雷氏大疣蛛毒素纤溶酶的两种分离方法比较

合集下载

高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达

高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达引言：纤溶酶是一种重要的酶类，能够降解纤维素生物质，具有广泛的应用前景。

筛选和克隆高活性纤溶酶菌株成为研究的重要方向。

本文将探讨一种高活性纤溶酶菌株的筛选方法，并介绍其基因克隆表达的技术。

一、高活性纤溶酶菌株的筛选方法1. 环境样品的收集与处理需要采集有可能存在纤溶酶菌株的环境样品，如土壤、沉积物等。

然后，将样品进行过筛处理，以去除较大颗粒物和杂质，得到较为纯净的菌种样品。

2. 纤溶酶的活性测定利用碳水化合物基质（如CMC）来检测样品中纤溶酶的活性。

将样品与基质混合后，在一定温度下反应一段时间，然后通过添加酚红指示剂来判断样品中是否产生了纤溶酶。

3. 分离纯化菌株通过向含有纤溶酶活性的样品中接种在有选择性培养基上，将含有纤溶酶菌株的单个菌落分离出来。

然后，通过连续传代培养，筛选出纤溶酶活性较高的菌株。

4. 提取基因组DNA采用常规方法，从筛选出的纤溶酶菌株中提取出基因组DNA。

5. 纤溶酶基因的聚合酶链式反应（PCR）扩增根据已知的纤溶酶基因序列，设计特异引物进行PCR扩增，以获得纤溶酶基因的DNA片段。

二、纤溶酶基因的克隆表达1. DNA片段的连接和克隆将纤溶酶基因的PCR产物与适当的载体（如pET、pUC等）进行连接，并转化到大肠杆菌中，形成重组菌株。

2. 重组菌株的筛选与鉴定通过对重组菌株进行抗生素筛选、PCR扩增和限制性酶切等方法，筛选出含有纤溶酶基因的目的菌株，并进行序列分析以确保基因的准确性。

3. 表达载体构建与转化将已验证的含有纤溶酶基因的重组质粒进行扩增放大，并用合适的浓度导入宿主菌株中。

4. 培养与诱导表达将含有重组质粒的宿主菌株进行培养，并在适当的时间和条件下通过添加诱导剂（如IPTG）来诱导基因的表达。

5. 纤溶酶表达产物的纯化与活性鉴定通过离心、层析等技术手段，将纤溶酶表达产物从培养物中分离纯化，并进行活性测定。

结论：通过以上筛选和克隆表达方法，可以得到高活性的纤溶酶菌株，并实现其基因的克隆表达。

酶的主要提取方法及其优缺点

酶的主要提取方法及其优缺点生物工程09-1班杨桠楠0901*******1、有机溶剂沉淀是利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的。

优点：1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。

2）对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。

沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。

2、等电点沉淀是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化缺点：1）酸化时，容易引起蛋白质失活3、有机聚合物沉淀法(复合沉淀法)是在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的。

优点：1）操作条件温和，不易引起生物大分子变性。

2）沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。

3）沉淀后有机聚合物容易去除。

4、盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离常用的盐析剂: 硫酸铵优点：1）盐析能力强。

2）在水中溶解度最大（25℃时为4.1mol/L）。

而温度系数最小（对温度不敏感）。

3）价格便宜。

浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。

缺点：1）缓冲能力差2）NH4＋的存在干扰蛋白质的测定3）得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。

5、双水相萃取技术是用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。

由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。

发酵液中纤溶酶盐析法分离纯化的研究

填料价格相对较高，常污染色谱填料及减少分离的载量，难以彻底再
生，严重影响色谱填料分离度和使用寿命。因此，酶在精提纯之前，必须
先除去伴有的色素物质。本研究在纤溶酶产生菌发酵条件的优化基础
上［２］，对酶液的纯化方面进行了细致的研究，得以纯化。研究结果在其它
微生物发酵酶液的纯化方面具有一定的借鉴意义。
1. 材料与方法
７４．３５
（下转第６４页）
作者简介：韩涛（１９７２－），男，研究生，从事微生物发酵及生物制药方面研究；李宝库，通讯作者。
— ６３ —
科技信息
高校理科研究
“平面四杆机构急回特性”CAI 课件及其应用研究
宜兴技师学院蒋碧亚
［摘要］本文介绍了机械基础ＣＡＩ课件“平面四杆机构急回特性”的研制目的，结构特点和独特的动画构思，以及该课件在教学实践中的应用和教学效果。［关键词］平面四杆机构急回特性计算机辅助教学课件
脑血栓、肺血栓、急性心肌梗死等疾病严重危害人类健康，研发高
效、廉价、不良反应小的溶栓药物已成为医药界关注的热点［１］。纤溶酶是
一种催化纤维蛋白水解酶，并导致血管内凝块溶解的蛋白水解，为了阐
明它的性质、结构与功能，必须获得酶的纯品。
微生物发酵法生产的纤溶酶具有很好的溶栓效果，但发酵液中存
在的一些杂质物质给酶的分离纯化增加了难度，液相色谱精提纯方法，
１．３．１发酵液处理由于纤溶酶对热、ｐＨ较为敏感，故应在低温、自４０％，５０％，６０％、６５％、７０％，７５％，室温静置过夜，过滤，取续滤液分别测
然ｐＨ条件下进行离心。即发酵液经４℃、５０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ处理。定酶活力，得盐析曲线结果如图２。

纤维素酶的分离纯化

17
纤维素酶在造纸、草药提取等方面均有很大应用潜力。用纤维素酶适当处理纸浆，能增加微细纤维生成量和提高保水度，有可能促进某些纸张抗张力提高。
18
1. 纤维素酶作用机理有待进一步研究，由于纤维素酶的空间结构复杂，加之纤维素酶不易分离纯化、结晶难，应进一步在分离纯化技术和研究方法上进行突破。
制药1102
罗志强孟豪轩陈孟南
2/10/2020
1
1
纤维素酶的概念及其性质
2
纤维素酶的来源
3
纤维素酶的分离提纯技术
4
纤维素酶的应用
5
纤维素酶的问题与展望
2
概念
纤维素是地球上最丰富的可再生性碳源物质，其降解是自然界碳素循环的中心环节，有效利用纤维素可有效解决能源危机，可以用于生产大量化工原料，如乙醇，丁醇等，采用纤维素酶进行水解是保证无污染地将这些纤维素物质转化成简单糖的关键。纤维素酶的组分复杂，主要有内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶， β -葡萄糖苷酶 3种。给纤维素酶的分离纯化带来了一定的困难。
3
（一）分子量：45000-76000 ；最适pH ：pH4-5 ；最适温度： 40-60 ℃ 。
（二）纤维素酶各组分大多为糖纤维素酶的分子结构蛋白。
（三）纤维素酶是诱导酶，诱导物为纤维二糖。
纤维素酶
4
昆虫
真菌
软体动物
纤维素酶
原生动物
放线菌
细菌
目前研究较多的是霉菌，其中酶活力较强的菌
种为木霉、曲霉、根霉和青霉，特别是里斯木霉、
绿色木霉、康氏木霉等较为典型，是目前公认的较
好的纤维素酶生产菌。
5
纤维素酶的分离纯化
纤维素酶的组分大多为糖蛋白，工业上用于生产纤维素酶的粗酶制剂常采用硫酸铵沉淀法，酒精沉淀法，丹宁沉淀法和离心喷雾干燥等方法。但在纤维素酶的分析研究上个常采用一些列的蛋白质分离纯化技术，如分级沉淀法，凝胶过滤法等。

毒素的分离及鉴定方法

毒素的分离及鉴定方法毒素是指一类能够对生物体造成严重损害的有毒代谢产物，它们广泛存在于自然界中，包括植物、动物和微生物等生物体中，同时也可以被人工制造出来。

毒素是人类健康和农业生产中面临的一个重要问题，如何分离和鉴定毒素是非常关键的问题。

目前，主要有以下几种毒素分离和鉴定方法。

一、免疫学方法免疫学方法是一种快速、准确、灵敏的检测方法，适用于毒素含量较低的情况。

典型的免疫学方法包括免疫层析、酶联免疫吸附试验和荧光法等。

免疫层析是一种使用抗体选择性地将毒素从混合物中分离出来的方法。

在这个过程中，抗体会结合特定的毒素，并经过一系列层析步骤后，达到纯化目的。

而酶联免疫吸附试验和荧光法则是基于抗体与毒素结合的反应，可以用于确定毒素的含量。

二、质谱法质谱法是一种食品安全检测中常用的方法，可以高度灵敏地检测毒素。

它基于毒素的化学性质和分子质量的差异，通过将分离的毒素精确地测量其质量，最终确定毒素的结构和类型。

分析前，质谱法通常需要将毒素样品离子化并加速，需要借助于多个离子谱仪进行分析。

三、核酸检测方法核酸检测方法是一种快速、高效且灵敏度较高的方法，它基于特定序列PCR技术来检测和分离特定的寄生虫和毒素。

与传统方法相比，核酸检测方法不需要成分分离，可以通过简单的DNA自由形态放在样品中的不同信号来鉴定。

四、生物测定法生物测定法是一种广泛使用的方法，根据监测生物对毒素的反应来评估其毒性。

这种方法是根据生物的代谢和超标之间的拓扑关系进行的，通常衡量某种毒素的生物活性与其浓度之间的关系。

五、色谱法色谱法是一种非常常见的分离和鉴定方法，有很高的准确度和灵敏度。

它利用化学分离方法将毒素分离出来，然后通过检测分离后物质的吸收系数来确定其结构和种类。

这种方法不仅适用于毒素的分离，还可以对样品中其他有机物分析。

要分离和鉴定毒素是一个复杂的过程，同时也需要专业的知识和高度的实验技能。

不同的毒素分离和鉴定方法都有其自己的特点和适用范围，在实际应用中需要根据具体的情况进行选择。

昆虫病毒怎样分离与纯化

昆虫病毒怎样分离与纯化不同病毒的分离纯化过程并不相同，但所采用的技术大同小异，通过39蜂疗网调查发现病毒分离纯化主要是以下几种常用的通用技术。

1.差速离心所谓差速离心，就是对同一份样品，用高速、低速循环交替离心，高速使病毒沉淀；沉淀饴浆再悬浮，低速除去污染杂质，最终获得较纯净的病毒粗提物。

差速离心，可以除去大部分比病毒粒子大或小的杂质。

但与病毒粒子大小相似的颗粒却难以除尽，并且由于杂质的吸附作用，实际病毒获得量低，这是本法的缺点。

差速离心的高速、低速是相对而言的；所需的时间也因溶液的密度、黏度的不同而有变化。

2.密度梯度离心〔1）蔗糖密度梯度区带离心事先于离心管内分层注入不同密度（浓度）的蔗糖溶液，密度大的位于管底部，密度小的在顶部，形成一个蔗糖密度梯度。

将需离心分离的混合液置梯度的顶部，离心过程中，不同密度的粒子，移行到与本身密度相同的蔗糖密度部位，即不再向下移行，达到平衡状态，形成致密的沉淀带。

有时不同密度粒子尚未移到各自密度相同的梯度部位，但根据粒子大小、密度不同，沉降速度不同，已分别形成清晰的区带，亦可达到良好的分离目的，离心结束后，各区带可按次分部收集。

（2）平衡密度梯度离心将待分离的混合物，均匀地悬浮于适当浓度的重金属盐溶液中（如CsCl、RbCl等），经长时间离心，重金属盐溶液建立起稳定而连续的密度梯度。

待分离的粒子被离心力场驱入溶液密度与粒子本身密度相同的区域内，即达到平衡，从而获得了良好的分离效果。

3. 判断沉淀纯度可以根据紫外吸收光谱判断。

各沉淀组分（或沉淀带），稀释到一定浓度，分别置紫外分光光度计中，在波长200～300nm的范围内测定其紫外吸收值。

看其是否具有核蛋白的特征性光谱。

核蛋白的特征光谱为：最小吸收值在245nm左右，最大吸收值在260nm左右，260nm 于280nm吸光度的比例大干1，小于2，越接近2，纯度越高。

1。

1株纤溶酶菌株的筛选鉴定及提高产酶量的方法

菌株鉴定采用常规的形态特征、生理生化特征及分子鉴定相结合 [13-14]的方法。 1.8 突变株初筛方法的确立
诱变育种的筛选工作量很大，且纤维蛋白平板的制作成本较高，因此确定一种简单可靠的初筛方法至关重要。纤溶酶也是一种蛋白酶，对脱脂牛奶、酪蛋白也有一定的水解作用，因此采用点种法，分别以脱脂牛奶、酪蛋白、粗提血纤维蛋白为培养基主要成分，以纤维蛋白平板法的测定结果为标准，比较这 3 种初筛方法与纤维蛋白平板法的相关性，以确定一种可靠的初筛方法。 1.9 菌株的诱变及选育
1 材料与方法
1.1 样品采集本试验样品采自于齐齐哈尔市拜泉县自酿农
家豆酱制品。 1.2 培养基
富集培养基：蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，NaCl 1%，粗提血纤维蛋白 0.629%，pH 7.0，108 ℃灭菌 20 min，用于豆酱浸提液的富集培养。
LB 培养基：蛋白胨 1%，酵母粉 0.5%，NaCl 1%，pH 7.0，121 ℃灭菌 15 min，用于豆酱纤溶酶产生菌的培养。
第 11 卷第 6 期
1 株纤溶酶菌株的筛选鉴定及提高产酶量的方法研究
55
时间下的致死率及正、负突变率。选择正突变率最高的处理时间作为最佳诱变剂量[15]。从以最佳诱变剂量处理所得的突变株中筛选出 H/C 值较大的菌株，进一步采用纤维蛋白平板法测定其纤溶酶活力，并对纤溶酶活性提高最大的菌株进行遗传稳定性分析。
54
中国食品学报
2011 年第 6 期
粗提血纤维蛋白培养基：0.01 mol/L Na2HPO4，0.001 mol/L KH2PO4，粗提血纤维蛋白 0.4%，琼脂 2%，pH 7.0，108 ℃灭菌 20 min，用于突变株的初筛。

细菌分子毒素的分离与鉴定

细菌分子毒素的分离与鉴定细菌分子毒素是一种细胞外分泌物质，可以对人体组织产生严重的毒性反应。

它们通常由细菌分泌，具有不同的化学特性和毒性。

因此，对细菌分子毒素的分离和鉴定非常重要，可以帮助医生快速诊断疾病，在治疗上提供帮助和支持。

一、细菌分子毒素的分离细菌分子毒素分离的关键是选择合适的分离方法。

目前常用的分离方法有免疫技术、纯化技术、毒素类别筛选等。

1.免疫技术：免疫技术是最常见的细菌毒素分离方法之一。

通过对抗体与抗原结合来检测和识别毒素。

典型方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、质谱分析、圆二色性分析等。

这些技术可以有效地确定细菌的毒性特性，并允许我们建立一些诊断标准。

2.纯化技术：另一种分离方法是借助纯化技术。

这种技术可以通过一系列的化学反应と离心技术消除其他分子，干净、纯净的毒素物质与来自同一菌株的其他细菌有所区别。

流动相分离技术、薄层色谱法、分子过滤法、高效液相色谱法等方法都是分离细菌毒素的有效手段。

3.毒素类别筛选：以感染性病原体产毒为例，常用的毒素类别筛选技术包括多种荧光素酰基转移酶(AdoMet)酶亚型、激酶亚型、转移酶亚型等等。

这些技术可以有效地区分细菌的毒性成分，为量化毒素、提取毒素、设计合理的治疗方案提供了指导。

二、细菌分子毒素的鉴定细菌分子毒素的鉴定主要依赖于技术和工具的提升。

目前，现代分子生物学、生物化学技术以及对疫苗、保健食品、抗菌剂和消毒剂的各种试验技术都在极大地增强了细菌毒素的诊断意义。

1.多种技术综合应用：对于分离出的细菌毒素，鉴定其种类、形态以及某些特定的测量指标都是非常重要的。

因此，多种技术的综合应用更有可能提高检测准确性和灵敏度，包括纯化、酶联免疫吸附测定、微量融合聚合酶链反应等。

2.充分利用酶与免疫学反应关系：细菌分子毒素能够在体外产生很多异质之处。

利用这些异质性，我们可以建立对细菌毒素的严谨鉴定方案，同时利用这些异质性模型来验证鉴定方案的准确性、速度和优越性。

蜘蛛毒素的生物学活性研究进展

蜘蛛毒素的生物学活性研究进展浦飞飞;尹松;王晓英【摘要】蜘蛛种类繁多且多数蜘蛛能够分泌毒液，蜘蛛毒素含有多种化学成分，除毒性作用外，这些物质还具有多种活性并能对机体产生多重影响。

其药理学活性主要包括：对心脑血管系统的作用、镇痛作用、抗菌和抗癌作用等。

离子通道是生物毒素的重要作用靶标，其作用于钾通道、钙通道等不同类型以及不同亚型的钠离子通道，因此具有不同的药效作用及潜在的药用价值。

和其它毒性物种如芋螺毒素、蝎毒、蛇毒相比，蜘蛛毒素的研究相对较少，但近年来，蜘蛛毒素成为生物毒素领域新的研究热点之一，该文对蜘蛛毒素的生物学活性的最新研究进展以及在医学实践中的应用和发展进行综述。

%There are a wide variety of spiders on the earth and most them can secrete venom,which contains a variety of chemi-cal compositions that have multiple influences on organism be-sides toxic effects.The pharmacological efficiency includes cardi-ovascular and cerebrovascular activities,analgesic activities,an-tibacterial and anticancer activities etc.Ion channels are one of the important targets of spider toxins.They act on different ion channels,such as potassiumchannel,calcium channel and differ-ent subtypes of sodiumchannels.Therefore the spider toxins pres-ent different pharmacological activities and potential medicinal value.The venoms of spiders are less well studied than those from other venomous taxa such as conotoxin,scorpions and snakes etc. However,in recent years,spider toxins are turning to a new hot subject in related research areas.This review summarizes the lat-estprogress in biological activities of spider toxins as well as its application in medical practice and development.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2014(000)012【总页数】4页(P1651-1654)【关键词】蜘蛛毒素;细胞分泌;抗凝;离子通道;抗癌;抗菌【作者】浦飞飞;尹松;王晓英【作者单位】中国医学科学院药用植物研究所，北京100193;湘潭市妇幼保健院，湖南湘潭 411104;中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193【正文语种】中文【中图分类】R-05;R329.2;R384.9;R730.5;R973.2;R978;R996.3蜘蛛在全世界达4万余种，目前报道的蜘蛛成分主要来源于现存的编入目录的43 244种蜘蛛中的174种［1］，我国记载的约有3 000种，剧毒蜘蛛有10多种［2］。

单环刺螠不同部位中纤溶酶的分离纯化及其活性差异

比，体腔液为ＵＦＥ更优提取部位．
关键词：单环刺；纤溶酶；抗凝血；抗凝活性
中图分类号：Ｒ９４４；Ｑ７８６
文献标志码：Ａ文章编号：１０００?５０１３（２０２０）０１?００８４?０６
犘狌狉犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犃犮狋犻狏犻狋狔犇犻犳犳犲狉犲狀犮犲狅犳犉犻犫狉犻狀狅犾狔狋犻犮犈狀狕狔犿犲犉狉狅犿犇犻犳犳犲狉犲狀狋犘犪狉狋狊狅犳犝狉犲犮犺犻狊狌狀犻犮犻狀犮狋狌狊
酶时间均极显著延长，加入不同浓度氯化钙后，能显著延长凝血时间，同时，能够极显著降低凝血因子 Ⅴ，Ⅶ，
Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ，Ⅻ的活性及大鼠血液中的钙离子浓度；不同部位来源的ＵＦＥ活性有较大差异，与内脏及体壁肌相
收稿日期：２０１９?０３?１１
通信作者：王立强（１９７０?），男，教授，博士，主要从事药剂学和创新药物的研究．Ｅ?ｍａｉｌ：ｗｌｑ１５９９＠１６３．ｃｏｍ．基金项目：国家重点研发计划项目（２０１６ＹＦＥ０１０１７００）；福建省高校产学合作项目（２０１９Ｙ４００７）；华侨大学研究生
因子和钙离子的影响，验证不同部位ＵＦＥ的活性差异．结果表明：从秋季单环刺体腔液中提取的总蛋白质
量为３９．８ｍｇ，ＵＦＥ的比活力为４６９５．９４ｍｋａｔ·ｇ－１，纯化倍数为１３．８，明显优于内脏和体壁肌的提取所得，标准血浆、乏ＡＴ?Ⅲ血浆和乏ＨＣ?Ⅱ血浆凝血酶原时间、凝血
ＹＩＮＺｈｅ，ＬＯＮＧＳｈａ，ＺＨＡＮＧＪｉａｙｉｎｇ，ＹＵＨｕａｉｌｏｎｇ，ＷＡＮＧＬｉｑｉａｎｇ

不同提取方法比较

不同提取方法比较提取的实质就是溶质由固相传递到液相的传质过程,它以扩散理论为基础。

1.传统的浸取方法：存在着浸取时间长、劳动强度大、原料预处理能耗大、热敏性组分易破坏等缺点，（如索氏提取法中，虽然溶剂用量不大，但需要进行长时间的加热提取）。

但由于操作简单，人员设备要求不高，目前依然在工业生产中普遍使用。

但在传统提取方法中，活性成分的纯化方法，活性成分种类以及成分的化学变化等应该成为进一步研究重点。

2.冷提法(冷浸、渗漉)：避免了加热，从而使其中的有效成分有了一定的安全性，但冷浸法和渗漉法所用的溶剂量较大，提取时间也较长，操作较麻烦。

3.超临界CO2萃取法：提取速度快且安全性高，但目前国产的超临界萃取设备容积偏小，无法满足工业化生产的需要，而进口设备价格十分昂贵。

此外，超临界CO2萃取适用于非极性化合物的分离。

4.超声波辅助提取法：提取效率高，提取时间短，但是超声波作用能断开碳-碳键，从而产生活性较强的自由基，破坏活性成分，降低提取物的稳定性。

5.微波辅助提取法：选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少，但设备泄漏的微波辐射会给人体造成慢性损伤。

（微波法和超声波法提取目前仅限于少量提取实验，还不具备工业化大生产）6.分子印迹法：中药成分的多样性导致其有效成分的提取过程十分繁琐，应用分子烙印聚合物的这种特异亲合性，针对某一类成分进行直接提取，简化步骤，但该技术可行的前提条件是中药功效成分能和合适的功能单体形成如氢键、离子对等分子间作用，这也体现了分子烙印技术应用中存在的局限性。

7.匀浆法：将含一定量水的鲜果与提取溶剂在匀浆提取装置中混合匀浆，通过机械及液力剪切作用将物料撕裂和粉碎，使物料破碎和有效成分的提取同步进行，以达到对植物有效成分快速、强化提取的目的。

匀浆提取法较常规回流提取法具有提取率高、提取时间短、溶剂用量少、成本低的优点。

匀浆提取省去了对物料进行烘干、粉碎的步骤，操作简单，对其它新鲜植物材料中天然产物的提取具有借鉴意义。

雷氏大疣蛛毒素对神经胶质瘤U87的抑制作用

雷氏大疣蛛毒素对神经胶质瘤U87的抑制作用杜杰杰;宋利超;刘晓鹏;辛欣;闫丹丹;高莉【期刊名称】《延安大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(035)002【摘要】直观的观察雷氏大疣蛛毒素促进神经胶质瘤U87凋亡的形态学变化.首先用蛋白印迹法检测合适的雷氏大疣蛛毒素浓度处理U87细胞,再用该浓度毒素处理U87细胞不同时间;用100pg/mL的雷氏大疣蛛毒素作用48 h诱导神经胶质瘤U87细胞凋亡,然后用倒置相差显微镜,Gimsa染色法,吖啶橙/嗅化乙锭(AO/EB)双重荧光染色法以及流式细胞法,从最直观的形态学上观察雷氏大疣蛛毒素促进神经胶质瘤U87凋亡的形态学变化.实验组的细胞出现很明显的凋亡小体,细胞膜不会破裂,细胞质不会流出,细胞核含有固缩核片段等细胞凋亡的形态学上的特征.雷氏大疣蛛毒素作用神经胶质瘤U87细胞后的形态学的变化,基本包括了细胞凋亡的主要的形态学特征.说明雷氏大疣蛛毒素是通过促进神经胶质瘤U87细胞凋亡从而抑制细胞的增殖.【总页数】5页(P59-63)【作者】杜杰杰;宋利超;刘晓鹏;辛欣;闫丹丹;高莉【作者单位】河北师范大学生命科学学院药用动物学实验室,河北石家庄050024;河北师范大学生命科学学院药用动物学实验室,河北石家庄050024;河北师范大学生命科学学院药用动物学实验室,河北石家庄050024;河北师范大学生命科学学院药用动物学实验室,河北石家庄050024;河北师范大学生命科学学院药用动物学实验室,河北石家庄050024;河北师范大学生命科学学院药用动物学实验室,河北石家庄050024【正文语种】中文【中图分类】R739.4【相关文献】1.雷氏大疣蛛毒素组分13对人宫颈癌细胞增殖的抑制作用 [J], 靳袆;王恩军;郭晓军;袁洪水;朱宝成2.雷氏大疣蛛蜘蛛毒素对人肺癌细胞A549增殖的影响 [J], 胡增祥;杜昱蕾;刘全喜;王媛;李亮3.雷氏大疣蛛毒素对间充质干细胞增殖的影响 [J], 宋利超;杜杰杰;刘晓鹏;辛欣;闫丹丹;高莉4.新型抗虫活性肽雷氏大疣蛛毒素4596的纯化与鉴定 [J], 唐灵芳;王素娥;刘宇;熊梦玲;刘玲;曾雄智5.雷氏大疣蛛毒素溶栓活性测定及纤溶蛋白的分离 [J], 张园;刘春燕;李海涛;赵朝贤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达

高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达
高活性纤溶酶菌株的筛选与基因克隆表达是一项重要的研究工作，可以通过该研究获取具有高纤溶酶活性的菌株，为纤溶酶的产业化应用提供有力的支持。

本文将从菌株筛选和基因克隆表达两个方面探讨高活性纤溶酶菌株的研究方法。

菌株筛选是高活性纤溶酶菌株研究的首要步骤，可以通过以下几种方法来进行：
第一种是传统的筛选方法，即通过对不同来源的土壤或水样进行分离和培养，结合纤溶酶活性检测方法，筛选出具有高纤溶酶活性的菌株。

这种方法简单易行，但是筛选效率较低。

第二种是通过筛选新颖的环境样品，如深海沉积物、温泉、矿山等特殊环境样品进行筛选。

这些环境样品中可能存在着与常规土壤或水样中不同的菌株，具有更高的纤溶酶活性。

第三种是通过改进培养条件来筛选菌株。

可以通过优化培养基的成分和培养条件，如温度、pH值、氧气浓度等来提高纤溶酶的合成和分泌。

通过这种方法，可以筛选出在特定条件下具有高纤溶酶活性的菌株。

基因克隆表达是高活性纤溶酶菌株研究的另一个重要方面，可以利用重组DNA技术将纤溶酶基因从菌株中克隆并表达。

具体步骤如下：
需要获取纤溶酶基因的DNA序列。

可以通过文献检索或基因测序技术获得。

然后，将纤溶酶基因的DNA序列插入到适当的表达载体中，如质粒或病毒基因组。

接着，将重组载体转化到宿主菌中，如大肠杆菌。

利用适当的选择标记筛选出带有纤溶酶基因的菌落。

随后，通过培养和诱导表达，使宿主菌中的纤溶酶基因得以表达并产生高活性的纤溶酶。

通过纤溶酶活性检测方法，如酶活性测定、酶联免疫吸附试验等，对表达的纤溶酶进行定量和鉴定。

产纤溶酶菌株的分离筛选

文章编号:1000-1573(2008)01-0056-04产纤溶酶菌株的分离筛选郑丽伟, 于宏伟, 贾英民(河北农业大学食品科技学院,河北保定071001)摘要:以脱脂奶粉作为初筛底物,纤维蛋白作为复筛底物,透明圈作为筛选标记,从肉联厂,污水沟等地筛选出产纤溶酶的菌株40株,从中筛选出产酶活力最高的2号菌株,将其编号为ZL W -2,并采用改进的紫外分光光度法测酶活,提高了酶活测定的精确性,对提高纤溶酶产生菌的筛选效率有重要意义。

菌株ZL W-2的发酵过程研究表明,纤溶酶是在菌体大量生长以后酶活力才开始增加。

关键词:纤溶酶;菌株;筛选中图分类号:Q 933文献标识码:AScreening of fibrinolytic enzyme producing strainZHEN G Li wei,YU H ong wei,JIA Yin g min(College of Food Science and T echnology ,Agr icultur al U niv ersity of Hebei,Baoding 071001,China)Abstract:Forty fibrinolytic enzyme producing strains w ere isolated from shambles,sew age farm and so on,using the soluble circle as screening marker.The basal medium w ith skim milk was used as the first screening medium and the fibrin pow der w as used as the second screening medium.Strain 2which had the highest fibrinolytic enzym e w as chosen and numbered ZLW - 2.Moreover,the method of measuring enzyme activity w as renovated and the curve of enzy me production w as primar ily studied.Ultraviolet photometry w as adopted to measure enzym atic activity in the experiment,which had improved accuracy of the measurement and had great significance for improving efficiency of screening strains producing fibrinoly tic enzyme.The fermentation process of ZLW-2indicated that the activ ity of fibrinolytic enzyme increased after m ass grow th of thali.Key words:fibrinolytic enzyme;strain;screening 血栓栓塞性疾病是涉及到血液和循环系统的一种疾病,其致残率和致死率均比较高[1]。

中国异纺蛛科蜘蛛研究进展

中国异纺蛛科蜘蛛研究进展何苗;李成功;杨志斌;巫秀美;杨自忠【摘要】异纺蛛科Hexathelidae蜘蛛是一类结漏斗状网的,也是一类重要的产毒动物.多年的研究结果显示,我国现已记述异纺蛛科蜘蛛仅1属13种,即版纳大疣蛛Macrothele bannaensis Xu&Yin,2001、巨大疣蛛M.gigasShimojana&Haupt,1998、贵州大疣蛛M.guizhouensis Hu&Li,1986、霍氏大疣蛛M.holsti Pocock,1901、勐仑大疣蛛M.menglunensis Li&Zha,2013、湖南大疣蛛M.hunanica Zhu&Song,2000、单卷大疣蛛M.monocirculata Xu et Yin,2000、触形大疣蛛M.palpator Pocock,1901、雷氏大疣蛛Macrothele rav-eni Zhu,Li&Song,2000、简大疣蛛M.simplicata(Saito,1933)、台湾大疣蛛M.taiwanensis Shimojana&Haupt 1998、颜氏大疣蛛M.yani Xu,Yin et Griswold,2002和云南大疣蛛M.yunnanica Zhu&Song,2000.通过对雷氏大疣蛛Macrothele raveni Zhu,Li&Song,2000蛛毒的研究,结果显示雷氏大疣蛛Macrothele raveni Zhu,Li&Song,2000的蛛毒具有较好的纤溶作用,并对人肝癌、肺癌、宫颈癌细胞具有明显的抑制作.本文对国内异纺蛛科蜘蛛的区系分类研究和蛛毒的开发利用研究进行综述.【期刊名称】《楚雄师范学院学报》【年(卷),期】2018(033)003【总页数】4页(P46-49)【关键词】大疣蛛属;蛛毒;雷氏大疣蛛;癌细胞【作者】何苗;李成功;杨志斌;巫秀美;杨自忠【作者单位】云南省昆虫生物医药研发重点实验室,云南大理 671000;中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心,云南大理 671000;大理大学昆虫生物医药研究院,云南大理 671000;云南省昆虫生物医药研发重点实验室,云南大理671000;药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心,云南大理 671000;大理大学昆虫生物医药研究院,云南大理 671000;药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心,云南大理 671000;中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心,云南大理 671000;大理大学昆虫生物医药研究院,云南大理 671000;云南省昆虫生物医药研发重点实验室,云南大理 671000;中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心,云南大理 671000;大理大学昆虫生物医药研究院,云南大理671000;云南省昆虫生物医药研发重点实验室,云南大理 671000;药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心,云南大理 671000;大理大学昆虫生物医药研究院,云南大理 671000【正文语种】中文【中图分类】Q959.226.2异纺蛛又被称为漏斗网蜘蛛(funnel-web spiders)，体中到大型的蜘蛛，是原蛛类的重要类群之一。

高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达

高活性纤溶酶菌株筛选与基因克隆表达高活性纤溶酶（Fibrinolytic enzyme）是一种能够降解纤维蛋白聚合物的酶类，具有重要的应用价值。

本文旨在介绍高活性纤溶酶菌株的筛选与基因克隆表达方法。

纤溶酶产生菌株的筛选可采用传统的筛选方法，如菌落筛选、液体培养筛选等。

在筛选菌株过程中，需要注重菌株的纤溶酶活性和产酶能力。

一般可采用琼脂酶纤维素（CMC）平板培养基，将菌株接种在该培养基上，培养一定时间后，通过印迹法或其他方法，观察菌落的透明圈，透明圈越大表示纤溶酶活性越高。

菌株筛选后，需要进行基因的克隆表达。

需要进行菌株的DNA提取工作。

一般可采用常规的细菌DNA提取试剂盒进行提取，如使用酚/氯仿法提取DNA。

提取出来的DNA需要进行酶切，将目标基因片段从总DNA片段中分离出来。

接下来，需要构建目标基因片段的表达载体。

可选择适当的质粒载体，如pET28a等常用的表达载体。

将目标基因片段和载体进行酶切，然后进行连接反应，将目标基因片段插入载体中。

连接后的质粒需要进行转化，转化到大肠杆菌等宿主细胞中。

将连接后的质粒和大肠杆菌进行共培养，使质粒进入大肠杆菌细胞内。

转化后的细菌需要进行筛选，通常采用抗生素筛选法。

将转化后的细菌接种到含有抗生素的平板培养基上，只有带有目标基因的细菌能够生长，从而筛选出含有目标基因的细菌克隆。

进行表达与纤溶酶活性测定。

将含有目标基因的细菌进行培养，经过诱导表达后，收集菌体，进行纤溶酶活性的测定。

在表达过程中，还可以对目标基因进行改造，以提高纤溶酶的表达效率和稳定性。

可以通过点突变、插入、缺失等方法进行基因工程操作。

高活性纤溶酶菌株的筛选与基因克隆表达是一项复杂而重要的工作。

通过仔细的实验设计和操作，可以筛选出高产纤溶酶的菌株，并通过基因克隆表达方法实现纤溶酶的高效表达与功能研究。

雷氏大疣蛛毒素抗肿瘤蛋白组分的分离纯化及活性鉴定的开题报告

雷氏大疣蛛毒素抗肿瘤蛋白组分的分离纯化及活性鉴定的开题报告标题：雷氏大疣蛛毒素抗肿瘤蛋白组分的分离纯化及活性鉴定一、研究背景和意义随着肿瘤时代的到来，抗肿瘤治疗逐渐引起人们的关注。

在过去的几十年里，南美各国的医学家对雷氏大疣蛛(Phoneutria nigriventer) 的毒液进行了多方面的研究，发现其具有潜在的抗肿瘤活性。

雷氏大疣蛛毒液中含有多种抗肿瘤物质，其中的蛋白组分尤其值得研究。

因此，本研究旨在分离纯化雷氏大疣蛛毒素抗肿瘤蛋白组分，并进行活性鉴定，为抗肿瘤药物的研发提供新的方向和思路。

二、研究内容和方法1.雷氏大疣蛛毒素抗肿瘤蛋白组分的分离纯化通过对雷氏大疣蛛毒液进行离子交换层析、凝胶层析等分离纯化方法的组合使用，获得具有较高纯度的雷氏大疣蛛毒素抗肿瘤蛋白组分。

2.抗肿瘤活性的鉴定通过MTT法和细胞流式细胞术等方法，研究蛋白组分抗肿瘤活性的大小和机制。

三、预期结果和意义本研究预期可以获得具有较高纯度的雷氏大疣蛛毒素抗肿瘤蛋白组分，通过抗肿瘤活性的鉴定，揭示其抗肿瘤机制，为研发新型的抗肿瘤药物提供理论基础和实验依据。

同时，本研究可以丰富人们对雷氏大疣蛛毒素抗肿瘤作用的认识，为进一步研究其化学成分和药效机理提供新的思路和方法。

四、进度计划第一年：完成雷氏大疣蛛毒素抗肿瘤蛋白组分的分离纯化工作，并初步探讨其抗肿瘤活性机制。

第二年：进一步发掘、分析蛋白组分的抗肿瘤作用机理，进一步优化和提高分离纯化的工艺技术。

第三年：在前两年的基础上，深入研究蛋白组分的抗肿瘤作用机制，并拓展其临床应用前景。

五、参考文献1. Matos LL, Miranda-Vilela AL, Menezes TP, Ventura AM, de Souza CT, Baroni AC et al. (2015). Evaluation of antitumor activity, cytotoxicity and action mechanism of extracts obtained from Piper aduncum and Piper obliquum against murine myeloma cells. GMR 14(2): 3054-3064.2. Amaral JB, Pezzuto P, Meirelles FV, Moura AA, Mendonça JS, Santos RA, Assunção NA, Lopes LJ, Santos EP, Cassali GD (2015). Comparative analysis of the antimicrobial activity of camel milk with respect to cow milk. Veterinary Journal 205(2): 319-321.3. Liang M, Li X, Yang J, Chen J, Chen G, Chen J, Wang H, Yu J,Liu Y, Liu H, Liu G (2016). Anti-cancer effects of Angelica sinensis on osteosarcoma cell lines. Journal of Pharmacological Sciences 131(4):223-231.。

雷氏大疣蛛蜘蛛毒素对人肺癌细胞A549增殖的影响

雷氏大疣蛛蜘蛛毒素对人肺癌细胞A549增殖的影响胡增祥;杜昱蕾;刘全喜;王媛;李亮【摘要】背景与目的雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作为新药有可能用于癌症的治疗,本研究旨在探讨雷氏大疣蛛蜘蛛毒索对人肺癌细胞4549的作用及机理.方法应用MTT 法检测雷氏大疣蛛蜘蛛毒素对人肺癌细胞A549增殖的影响,比色法检测过氧化氢酶活性,改良的硫代巴比妥酸荧光法检测丙二醛含量;流式细胞仪检测细胞凋亡率.采用免疫印迹分析A549细胞中P38MAPK蛋白的表达.结果雷氏大疣蛛蜘蛛毒素可抑制A549细胞增殖,使CAT活性和MDA的形成增加,且使P38MAPK的表达较对照组明显增多.结论雷氏大疣蛛蜘蛛毒素抑制A549细胞增殖可能与CAT活性和MDA的形成增加以及P38MAPK的表达降低相关.【期刊名称】《中国肺癌杂志》【年(卷),期】2010(013)010【总页数】4页(P933-936)【关键词】A549细胞;雷氏大疣蛛蜘蛛毒素;P38MAPK;抗癌药物【作者】胡增祥;杜昱蕾;刘全喜;王媛;李亮【作者单位】050041,石家庄,解放军第260医院内一科;050041,石家庄,解放军第260医院内一科;056002邯郸,河北省邯郸市第一医院胸外科;050011石家庄,河北师范大学生命科学学院;050011石家庄,河北师范大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】R734.2肺癌是常见的恶性肿瘤之一，近年肺癌的发病率和死亡率都有明显的增高趋势[1]。

氧化应激反应与肺癌的发生相关。

由于多环芳烃会产生活性氧，以及代谢成毒性中间体，可以通过检测过氧化氢酶（catalase, CAT）活性以反映氧化应激相关的信号。

丙二醛（malondialdehyde, MDA）是脂质过氧化物的代谢产物。

P38MAPK 是MAPK家族的重要成员之一，在、应激状态下，与炎症反应及细胞凋亡关系密切。

已有文献报道了蛇毒[2,3]、蜂毒[4,5]和蝎毒[6]的抗肿瘤作用。