i n f u１,２ә(１．Y a n g z h o uT h i r dP e o p l eᶄsH o s p i t a l,Y a n g z h o u,J i a n g s u２２５０２５,C h i n a;２．J i a n g s uP r o v i n c i a lK e y L a b o r a t o r y o f Z o o n o s i s,Y a n g z h o u,J i a n g s u２２５００２,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e㊀T o e v a l u a t e t h e e f f i c a c y o f g e n e c h i p f o r d e t e c t i o n o f d r u g r e s i s t a n c e d e t e c t i o n o fm yＧc o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s(MT B)．M e t h o d s㊀G e n e t i c c h i p d e t e c t i o n a n d t r a d i t i o n a l d r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s tw e r e p e r f o r m e d i n１４０p o s i t i v es p e c i m e n s．T h ed r u g r e s i s t a n c e g e n es e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e do ns p e c i m e n s t h a t w e r en o t c o n s i s t e n tw i t h t h e t w o r e s u l t s．T h e s e n s i t i v i t y,s p e c i f i c i t y a n d a c c u r a c y o f g e n e c h i p m e t h o d f o r t h e d e t e c t i o no f i s o n i a z i d(I NH)a n d r i f a m p i c i n(R F P)w e r e a n a l y z e d．R e s u l t s㊀S e n s i t i v i t y o f I N H d e t e c t i o nw a s ８９．５％a n ds p e c i f i c i t y w a s９６．１％;T h e s e n s i t i v i t y o fR F Pd e t e c t i o nw a s８６．４％a n ds p e c i f i c i t y w a s９７．９％．T h e r e s u l t s o f g e n e c h i p d e t e c t i o n i n p h l e g ma n ds t r a i nw a s９７．１％．T h ed e t e c t i o nr e p o r to f g e n ec h i p w i t h s p u t u m w a s(３．６ʃ１．５)d;t h e t i m e o f t r a d i t i o n a l d r u g s e n s i t i v e r e p o r tw a s(６５．１ʃ４．９)d．C o n c l u s i o n㊀G e n e t i cc h i pde t e c t i o nu s i n g s p u t u ms p e c i m e nc a nb eu s e da s a nef f e c t i v e s c r e e n i ng m e th o d f o rMT Bd r u g r e si s t a n c ed e t e c t i o n．K e y w o r d s:g e n e c h i p;㊀m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s;㊀d r u g r e s i s t a n c e t e s t i n g㊀㊀我国近年来结核病发病率呈逐年下降趋势,但耐药结核的感染率却有所上升,全国第五次结核病流行病学抽样调查我国耐药结核比例高达４２．１％[１].耐药结核分枝杆菌(MT B)的传染性和致死率均较强,若不能及时并有效将感染耐药结核病人进行管理,势必会造成耐药结核的流行.传统的MT B耐药检测的是耐药表型,方法是固体培养法,包括比例法和绝对浓度法,此法耗时较长(大约需要８~１０周),已严重影响耐药结核病人的及时发现和治愈.如何快速诊断耐药结核患者是一个迫切需要解决的问题.晶芯 基因芯片试剂盒是通过检测MT B的利福平(R F P)耐药基因r p o B和异烟肼(I N H)耐药基因k a t G㊁i n h A是否发生突变,推断MT B是否存在I N H 和R F P产生耐药.本研究以传统MT B药敏试验(比例法)为参考,评价基因芯片检测MT B耐药的技术的应用价值.１㊀资料与方法１．１㊀一般资料㊀收集来本院就诊肺结核病患者的痰标本,选取抗酸分枝杆菌涂片和培养均阳性标本共１４９例,去除经鉴定为非MT B的９例,共计１４０例;抗酸分枝杆菌涂片阴性且MT B核酸检测阳性的５０例.１７７２国际检验医学杂志２０１８年１１月第３９卷第２２期㊀I n t J L a bM e d,N o v e m b e r２０１８,V o l．３９,N o．２２∗基金项目:江苏省人兽共患病学重点实验室开放课题资助项目(R１７０２);扬州市社会发展项目(Y Z２０１６０８８).㊀㊀作者简介:孙正松,男,副主任技师,主要从事结核病免疫研究.㊀ә㊀通信作者,EＧm a i l:w j f００２０＠s i n a．c o m.㊀㊀本文引用格式:孙正松,曾方林,戴洁,等．基因芯片检测结核分枝杆菌耐药基因效能分析[J]．国际检验医学杂志,２０１８,３９(２２):２７７１Ｇ２７７３．１．２㊀仪器与试剂㊀仪器:M x３０００P实时荧光定量P C R仪由美国安捷伦公司提供,基因芯片检测配套仪器由北京博奥生物有限公司提供.试剂:传统培养和药敏试剂由珠海贝索生物有限公司提供,P C R扩增仪和基因芯片试剂由北京博奥生物有限公司提供.耐药基因P C R引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,见表１.表１㊀㊀耐药基因扩增引物信息耐药药物耐药基因引物序列I N H k a t G F:G A T C G T C G G C G G T C A C A C T Tk a t G R:C G T T G A C C T C C C A C C C G A C Ti n h A F:C G A T A T G A C C C G C G C G C T G G Ai n h A R:G C G C C A C G A A C C T G T T G A C CR F P r p o B F:G A G C C C C C G A C C A A A G Ar p o B R:A T G T T G G G C C C C T C A G G １．３㊀方法㊀痰液化处理:将痰标本用４％的氢氧化钠溶液液化,液化好的上清液用于接种固体培养基和核酸提取.传统培养和药敏试验:严格按«结核病实验室检测操作规程»的要求进行,并定期用H３７R V进行质控.核酸提取:煮沸法提取核酸.MT B核酸检测(P C RＧ荧光探针法):严格按试剂说明书操作,并定期质控.基因芯片:核酸进行P C R扩增,产物用杂交缓冲液处理后在芯片杂交仪上进行杂交,再用芯片洗干仪进行洗涤和甩干,最后用芯片判别系统进行扫描和结果判读,并详细记录判读结果和芯片信息.基因芯片结果与传统药敏不同的,将核酸进行耐药基因P C R 扩增,扩增产物琼脂糖凝胶电泳以验证扩增产物是否合格,合格产物送南京金斯瑞生物科技有限公司进行耐药基因D N A测序,以MT B标准株H３７R v序列作为参考序列,利用序列比对软件M e g A l i g n,将P C R 产物测序序列与参考序列进行比对,从而得到突变位点的位置和类型结果.１．４㊀统计学处理㊀用S P S S１７．０软件进行统计学处理数据,两种方法检测结果的差异性应用配对四格表χ２检验判别,P＜０．０５为差异有统计学意义.两种方法检测结果的一致性应用K a p p a检验判别:K a p p aȡ０．７５表示一致性较好,０．４０＜K a p p a＜０．７５表示一致性一般,K a p p a＜０．４０表示一致性较差.２㊀结㊀㊀果２．１㊀基因芯片检测R F P效能分析㊀传统药敏检测到R F P耐药４４例,基因芯片法检出３８例,灵敏度为８６．４％;传统药敏检测到R F P敏感９６例,基因芯片法检出９４例,特异度为９７．９％;基因芯片结果与传统药敏结果一致的有１３２例,准确度为９４．３％;基因芯片检测R F P耐药的阳性预测值为９５．０％,阴性预测值为９４．０％;两种方法的比较,K a p p a值为０．８９５,表明一致性较好;两种方法的差异无统计学意义(P＞０．２５).２．２㊀基因芯片检测I N H效能分析㊀传统药敏检测到I N H耐药３８例,基因芯片法检出３４例,灵敏度为８９．５％;传统药敏检测到I N H敏感１０２例,基因芯片法检出９８例,特异度为９６．１％;基因芯片结果与传统药敏结果一致的有１３２例,准确度为９４．３％;基因芯片检测I N H耐药的阳性预测值为８９．５％,阴性预测值为９６．１％;两种方法的比较,K a p p a值为０．８５６,表明一致性较好,两种方法的差异无统计学意义(P＞０．２５).２．３㊀位点突变检测比较㊀基因芯片漏检２例R F P ３２９位点突变,３２９位点不在基因芯片试剂所检测的序列之中,其余的检测结果与D N A测序结果相符.㊀㊀注:M为D N A M a r k e r图１㊀㊀M T Bk a t G㊁r p o B㊁i n h A基因P C R产物电泳图图２㊀㊀部分菌株k a t G基因测序多序列比对图２．４㊀１４０例痰标本和培养分离的菌株基因芯片检测结果一致的有１３６例,一致率为９７．１％.利用痰进行基因芯片检测报告时间为(３．６ʃ１．５)d,利用菌株进行基因芯片检测报告时间为(３１ʃ５．８)d,传统药敏报告时间为(６５．１ʃ４．９)d.２．５㊀５０例MT B核酸检测阳性的标本,循环阈值(C t)ɤ３０的４３例均可得到基因芯片检测结果,C t＞３０的７例中６例无法进行基因芯片检测.３㊀讨㊀㊀论㊀㊀基因芯片又称D N A微阵列技术,是根据MT B 基因组上保守的基因序列(如１６S r R N A㊁２３Sr R N A㊁I S６１１０等)设计寡核苷酸探针等,将其固定于载体上,与互补的靶基因序列杂交,通过荧光检测装置检测荧光信号强度来进行分析.基因芯片实现了检测的自动化㊁集成化和微型化,能同时进行大量的基因分析[２],大大提高了实验效率,成为近年来对MT B耐药性进行快速检测的研究热点.研究表明,大约９５％的R F P耐药与r p o B基因的２７７２ 国际检验医学杂志２０１８年１１月第３９卷第２２期㊀I n t J L a bM e d,N o v e m b e r２０１８,V o l．３９,N o．２２突变有关[３Ｇ４],r p o B基因突变主要发生在位于r p o B基因的５０７~５３３位的R F P耐药决定区[５].大约８０％的I N H耐药与k a t G㊁i h n A基因突变有关k a t G[６], k a t G基因突变主要发生在３１５位点,i h n A基因突变主要是C(Ｇ１５)T启动子突变[７].基因芯片通过检测MT B耐药基因是否发生突变,从而推断MT B对R F P㊁I N H的耐药性.本研究表明,基因芯片检测R F P耐药性的灵敏度８９．２％,特异度９７．９％,基因芯片检测I NH耐药性的灵敏度８９．５％,特异度９６．１％,与赵冰等[８]㊁何建等[９]㊁周杨等[１０]研究结果相似,说明基因芯片检测MT B耐药性的灵敏度和特异度均较好.基因芯片除漏检２例３２９位点外,其余检测结果均与D N A测序结果一致,表明基因芯片检测的准确性较高.但基因芯片未能覆盖R F P和I N H的所有耐药位点,可能导致极少数耐药菌株被误判为敏感菌株,在实际应用中需要结合传统药敏结果进行判别.基因芯片检测到１例R F P密码子５３３(C T GңC C G)突变,但传统药敏检测结果为敏感,可能是因为５３３位密码子突变通常只引起低水平耐药[１１].有３例基因芯片检测到耐药基因常见突变,一般情况会引起MT B高水平耐药,但传统药敏检测结果为敏感,笔者认为应该是MT B混合感染引起此检测差异.有研究提及此现象[１２],但未详细分析,要想弄清楚此现象,尚需进一步研究.由于MT B生长非常缓慢,利用菌株进行基因芯片检测,需３０d以上才能得到耐药检测结果,仍然不能使患者得到及时准确的治疗.虽然试剂厂家推荐用菌株进行基因芯片检测,但本研究中利用痰标本进行基因芯片检测,其检测结果与菌株检测结果的一致率较高,且检测时间大大缩短,只需(３．６ʃ１．５)d,将有利于患者得到及时确诊和治疗,与许榕青等[１３]的观点相同.４例痰和菌株的基因芯片检测结果不一致可能是由于煮沸法提取核酸的效率不高引起,如利用C T A B法提取核酸应该能解决此现象.利用涂片阴性㊁MT B核酸阳性痰标本直接进行基因芯片检测,４３例C tɤ３０的均可正常检测,７例C t＞３０中的６例结果检测异常,推测是由于C t＞３０的痰标本中MT B的量较少,低于基因芯片的检测限.笔者认为抗酸分枝杆菌涂片阴性㊁MT B核酸检测阳性的痰标本,若C tɤ３０时可直接利用痰提取的核酸进行基因芯片检测,若C t＞３０时最好等培养出菌株再进行基因芯片检测,与罗一钧等[１４]的研究建议一致.４㊀结㊀㊀论㊀㊀利用痰标本进行基因芯片检测耐药基因是否发生突变,是一种检测MT B耐药性的高效快速筛查方法.参考文献[１]全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组,全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室．２０１０年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J]．中国防痨杂志,２０１２,３４(８):４８５Ｇ５０８．[２]MO S T R E M P,G O 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结核分枝杆菌耐药分子机制及耐药基因检测方法研究进展
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专 家 论述 ・
结 核分 枝杆 菌 耐药 分 子机 制 及耐 药基 因检 测方 法研 究 进展
解放军 ３９医院全军结核病中心研究室（ ０ 北京
关键词 结核分 枝杆菌 ； 耐药 基 因 ； 检测 ； 述 综
１ ０１ ０ ９） ０
辟 了一 条新 的途 径 。
变 导致 过氧化 氢酶 一过 中一 究 室 副 主 任技 师 ， 国 病 研 中
防痨协 套 基 础 （ 细 菌） 业委 台 专 氧 化物 酶活性 降低或 丧 失 ， 止 Ｉ Ｈ转 换 成 活 员会委 员 从 事结 核病 细茵 学、 阻 Ｎ
１ 结核分 棱杆菌 的耐药 分子 机制
ｉ Ａ基 因 ９ ｎ ｈ ４位 密 码 子 ； 队 级 、 家卫 生 部 和 北 京 项 军 国
编码 的氨基酸改变 ， Ｒ Ａ聚合酶分子原有 Ｒ Ｐ结合 使 Ｎ Ｆ 点的构象发生改 变， 失去结合 Ｒ Ｐ的能力 ， Ｆ 而导致耐
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突变使 Ｎ Ｄ Ａ Ｈ与之结合 学挂 术 进 步 二 等 奖 ５面 、 市科 三 降低 ， 抑制 了 ＩＨ活化 Ｎ 等奖 ６面 。参加 专（ ） 编写 ４ 译 著
用。结 核 分 枝 杆 菌 耐
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牵 国利 解 放 军 第 ３ ９医 院 垒 军 结 核 ０
的发展 ， 结核分枝杆菌的耐药机制及 耐药 的分子基础 大部分已被阐昵 ， 建立了快速检测结核分枝杆菌耐药 基 因的方法 ， 为结核 分 枝杆 菌快 速 药 物 敏 感性 试验 开
结核分枝杆菌耐药性检测
二、常用的MTB DST检测方法
（二）探针熔解曲线法
采用多色探针熔解曲线法快速检测MTB对RFP、INH、Sm、EMB和FQs 常见耐药决定区域，简便、快速，闭管检测不会交叉污染或造成实验室 污染，只需1台通用的荧光定量PCR仪，无需繁琐的杂交、显色过程，整 个检测过程只需2～3 h，可较全面地了解耐药基因突变信息，辅助诊断 MDR-TB和pre-XDR-TB（指对FQs或至少1种二线注射类药物耐药）；其 缺点是不报告具体的突变类型。
二、常用的MTB DST检测方法
分子DST方法
该方法是基于MTB对抗结核药物耐药分子机制，采用分子生物学技术检 测MTB的耐药基因型。分子DST已成为DR-TB的确诊方法之一，其建立 在基因扩增基础上，快速（2～48 h）、敏感地从MTB分离株或预处理的 临床标本（包括涂阴、培阴的标本）中检出MTB耐药基因突变；分子 DST只在初始阶段需要有较高的生物安全条件，标本消化处理和DNA提 取后标本的传染风险降低。
绝大多数常用的表型DST需要MTB纯培养物，MTB生长慢的特性决定了 该方法需花费较长时间，而且可能因为生长不良或其他微生物污染而导 致结果的不确定性，但该方法可检测多种抗结核药物的耐药性。
二、常用的MTB DST检测方法
（一）传统的DST方法
1.绝对浓度法（absolute concentration method）：将1 mg/ml菌悬液用生理 盐水倍比稀释至10^-2 mg/ml，吸取0.1 ml菌液分别接种于含高、低浓度药 液培养基和对照培养基上，置37 ℃培养4周，按下列方式报告菌落生长情 况：分枝杆菌培养阴性（－）：斜面无菌落生长；分枝杆菌培养阳性 （+）：菌落生长占斜面面积的1/4；分枝杆菌培养阳性（++）：菌落生 长占斜面面积的1/2；分枝杆菌培养阳性（+++）：菌落生长占斜面面积 的3/4；分枝杆菌培养阳性（++++）：菌落生长布满整个斜面；培养基斜 面上菌落数少于20个时，报告菌落数。
贵阳市结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因突变的检测与分析
贵阳市结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因突变的检测与分析孙荣;欧维正;王燕;蒙俊;秦万;毕雅坤;陈峥宏【摘要】目的了解贵阳市及周边地区结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因rpsl、rrs和embB的突变特征.方法对39株结核分枝杆菌临床分离株(乙胺丁醇和链霉素均耐药菌株19株,均敏感菌株20株)的rpsl、rrs和embB基因片段进行PCR扩增和测序,以H37Rv菌株序列为参考,比较耐药菌株和敏感菌株的突变特征.结果 19株耐药菌株中有14株检出rpsl基因突变,突变率为73.7％(14/19),其中12株为AAG43AGG突变,1株为AAG43AAT突变,1株为AAG88AGG突变;20株敏感菌株中有1株发生rpsl基因AAG43AGG突变,突变率为5.0％;耐药菌株和敏感菌株均未检测出rrs基因突变.19株耐药菌株中有16株检出embB基因突变,突变率为84.2％(16/19),突变包括6株ATG306GTG突变,ATG306ATA、ATG306ATT和ATG306ATC突变各1株;GGC406GCC和GGC406AGC突变各3株,1株CAG497CGG突变;20株敏感菌株未检测出突变.结论贵阳地区结核分枝杆菌菌株链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因突变具有多样性;优势突变分别为rpsl43和embB306位点突变.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2016(032)008【总页数】5页(P760-764)【关键词】结核分枝杆菌;链霉素;乙胺丁醇;耐药性;基因突变【作者】孙荣;欧维正;王燕;蒙俊;秦万;毕雅坤;陈峥宏【作者单位】贵州医科大学微生物学教研室,贵阳 550025;贵阳市公共卫生救治中心,贵阳 550003;贵阳市公共卫生救治中心,贵阳 550003;贵阳市公共卫生救治中心,贵阳 550003;贵阳市公共卫生救治中心,贵阳 550003;贵州医科大学微生物学教研室,贵阳 550025;贵州医科大学微生物学教研室,贵阳 550025【正文语种】中文【中图分类】R378结核病是由结核分枝杆菌引起的一种传染性疾病，虽然结核病的发病率呈缓慢下降趋势，但是近年来由于耐药结核分枝杆菌的出现和传播，使得结核病的疫情仍然不容乐观。
结核感染药物治疗中耐药突变基因检测结果分析
ｍ ｕ ｔ ａ ｎ ｔ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｌ ｔ ｔ ａ ｌ ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ａ ｎ ｄ ｓ ｐ ｕ ｔ ｕ ｍ ｒ ａ ｐ ｉ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ｄ ｕｇ ｒ ｓ ｅ ｎ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ （ Ｂ Ａ Ｃ Ｔ Ｅ Ｃ ＭＧ Ｉ Ｔ ９ ６ ０ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ） ｗ ｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ６ ０
［ 中图分类号 】 １ １ ５ ２
文章编码 ： １ ０ ０ １ — ８ １ ３ ｌ （ ２ ０ １ ４ ） Ｏ ４— ０ ２ ６ ８— ０ ２
［ 文献标识码 】 Ａ
学科分类代码 ： ３ ２ ０ ２ ４
Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ Ａｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ Ｍ ｕ ｔ ａ ｎ ｔ Ｇｅ ｎ ｅ Ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ
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结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药表型及rpoB基因型分析
１０ ９ ： ００ １
分析 结核 分枝杆 菌 （ ｙｏａ ｅｕ ｂｒ ｌｉ， Ｔ ） ｍ ｃ ｅ ｒ ｍｔ ｅ ｕ ｓ Ｍ Ｂ 临床 分 离株 利福平 （ｉｍ ｉ，Ｆ ） 药表 型 ｂ ｔｉ ｕ ｃ ｏｓ ｒ ｐ ＲＰ 耐 ｆ ｎ ａ 采 用改良罗氏培养基 比例法检测 ３７ Ｍ Ｂ ８ 株 Ｔ
密码子。６株 （ ．３ ） ３ ０ ％ 耐药株在 ｒｏ ｐＢ测序 范围内未见 突 变。１９株 比例 法 Ｒ Ｐ敏 感株 中，７ ８ Ｆ １４株 （ ２ ０ ％ ） ｒｏ ９ ．６ 在 ｐＢ基
因测序 范 围内未见 突变，５株 （ ．பைடு நூலகம் ） １ ７ ９ ％ 发生 突变 ， 中７株 Ｃ Ｇ １ Ｃ Ｇ（ ｅ－ Ｐｏ 突变和 ６株 Ｃ Ｇ ３ Ｃ Ｇ（ ｅ—Ｐ０ 其 Ｔ Ｓ １ Ｃ Ｌｕ－ ｒ） － ￣ Ｔ ５ ３ Ｃ Ｌｕ ｒ）
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【 关键 词】 结核分枝杆 菌 利福 平
耐药表 型 ｒｏ 基 因 ｐＢ
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139株结核分枝杆菌耐药性分析及耐药基因检测
139株结核分枝杆菌耐药性分析及耐药基因检测黄可儿;王琴;管鸽;陈卓美【摘要】目的了解本地区结核分支杆菌菌株的耐药状况,建立适合本地区结核分支杆菌耐药株的快速检测手段.方法 2013年5月至9月143例患者的痰液标本中获得的结核分支杆菌,分离培养获得试验菌株139株,进行菌株鉴定和药物敏感实验,并从中随机抽取12株菌株,利用试剂盒MTBDR-plus(德国HAIN Lifescience)进行rpoB、katG及inhA基因检测.结果 139株结核分枝杆菌复合群菌株中,对4种一线抗结核药物的总体耐药率为19.58％,其中17株(12.23％)至少对INH耐药,12株(8.63％)至少对RFP耐药,15株(10.79％)至少对SM耐药,3株(2.16％)至少对EMB耐药.在随机抽取的12株菌株中,耐药基因检测结果与药物敏感试验作比较,结果显示两组数据结果大致相符.结论耐多药结核菌株增多,应迅速建立准确快速的药物敏感性检测方法.试剂盒MTBDR-plus值得推广.【期刊名称】《浙江临床医学》【年(卷),期】2015(017)001【总页数】2页(P117-118)【关键词】结核分枝杆菌;耐多药;耐药基因;HAIN【作者】黄可儿;王琴;管鸽;陈卓美【作者单位】311800 浙江省诸暨市人民医院;311800 浙江省诸暨市人民医院;311800 浙江省诸暨市人民医院;311800 浙江省诸暨市人民医院【正文语种】中文结核病（TB）是由结核分枝杆菌感染引起的人畜共患的严重传染病，结核病的病死率在全球范围内均有上升的趋势［1］。
异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）作为一线抗痨药，其耐药性的出现，对感染耐药性结核杆菌患者的治疗带来较大困难。
进行TB耐药和耐多药的分析研究，对控制耐药和耐多药结核病有重要意义［2］。
结核分枝杆菌耐异烟肼的产生是与过氧化氢酶—过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，和inhA基因突变也有相关性；结核分支杆菌耐利福平与其核心区域rpoB基因突变有关［3，4］。
细胞壁缺陷结核分枝杆菌耐药性的基因研究
ＡＢＳ ＴＲＡＣＴ Ｏｂ ｅ ｔｖ Ｔｏ ｄ ｔｒ ｎ ｎ ｎ ｌｚ ｈ ｅ ｅ ｅａｅ ｏ ｄ ｕ ｅ ｉｔｎ ｅ ｎ ｒ ｂ ｈ ｊｃｉ ｅ ｅｅ ｍｉ ｅａ ｄ ａ ａｙ ｅ ｔ ｅｇ ｎ ｓｒ ｌｔｄ ｔ ｒ ｇ ｒ ｓｓａ ｃ ，ａ ｄ ｐ ｏ ｅ ｔ ｅ
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基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值
【 中图分 类号】Ｒ ３ ７ ８ ． ９ １ １
【 文献标 识码】 Ａ
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病例 的临床资料 ， 采用 晶芯结核 分枝杆菌生物芯 片技术进行检测 。 结果 本组 ６ ８ ５例临床 疑似病例 中 ， 阳性 １ ３ ５例 ， 阳性率 为 １ ９ ． ７ ％， 基 因芯片检测 结果 显示 结核 １ ３ １例 ， 非结 核 ４例 ， 阳性率 为 １ ９ ． １ ％。耐药基 因检 测 ６ ８例 ， 利福平 和异 烟肼基 因突变 １ ２例 ， 总 突变 率 为 １ ７ ． ６ ％， 其中 １ １例为 利福平 和异 烟肼 均耐药 ， 双重 基 因突 变率 为 １ ６ ． ２ ％， 另 １例 只耐利 福平 。利 福平总 突变 率为 １ ７ ． ６ ％， 异 烟肼 总突 变率为 １ ６ ． ２ ％， 耐多 药率 为 １ ６ ． ２ ％。 结论 晶芯 结 核分 枝
ｏ ｆ Ｍｙ ｃ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｔ ｕ ｂ ｅ ｒ ｃ ｕ ｌ ｏ ｓ ｉ ｓ
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基因芯片在分枝杆菌菌种鉴定及结核耐药基因检测的诊断价值
基因芯片在分枝杆菌菌种鉴定及结核耐药基因检测的诊断价值【摘要】目的：研究基因芯片检测应用在分枝杆菌菌种的鉴定以及结核耐药基因检测中的临床应用价值。
方法：选取2018年6月~2019年6月我院采集的158例痰涂片检测为阳性的肺结核患者作为研究资料，将采集的患者痰液标本进行基因芯片检测鉴定以及使用全自动分枝杆菌检测系统（BD BACTEC MGIT 960，以下简称“MGIT-960”）培养，并实施耐药性检测分析。
对比不同方法的一致性。
结果：RFP检测中，124例患者样本内通过基因芯片法与培养法结果相同均为115例：以MGIT-960培养为参考，基因芯片法准确定为92.7%、灵敏度为79.3%、特异性为96.8%、Kappa为0.790；INH的检测中，124例患者样本内通过基因芯片法与培养法结果相同均为98例，基因芯片法准确定为88.3%、灵敏度为78.1%、特异性为92.4%、Kappa为0.712。
组间比较差异有显著性（P> 0.05）。
结论：利用基因芯片检测能够精准地鉴定出菌种类型以及耐药基因检测，且与MGIT-960培养具有较好的一致性，具有重要的临床推广价值。
【关键词】基因芯片；分枝杆菌；菌种鉴定；耐药基因；肺结核1 资料和方法1.1 一般资料选取2018年6月~2019年6月我院采集的158例痰涂片检测为阳性的肺结核患者作为研究资料，其中男性患者99例、女性患者59例，患者年龄为16~70岁，平均年龄（46.58±11.24）岁。
研究中患者均符合《肺结核诊断》(WS288-2017)中肺结核临床诊断标准，并排除其他重大疾病；经过病理检测后确诊为肺结核。
1.2 仪器及试剂基因芯片检测平台及分枝杆菌配套试剂生产厂家为北京博奥生物有限公司，其中包含DNA提取液、聚合酶链式反应扩增试剂、RNA杂交缓冲液等；MGIT-960培养设备以及试剂生产厂家为美国碧迪公司1.3 方法使用基因芯片检测16种分枝杆菌，结核耐药基因检测为利福平（RFP）耐药性基因rpo上的6个点位（见表1）以及异烟肼（INH）耐药性基因KatG与inhA 启动子的各1个位点（见表2）。
结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测及分析
广州医学院硕士研究生学位论文结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测与分析Detection and evaluation of common drug-resistance gene mutations in Mycobacterium tuberculosis专业名称: 临床检验诊断学研究生: 杨辉导师: 吴爱武教授陈心春教授二0一三年三月·广州目录中文摘要~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~1 英文摘要~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~4 英文缩略词~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 7 前言~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~8 第一部分利福平耐药结核分枝杆菌rpoB 基因的检测与分析~~~~~~~~~~~~ 111.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 112.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~163.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~184.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~20 第二部分异烟肼耐药结核分枝杆菌相关耐药基因的检测与分析~~~~~~~~~~~211.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 212.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~273.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~304.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~31 第三部分HRMA技术检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药~~~~~~~~~~~~ 321.材料和方法~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 322.结果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~363.讨论~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~424.小结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~44 全文总结~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 45 参考文献~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 46 综述~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~51 附录~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~59 攻读学位期间取得研究成果~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 61 致谢~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~63 学位原创性声明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64 学术论文知识产权声明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64 关于学术论文使用授权的说明~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~64结核分枝杆菌常见耐药基因突变的检测与分析研究生：杨辉导师：吴爱武教授陈心春教授中文摘要研究背景及目的结核分枝杆菌（结核菌，Mycobacterium tuberculosis，MTB)是引起结核病的病原菌，至今仍然是单一感染因素导致死亡率最多的疾病之一。
结核分枝杆菌的耐药性及检测方法
结核分枝杆菌的耐药性及检测方法结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的慢性传染病，主要累及肺部，但也可侵犯其他器官。
然而，近年来出现了结核分枝杆菌对抗生素的耐药性问题，给结核病的防治带来了巨大挑战。
本文将就结核分枝杆菌的耐药性机制以及常用的检测方法进行论述。
一、耐药性机制1.多重耐药（MDR）多重耐药是指结核分枝杆菌对两种最主要的抗结核药物——异烟肼和利福平同时产生耐药现象。
这种耐药形式使得传统治疗手段无法有效控制感染，并且增加了传播风险。
2.延迟耐药（XDR）延迟耐药是在MDR基础上，又产生对氟喹诺酮类等二线抗结核药物的耐药性。
这使得治疗选择更加有限，且通常需要使用更昂贵和毒副作用更大的抗结核药物。
3.全耐药（TDR）全耐药是指对所有一线和二线抗结核药物都产生耐药现象，这种情况下仅能依靠其他的药物才能进行治疗。
然而，这些替代治疗方案费用昂贵且可行性有限。
二、检测方法1.传统的抗生素敏感性测试传统的抗生素敏感性试验使用培养分枝杆菌，并将其接种于含有抗生素的琼脂平板上。
通过观察细菌在不同浓度抗生素下的生长情况来判断其对该抗生素是否具有耐药性。
尽管这种方法简单易行，但其确诊时间较长，且容易出现误判。
2.分子检测方法随着分子生物学技术的进步，利用PCR技术可以更快速地检测结核分枝杆菌的耐药基因突变。
这种方法通过检测与耐药性相关基因序列的存在与否来确定细菌对特定抗生素是否具有耐药性。
由于PCR技术高灵敏度和高特异性，它已成为常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法之一。
3.流式细胞术流式细胞术利用荧光标记的结核分枝杆菌单个细胞对特定抗生素的反应进行测定。
通过测量细胞内荧光信号的变化来判断其对抗生素是否产生了耐药性。
这种方法具有高通量和快速的优势，但需要对样本进行前期处理以获得单个菌落。
4.质谱法质谱法利用MALDI-TOF质谱仪检测结核菌代谢产物图谱与数据库匹配，从而快速确定结核分枝杆菌的耐药类型。
结核分枝杆菌(MTB)耐药突变基因检测在结核检测中的应用
结核分枝杆菌 (MTB)耐药突变基因检测在结核检测中的应用摘要：目的：研究在结核分枝杆菌（MTB）耐药突变基因检测在结核患者中的检测效果。
方法：选取2019年4月～2020年4月在我院治疗的肺结核患者562例，分别进行Xpert MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测、液体培养法、直接涂片三种检测方法，将临床诊断作为金标准。
结果：MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测的准确度、灵敏度、特异度均高于液体培养法与直接涂片法，P＜0.05。
结论：在结核病的检测中，采用MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测具有较高的诊断价值。
关键词：结核分枝杆菌；耐药突变基因；结核病结核病是常见的感染病，是由结核分枝杆菌（MTB）引起的强烈的慢性疾病，最常见的为肺结核，是导致人类死亡的主要原因之一。
据有关统计学报道，我国每年新发的结核患者可多达上百万里，仅次于印度及印度尼西亚。
我国对结核病的防治规划是在2030年之前，争取将结核病的发病率降低80％，为了实现这个目标，对结核病患者的早期诊疗及耐药性检测就非常重要了[1]。
当前结核病的诊断依然依赖传统的涂片及培养法，培养周期长，生物安全性高，检出率较低。
近些年开始推荐Xpert MTB/RIF系统结合利福平耐药性检测，具有快速便捷的作用[2]。
本文就Xpert MTB/RIF系统结合利福平对可疑肺结核患者进行检测，评价此检测方式在耐药突变基因中的检测价值进行研究，现汇报如下。
1.资料及方法1.1一般资料选取我院收治的562例疑似肺结核患者，均于2019年4月～2020年4月期间收治，男369例，女193例，年龄：18-75岁，平均年龄（42.45±9.81）岁。
临床诊断结果显示562例疑似结合患者中，MTB阳性424例、阴性138例。
1.2方法所有患者均采用美国BD公司生产的BACTECMGIT960系统、MGIT管及利福平药粉；采用美国Cepheid公司生产的Xpert MTB/RIF设备及试剂盒以及贝索公司生产的抗酸染液。
结核分枝杆菌链霉素耐药临床分离株rpsL基因突变特征分析
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魏 淑 贞 ， 秀芹 刘志 广 万康林 赵 ， ，
摘 要 ： 的 了解 我 国结 核 分 枝 杆 菌 （ ｃｂ ｃ ｒｕ ｔｂｒｕｏｉ，ＭＴＢ ｒ ｓ 基 因突 变 特 征 及 其 与链 霉 素耐 药 的 相 关 目 Ｍｙ ｏａｔ ｉｍ ｕ ｅｃ ｌｓ ｅ ｓ ）ｐ Ｌ 性， 并评 价 其 应 用 价 值 。方 法 对 ３ ２株 结 核 分 枝 杆 菌 临 床 分 离株 的 ｒ ｓ 基 因采 用 聚 合 酶 链 反 应 直 接 测 序 （ Ｃ － Ｓ 进 行 ０ ｐＬ Ｐ ＲＤ ） 检 测 。 结 果 ５ ９株 对 Ｉ ＮＨ、 Ｐ Ｓ 、 ＭＢ 和 Ｐ ＲＦ 、 Ｍ Ｅ ＡＳ全 部 敏 感 ，ｐＬ 基 因 没 有 突 变 ， １株 对 Ｓ 敏 感 的 耐 药 株 有 ６株 突 变 ， ｒｓ ６ Ｍ Ｓ 敏 感 菌 株 突 变 率 为 ５Ｏ （ ／ ２ ） ８ Ｍ ． ０ ６ １ ０ 。１ ２株 Ｓ 耐 药 ＭＴ ｒ ｓ 基 因突 变 率 为 ７ ． ３ ， 中 ４ Ｍ Ｂ，ｐ Ｌ ０ ３ 其 ３位 密 码 子 赖 氨 酸 转 变 为 精 氨 酸 （ ｙ４ Ａｒ） 变 率 为 ５ ． Ｏ ； ８位 密 码 子 有 ４种 突 变 类 型 ， 变 率 为 １ ． ８ ；６位 密 码 子 精 氨 酸 转 变 为 谷 氨 酰 胺 Ｌ ｓ３ ｇ 突 ２２ ８ 突 ７ ５ ８ （ ｇ ６ ｌ） 变 率 为 ０ ５ 。Ｓ 耐 药株 的 ｒ ｓ 基 因突 变 率 明 显 高 于 Ｓ 敏 感 株 的基 因突 变 率 ， 者 之 间 的 差 异 有 统 计 学 Ａｒ８ Ｇ ｎ 突 ．５ Ｍ ｐＬ Ｍ 两 意 义 ， ｚ ２ ． ５ Ｐ＜ ００ 。 结 论 ｒ ｓ 基 因突 变 与结 核 分 枝 杆 菌链 霉 素 耐 药 高度 相 关 ， 中 Ｌ ｓ３ ｇ突 变是 主 要 突 变 类 Ｙ ：１ ５ ０ ， ．５ ｐＬ 其 ｙ４ Ａｒ
分枝杆菌快速培养鉴定及耐药性检测的结果分析
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论
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分 枝杆 菌 快 速培 养 鉴 定及 耐药 性检 测 的结 果分 析
温贵 华 ， 刘晋 洪 ， 刘 婷 ， 伊 ， 陈 郭夏 娜 ， 翁琼琳 ， 勇龙 ， 惠婷 邱 赖
（ 东省 深 圳 市 宝 安 区 慢 性 病 防 治 院 ５ ８ ３ ） 广 １ １ ３
摘 要 ： 目的 评 价 变 色液 体 培 养基 快 速 一 步 法 检 测 试 剂 对 分 枝 杆 菌培 养 、 定 和 药敏 测 定 的 效 果 。方 法 采 用 快 速 变 色液 鉴 体 培 养 基 和 传 统 酸性 罗氏 培 养 法 对 １ ８例 痰 标 本 进 行 结 核 分 枝 杆 菌检 测 。结 果 快 速 变 色液 体 培 养 法 和 酸 性 罗 氏 培 养 法 ， 个 ９ 整
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结核分枝杆菌的耐药性检测方法
结核分枝杆菌的耐药性检测方法简介：结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，全球范围内广泛存在。
然而，随着抗生素的滥用和不当使用，耐药性分枝杆菌株的出现成为一个严峻的问题。
因此，准确、快速地检测耐药性对于结核病防控至关重要。
本文将介绍几种常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
传统涂布法：传统涂布法是一种经典而常用的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
该方法需要将分离得到的结核杆菌培养在含有不同抗生素的琼脂平板上，并进行48小时以上培养。
通过观察菌落生长情况和对比试验，可以确定其耐药类型。
然而，这种方法操作复杂、时间较长且结果受到人为判断主观因素影响，已逐渐被新型技术所取代。
PCR扩增法：聚合酶链反应（PCR）扩增法是一种高效、敏感且特异性强的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
它基于DNA的扩增原理，通过引物特异性靶向结核分枝杆菌核酸片段进行扩增，并通过特定技术判断结核杆菌是否存在耐药基因。
PCR可以在短时间内得到结果，并且可以同时检测多个抗生素的耐药性。
然而，PCR方法需要专业实验室设备和一定的操作技巧，不适合于基层医疗机构。
快速涂片法：快速涂片法是一种经济简便、结果迅速的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
该方法利用亲水性阳离子染料对细胞壁进行着色，分析红细胞上色素的扩散情况，从而确定是否存在抗药型结核分枝杆菌。
这种方法操作简单、成本低廉且结果直观可靠。
然而，在高密度培养物中检出阳性样本可能会受到其他非结核分枝杆菌污染的影响。
气质联用仪法：气质联用仪法是一种新兴的结核分枝杆菌耐药性检测技术。
该方法基于结核杆菌产生的气体代谢产物，通过检测气相色谱和质谱的联用技术来分析结核分枝杆菌对抗生素的耐药性。
这种方法具有高效、快速、无需培养的优势，并且可以同时检测多种抗生素。
然而，由于设备昂贵且操作复杂，需要专业实验室支持。
基因测序法：基因测序法是一种准确度极高的结核分枝杆菌耐药性检测方法。
它通过对整个细菌基因组进行全序列测定，包括靶区的引物设计、DNA提取、文库构建以及高通量测序技术等步骤，可以获得详尽的耐药性信息。
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结核分枝杆菌耐药分析与基因检测分析目的探讨结核分枝杆菌耐药情况及基因检测分析。
方法从2012年3月～2014年3月我院收治的结核病患者中选取62例为研究对象，按随机数字法对患者进行分组，首次诊治患者39例为观察组，首次诊治失败后行第二次治疗患者23例为对照组，对所有患者结核分枝杆菌进行耐药分析及rpsL、rpoB、embB、KatG基因检测。
结果62例患者中共19例出现耐药，耐药率为30.65%，对照组患者1种药物耐药率为26.09%，同观察组10.26%比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），2种药物耐药率为17.39%，同观察组7.69%比较，差异有统计学意义（P＜0.05），3种药物耐药率为8.70%，同观察组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；rpsL、rpoB、embB、KatG基因突变率分别为83.33%，86.11%，88.89%，91.67%，x2检验显示，差异无统计学意义（P>0.05）。
结论结核分枝杆菌耐药的产生同菌株基因具有较大关联，且耐药率同治疗次数有关，在结核病临床治疗中，需根据患者耐药情况，选择联合用药方案，提高治疗效果。
[Abstract] Objective To investigate the analysis in drug resistance of bacteriology tuberculosis and genetic testing. Methods 62 cases of TB patients from March 2012 to March 2014 in our hospital were selected as the objects，and allocated into an observation group and a control group according to the randomly grouping method，first diagnosis and treatment in 39 patients in the observation group，first diagnosis and treatment failure underwent secondary treatment of 23 patients in the control group，all patients were resistant Bacteriology tuberculosis was analyzed and rpsL，rpoB，embB，KatG genetic were tested. Results 62 cases of patients with 19 cases of drug resistance，the drug resistance rate was 1，the control group of patients with 26.09% was compared with the control group（10.26%），（P＜0.05），2 drug resistance rate was 17.39% and 7.69%，the differences were significant （P＜0.05），3 drug resistance rate was 8.70%，compared with the observation group，the difference was statistically significant （P＜0.05）；rpoB，embB，rpsL，KatG gene mutation rate was 86.11%，88.89%，91.67%，83.33%，x2 test showed no statistical significance （P>0.05）. Conclusion The generation of drug-resistant Bacteriology tuberculosis strains with genes associated with a larger，and the number of drug-related rates with treatment in the clinical treatment of tuberculosis，to be based drug resistance in patients choose combination therapy programs，improve the therapeutic effect.[Key words] Bacteriology tuberculosis；Drug resistance；Gene；Detect重大传染性疾病对于人们健康及社会稳定均具有较大危害，因此，对其进行快速诊断历来为人类生存发展所必须。
自1882年发现结核分枝杆菌以来，结核病便成为严重影响患者健康的重要传染疾病。
世界卫生组织1993年称“全球结核病处于紧急状态”，1998年称“遏制结核病行动刻不容缓，1999年数据显示[1]，全世界每年因结核病死亡人数高达300万，是其他传染病死亡人数之和；世界卫生组织（WHO）将结核病与艾滋病、疟疾列为21世纪人类需要攻克的三大传染性疾病之一。
资料显示[2]，我国结核病感染者达5.5亿，发病率、死亡率和耐药率均明显高于发达国家水平。
而耐药结核的出现，给结核病的防控与治疗增加了难度，本研究对62例结合并患者的耐药情况进行分析，结合基因检测方法，对结核分析杆菌耐药原因进行分析，为结核病的防治提供更为科学的参考依据。
1 资料与方法1.1 一般资料从2012年3月～2014年3月我院收治的结核病患者中选取62例为研究对象，男36例，女26例，年龄18～71岁，平均（45.3±3.2）岁，按随机数字法对患者进行分组，首次诊治患者39例为观察组，首次诊治失败后行第二次治疗患者23例为对照组，全部患者均留取痰标本，经Bactec-960增菌培养与7H9培养基培养，抽取其临床分离株为研究材料，并行耐药检测。
两组患者在性别、年龄方面比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。
1.2 方法1.2.1 仪器与试剂主要仪器包括：微生物培养箱；生物安全柜；罗氏培养基。
药物包括：链霉素（SM）、异烟肼（ING）、乙胺丁醇（EMB）及利福平（RFP）。
罗氏培养基作为药敏试验方法。
1.2.2 检测方法采用PCR-反向斑点杂交技术对结核分枝杆菌中的rpoB、KatG基因及rpsL基因突变进行检测，并根据结核分枝杆菌野生株序列，设计覆盖rpoB、KatG基因和rpsL基因核心突变区的系列寡核苷酸探针并将其固定在尼龙膜上，并应用生物素标记的特异性引物扩增包含核心突变区的基因片段，与固定在膜上的寡核苷酸探针杂交，对突变位点进行快速检测。
从62株临床分离株中挑选36株耐药株进行药敏实验。
抗性相关基因的测序方法：通过PCR-DS（聚合酶链反应-直接测序法）对临床分离的结核分歧杆菌的抗药相关rpsL、rpoB、embB、KatG基因基因进行快速检测。
同时，根据野生株序列，设计覆盖rpsL、rpoB、embB、KatG基因核心突变区的引物，在经PCR扩增后，采用测序仪进行测序，同时与标准序列进行对比，对突变进行分析。
1.3 统计学方法将数据纳入SPSS17.0软件中分析，计数资料采用x2检验，并以率（%）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1 耐药分析62例患者中共19例出现耐药，耐药率为30.65%，对照组患者1种药物耐药率为26.09%，同观察组10.26%比较，差异有统计学意义（P＜0.05），2种药物耐药率为17.39%，同观察组7.69%比较，差异有统计学意义（P＜0.05），3种药物耐药率为8.70%，同观察组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示治疗次数可增加结核分枝杆菌的耐药性，见表2。
2.2 基因检测62例患者中rpsL、rpoB、embB、KatG基因突变率分别为83.33%，86.11%，88.89%，91.67%，x2检验显示，经不同的抗结核药物治疗后，rpsL、rpoB、embB、KatG基因突变率，差异无统计学（x2=1.0610，P>0.05），见表3。
3 讨论重大传染性疾病对于人们的健康及生活质量具有重大影响，其中，结核病具有极高的发生率及危险性，同艾滋病及疟疾并列为人类最难攻克的3大传染性疾病[3]。
有报道显示[4]，在我国结核病发生率、患者死亡率及病菌耐药率同发达国家水平相比，均明显较高，每年近13万结核病患者死亡。
另有研究指出[5]，近年来由于抗生素的不合理应用及耐药结核的出现，使得我国结核病总耐药率明显上升。
因此，对于耐药及耐多要结核病的防治，成为临床研究热点。
链霉素（SM）、异烟肼（ING）、乙胺丁醇（EMB）及利福平（RFP）是治疗结合并的一线抗结核药物，因此，目前对于上述药物的耐药性分析，一直是研究重点[6]。
结核分歧杆菌耐耐链霉素的产生，同其核糖体蛋白S12的编码基因rpsL的缺失有关；耐异烟肼的产生，同过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失有明显关联；而EMB基因突变是耐乙胺丁醇的原因；耐利福平是因核心区域rpoB 基因突变所致[7]。
有学者指出[8-9]，对于结核病致病体的检测与耐药性分析，对于疾病的防治具有重要意义。
关于治疗次数与耐药性的关系，学界普遍认为两者呈正相关性，临床观察发现，结核病复发后第二次进行治疗的患者耐药率同首次资料患者相比，明显较高，因此，在临床治疗中，需对耐药率进行分析，有效指导临床用药。
本研究中首次诊治失败后行第二次治疗的对照组患者耐药率同对首次治疗的观察组比较明显较高，差异有统计学意义（P＜0.05），且总耐药比例略高于国结核病总耐药率，表明患者治疗次数对于耐药率有较大影响。
以往研究在进行耐药分析时，未注重患者诊治次数，因此对于耐药性的分析缺乏客观性及准确性，本研究对不同治疗次数患者的耐药率进行对比分析，发现首次诊治失败后行第二次治疗患者耐药率较高，可能同抗结核药物的剂量较大，时结核分歧杆菌耐药性增强有关，因此，在结核病治疗中，需尽量采用科学方法，缩短疗程，预防复发，减少病菌耐药性。
同时，本研究结果还发现，多种药物联用，患者耐药率较低，表明在结核病治疗中，采用联合用药方法，可有效提高治疗效果。
在以往较长时间，比例法及绝对浓度法是结核分枝杆菌耐药性的常用测定方法，但有学者认为[10-11]，采用上述方法，耐药性测定时间达到6～8周，甚至需要更长时间，不能对临床治疗进行及时指导。