基于活性肽Ii-Key与异种病毒抗原表位的疫苗设计及其免疫效应

Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ Ｉｉ－Ｋｅｙ ｈｙｂｒｉｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｍｕｌｔｉ－ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ＸＵ Ｓｈａｎ－ｓｈａｎ１，ＳＵＮ Ｆｅｉ－ｆｅｉ ２，ＷＵ Ｙａ－ｒｏｎｇ１，ＹＥ Ｈｏｎｇ３，ＬＩ Ｊｉｎ－ｎｉａｎ１，ＬＩＵ Ｘｕｅ－ｌａｎ１＊ （１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏ－
液上清用 Ｎｉ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ６Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ 镍层析柱 （ＧＥ
表 １ 引 物 序 列
目的片段 ＶＰ２／ＨＮ
Ｉｉ－Ｋｅｙ／ＶＰ２／ＨＮ
抗原或小分 子 多 肽 与 ＭＨＣⅡ 分 子 进 行 有 效 聚 合， 激活特 异 性 Ｔ 细 胞，刺 激ＩＦＮ－γ 分 泌，有 效 增 强 细 胞免疫和体液免疫 。 ［４］
传染 性 法 氏 囊 病 病 毒 （ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，ＩＢＤＶ）和 新 城 疫 病 毒 （Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ， ＮＤＶ）是 常 见 危 害 鸡 群 的 重 要 传 染 性 疾 病 的 病 原。 ＩＢＤＶ ＶＰ２ 蛋 白 的 １９７ＣＤＳＳＤＲＰＲＶＹＴＩＴ２０９ 和 ＮＤＶ ＨＮ 蛋 白 的 ３４６ＤＥＱＤＹＱＩＲ３５３ 肽 分 别 为 两 者的线性 中 和 表 位［５－６］，为 了 进 一 步 探 讨 Ｉｉ－Ｋｅｙ 能 否同时携带２种病毒的抗原表位并有效提高对不同
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中 国 兽 医 学 报 ２０１４年９月 第３４卷 第９期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ Ｓｅｐ．２０１４ Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．９
基 于 活 性 肽Ｉｉ－ Ｋｅｙ与 异 种 病 毒 抗 原 表 位 的 疫 苗 设 计 及 其 免 疫 效 应
徐姗姗１，孙菲菲２，吴亚荣１，叶 红３，李槿年１，刘雪兰１＊ （１．安徽农业大学 安徽省 人 兽 共 患 病 重 点 实 验 室，
＊ 通 讯 作 者 ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｘｕｅｌａｎ＠ａｈａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
中 国 兽 医 学 报 ２０１４年９月 第３４卷 第９期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ Ｓｅｐ．２０１４ Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．９
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主 要 组 织 相 容 性 复 合 体 （ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉ－ ｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）Ⅱ 类 分 子 在 抗 原 递 呈 细 胞 中 结合抗原肽并将其 递 呈 到 细 胞 表 面，激 活 免 疫 应 答 反应［１］，而 在 结 合 抗 原 肽 之 前 需 要 伴 侣 分 子 － 恒 定 链（ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ，Ｉｉ）占据其 α、β链的抗原结合槽， 在内质网中形成九聚体［２］。１９９７ 年，Ａｄａｍｓ等［３］报 道了Ｉｉ链的 ＣＬＩＰ 区和跨膜区间有增强抗原递呈活 性的关 键 活 性 基 团 （Ｉｉ－Ｋｅｙ）结 构。 近 些 年，Ｉｉ－Ｋｅｙ 作为重要的免疫载 体 和 调 节 剂，能 够 携 带 单 一 蛋 白
１．２ 嵌合体重组质粒的表达、鉴定及蛋白纯化 挑 取单克隆重组菌 接 种 Ａｍｐ＋ ＬＢ 液 体 培 养 基，３７℃ 振荡培养，加入适量的ＩＰＴＧ 诱导后收 集 菌 体，通 过 反复冻融和超 声 波 裂 解 细 胞，离 心 后 分 别 收 集 上 清
和沉淀以１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 凝 胶 电 泳 对 融 合 蛋 白 表 达 形 式 进 行 鉴 定 。 对 重 组 蛋 白 大 量 诱 导 表 达 ，取 裂 解
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ （Ｉｉ）ｉｓ ａ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓⅡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｋｅｙ ｍｏｔｉｆ ｏｆ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ ｎａｍｅｄ Ｉｉ－Ｋｅｙ ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅ－ ｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ Ｉｉ－Ｋｅｙ ｈｙｂｒｉｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｖｉｒａｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ，ｗｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｉｉ－Ｋｅｙ ｈｙｂｒｉｄ ｏｆ ＶＰ２ （ａａ１９７－ ２０９）ａｎｄ ＨＮ （ａａ３４５－３５３），ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅｎ，ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｗａｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＳＰＦ ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉ－ ｍｅｎｔａｌ ａｎｉｍａｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ），ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ Ｉｉ－Ｋｅｙ ｈｙｂｒｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅａｔｌｙ ｂｙ １３．７２ｔｉｍｅｓ，ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅ Ｉｉ－Ｋｅｙ／ＶＰ２／ＨＮ ｈｙｂｒｉｄ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｅｕ－ ｋａｒｙｏｔｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１，ｔｈｅｎ ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ＭＨＣⅡαｉｎｔｏ ２９３Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｎｏ ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｅｐｉｔｏｐｅ－ｐｅｐｔｉｄｅ ＶＰ２／ＨＮ ａｎｄ Ｉｉ－Ｋｅｙ／ＶＰ２／ＨＮ．Ｏｕｒ ｓｔｕｄｙ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｉｉ－Ｋｅｙ ｈｙｂｒｉｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｍｕｌｔｉ－ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｃａｎ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｐｏｎｓｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｎｅｅｄｓ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ；ｈｙｂｒｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ；ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｅｖｅｌ；ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
１ 材料与方法
１．１ Ｉｉ－Ｋｅｙ与病 毒 表 位 嵌 合 体 的 构 建 及 基 因 合 成 根 据 小 鼠 Ｉｉ－Ｋｅｙ 四 肽 （ＬＲＭＫ）的 氨 基 酸 序 列 及 ＶＰ２（ａａ１９７－２０９）［５］和 ＨＮ（ａａ３４５－３５３）［６］多 肽 表 位 的氨 基 酸 序 列 设 计 嵌 合 体 （命 名 为 Ｉｉ－Ｋｅｙ／ＶＰ２／ ＨＮ）和串联表 位 （ＶＰ２／ＨＮ）（图 １），串 联 表 位 通 过 ＡＡＹ 柔性肽进行连接。
安徽 合肥 ２３００３６；２．中国农业大学 动物医学院，北京 １０００８３；３．安徽省医学科学研究所，安徽 合肥 ２３００６１）
摘要：跨膜糖蛋白恒定链在抗原递呈细胞内主要 参 与 主 要 组 织 相 容 性 复 合 体 （ＭＨＣ）Ⅱ 类 分 子 与 抗 原 肽 复 合 物 的 装配，其关键活性基团（Ｉｉ－Ｋｅｙ）在此过程中发挥重要作 用。为 了 研 究Ｉｉ－Ｋｅｙ携 带 异 种 病 毒 抗 原 表 位 能 否 有 效 增 强 机体的免疫应答，本试验首先构建Ｉｉ－Ｋｅｙ与鸡传染性 法 氏 囊 病 病 毒 ＶＰ２ 肽 表 位 （ａａ１９７－２０９）和 新 城 疫 病 毒 ＨＮ 肽 表位（ａａ３４５－３５３）的嵌合体，并将嵌合体基因插入 ｐＥＴ－３２α原核表达载 体，转 化 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ诱 导 表 达，用 镍 柱 亲 和层析纯化融合蛋白，免疫 ＳＰＦ 级 ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，分别通过间接 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 和 免 疫 印 记 试 验 检 测 小 鼠 体 内 的抗体水平和融合蛋白的反应原性。结果表明，与 ＶＰ２／ＨＮ 串联表位对照组相比较，Ｉｉ－Ｋｅｙ／ＶＰ２／ＨＮ 嵌合 体 疫 苗 处理组抗体效价平均提高了１３．７倍。通过将嵌合体基因导入 ｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１真核表达载 体 与 ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ＭＨＣⅡα 共转染２９３Ｔ 细胞，结果表明Ｉｉ－Ｋｅｙ／ＶＰ２／ＨＮ 嵌合体与 ＶＰ２／ＨＮ 和 空 载 体 蛋 白 在 细 胞 内 均 呈 现 弥 散 状 ，与 ＭＨＣ Ⅱ类分子共定位无明显差异。综上所 述，Ｉｉ－Ｋｅｙ能 够 携 带 异 种 病 毒 串 联 抗 原 表 位 有 效 增 强 免 疫 应 答 ，其 增 强 机 制 还有待于进一步研究。 关 键 词 ：Ｉｉ－Ｋｅｙ；嵌 合 体 疫 苗 ；抗 体 水 平 ；细 胞 转 染 中 图 分 类 号 ：Ｓ８５２．４ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００５－４５４５（２０１４）０９－１４４８－０５
图 １ 嵌 合 体 构 成 示 意 图
பைடு நூலகம்
Ｉｉ－Ｋｅｙ／ＶＰ２／ＨＮ 的 基 因 序 列 通 过 ＴａＫａＲａ 生 物公司 合 成，并 插 入 ｐＭＤ１９－Ｔ 载 体 中。 以 合 成 的 ｐＭＤ１９－Ｔ－Ｉｉ－Ｋｅｙ／ＶＰ２／ＨＮ 重 组 质 粒 为 模 板，设 计 ２对 特 异 性 引 物 （表 １），通 过 ＰＣＲ 分 别 扩 增 ＶＰ２／ ＨＮ 和Ｉｉ－Ｋｅｙ／ＶＰ２／ＨＮ 的基因片段，通过胶回收试 剂盒 （ＴａＫａＲａ）回 收 目 的 片 段，并 与 ｐＥＴ－３２α 原 核 表 达载体分别经 ＥｃｏＲ Ⅰ和 ＳａｌⅠ双切酶，按常规方 法连接、转 化 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｓｅｔａ菌，通 过 菌 液 ＰＣＲ、双 酶切和基因测序等方法筛选鉴定重组质粒。
＊ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｘｕｅｌａｎ＠ａｈａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ