微生物的分离和纯培养无菌技术无菌技术
第二章 微生物的纯培养
干燥保藏法 将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料 上保藏。 如砂土管保藏法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真 菌保藏，保藏时间几至几十年。
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称 斜面低温保藏法 石蜡油封存法 主要特点 传代培养，4℃保藏 石蜡油隔绝空气，室温或 4℃保藏 沙土管作载体，干燥器中抽 真空，室温或4℃保藏 适用范围 各种微生物的短期保藏。 各种微生物的中短期保藏， 不适用某些能分解烃类的菌 种。 产孢子微生物和芽孢细菌的 长期保藏，不适用对干燥敏 感的微生物 保藏期 1-6个月 1-2年
微生物学
第二章 微生物的纯培养和显微技术
基本概念
1、微生物的纯种分离：
将多种混杂的微生物，经某种技术或方法分离 或纯化的过程。
2、微生物的培养物（culture)：
在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物 群体。 纯培养物（pure culture)：在人为规定的条件下 培养、繁殖得到的只有一种微生物的培养物。
方
法
1、传代培养保藏方法
①斜面低温保藏法
方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。 低温可减缓生长速度，单细胞仍有一定的活动条
件，一般4～6个月必须传代一次。
优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。 缺点：时间短、传代多、易退化。
②石蜡油低温保藏法：
原理：在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡， 达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态， 同时石蜡油还防止水分蒸发，
第一节 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术（aseptic technique）
在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他
微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为
《微生物学》课程学习指南
《微生物学》课程学习指南微生物学是研究微生物在一定条件下的形态结构，生理生化、遗传变异及其微生物的进化、分类、生态等生命活动规律及其应用的一门学科。
由于微生物（包括病毒）是最简单的生命体而又具有高等生物的基本生命过程，是研究生命现象的基本模式生物，并在人类的生存和社会发展中起着不可替代的作用，生命科学中的许多重大发现、重大理论和技术的突破和证实大多来自对微生物的研究，因此微生物学已经成为几乎所有生命科学研究的基础。
今天的学生，如果不懂得、不熟悉微生物学，不掌握微生物学的基本技能，想要学好其它生命科学专业课程是不可想象的。
微生物学课程也因此成为综合性大学和师范院校生物学系及医、药、农、林、食品等有关专业的必修专业基础课。
本课程由54学时的理论教学和54学时的实验教学二个相对独立的部分组成。
其中理论教学将指定教材中15章的内容融汇为12讲，使学生通过学习微生物的形态结构、生理生化、生长繁殖、遗传变异、生态分布、传染免疫、分类鉴定以及微生物与其他生物的相互关系及其多样性，在工、农、医等方面的应用，了解该学科的发展前沿、热点和问题，牢固掌握微生物学的基本理论和基础知识，了解微生物的基本特性及其生命活动规律，为今后的学习及工作实践打下宽厚的基础。
微生物学实验的主要任务是使学生在理论课学习的基础上，将理性知识与感性认识实现有机结合，牢固掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术。
使学生在学习结束后具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能，并使他们综合能力与创新意识有全面的提高。
这里只介绍理论课教学的重点和学习要求理论课教学一共54学时，由12章组成，每章的学习重点或者学习要求用蓝色字体标注第一章绪论（4个学时）一、武汉大学“微生物学”课程的建设与发展二、本学期的教学安排三、微生物与我们（简要了解微生物与人类生活的关系）四、微生物的发现和微生物学的建立与发展（重点掌握巴斯德、柯赫对微生物学建立与发展的贡献，同时了解其他著名科学家的工作）（一）微生物的发现（二）微生物学的奠基1.巴斯德2.柯赫（三）微生物学发展过程中的重大事件（四）20世纪的微生物学（五）微生物学在生命科学发展中的重要地位（重点）1．微生物是生物学基本理论研究中的理想实验对象2．对生命科学研究技术的贡献3．微生物与“人类基因组计划”（五)我国微生物学的发展（六）21世纪微生物学展望五、微生物的类群及特点（简要了解微生物的基本特征）第二章纯培养和显微技术（3－4个学时）第一节微生物的分离和纯培养（整个课程学习的最重要内容之一，重点掌握在各种条件下分离并获得微生物的纯培养的方法及原理、为什么说无菌技术和纯培养技术是微生物学研究与应用的基础）一、无菌技术（重点，结合实验课相关内容学习）1. 微生物培养的常用器具及其灭菌2. 接种操作二、用固体培养基分离纯培养（重点）1. 稀释倒平板法2. 涂布平板法3. 平板划线法4. 厌氧微生物的分离三、用液体培养基分离纯培养（了解）四、单细胞（孢子）分离（了解）五、选择培养分离（重点）1. 利用选择平板进行直接分离2. 富集培养六、二元培养物（了解二元培养物的概念，它虽然由二种生物构成，但也是微生物纯培养的一种形式）第二节显微镜和显微技术（结合实验课内容掌握各种显微镜的基本原理和样品制备技术）一、显微镜的种类及原理1. 普通光学显微镜2. 暗视野显微镜3. 相差显微镜4. 荧光显微镜5. 透射电子显微镜6. 扫描电子显微镜7. 扫描隧道显微镜二，显微观察样品的制备（结合实验课内容及显微镜的原理，这部分内容在理论课上可以省略不讲）第3章微生物类群与形态结构（10－11个学时）本章由教材上的第二章第三节、第三章第一节，以及第十三章的部分内容组成第一节细菌一、一般形态及细胞结构（一）个体形态与排列（细了解菌的形态有哪些，如何通过实验区分细菌的正常和异常形态）（二）大小（三）细胞的结构（）1、细胞壁（重点）2、细胞膜（重点）3、细胞质和内含物（应知道有哪些内含物及其最基本的生物学意义，比如说，贮藏物，能够举例就可以，不必将所有的全部背下来）1）概念2）贮藏物3）磁小体4）羧酶体5）气泡6）载色体7）核糖体8）质粒4、核区（nuclear region or area）5、特殊的休眠构造——芽胞（重点掌握芽胞的基本特性和耐热机制，为什么可以利用伴胞晶体作为生物杀虫剂。
名词解释
1、Pure culture：微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代，称纯培养。
所得培养物成为纯培养物。
1.无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染，自身也不污染操作环境的技术称为无菌技术。
2.菌落：固体培养基中，单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团是菌落。
3.平板：是被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基形式，是冷却凝固后固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面称作平板。
4.发酵：发酵是指在无氧条件下，底物脱氢后产生的还原力[H]不经过呼吸链传递而直接交给某一内源氧化性中间代谢产物的一类低效产能反应。
5.培养基：人工配制的、适合微生物生长、繁殖和产生代谢产物用的混合营养基质。
1．微生物：是一类个体微小、结构简单的低等生物。
包括原核微生物、真核微生物以及属于非细胞类的病毒和亚病毒。
2．病毒：病毒粒子指成熟的、结构完整和有感染性的单个病毒,基本成分为核酸和蛋白质。
3．营养：指生物体从外部环境中摄取对其生命活动必需的能量和物质，以满足正常生长和繁殖需要的一种最基本的生理功能。
４．无氧呼吸: 底物按常规方式脱氢后，经部分呼吸链递氢，最终由无机化合物或有机化合物接受氢的过程称无氧呼吸。
5．同步生长：这种通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态，就称同步生长。
1.微生物学：研究微生物形态构造以及生命活动规律的学科叫做微生物学。
2.噬菌斑:由于噬菌体粒子对敏感菌宿主细胞的侵染和裂解，而在菌苔上形成具有一定大小、形状、边缘的透明圈，称为噬菌斑。
3.溶源性: 温和噬菌体侵入宿主细胞后，由于基因组整合到宿主细胞的基因组上，与宿主细胞 DNA 同步复制，因此，一般情况下不引起宿主细胞裂解，这称为溶源性。
4.转化：受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象，就称转化。
5.消毒：消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌。
微生物的分离和纯培养
在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture)，而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pure culture)。
由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
一、无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。
因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptic technique)，它是保证微生物学研究正常进行的关键。
1、微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿(culture dish，petri dish)等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不合任何生物。
培养微生物的营养物质[称为培养基(culture medium)]可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。
为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。
而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。
2、接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。
由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。
微生物的分离、接种和培养技术
微生物的分离、接种和培养技术一、实验的目的和内容目的：掌握微生物接种和分离纯化技术，掌握无菌操作技术。
内容：用平板划线法分离微生物；学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、基本原理在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。
因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须从中把他们分离出来。
微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。
无菌操作是微生物接种技术的关键。
接种是将微生物或微生物悬液引入新鲜培养基的过程。
由于实验目的、培养基种类及实验器皿等不同，所用接种方法不尽相同。
斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。
分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。
即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。
在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
三、材料及器材（一）菌种：大肠杆菌、枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌。
（二）培养基：肉汤培养基试管斜面，肉汤半固体培养基，肉汤固体培养基试管斜面，肉汤固体培养基平板，查氏培养基试管斜面，查氏培养基平板。
易（三）仪器及其他工具：接种环，接种针，接种钩，镊子，酒精灯，火柴，酒精棉，试管架，标签纸，恒温培养箱等。
四、方法与步骤（一）接种。
1、试管菌种转接：试管细菌菌种转接主要用于菌种的活化、分离、纯化。
（1）将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。
（2）置试管口于酒精火焰附近。
（3）将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管中，在管壁上停留片刻待其冷却。
（4）取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
（5）取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
（6）重新塞上棉塞。
（7）烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。
高中生物 第1章 第1节 微生物的分离和纯培养检测(含解析)中图版高中选修1生物试题
第一节微生物的分离和纯培养一、培养基1．含义由于微生物代谢方式的不同，因而对营养物质的需求也是有差异的。
根据微生物生长繁殖和代谢的需要，将各种营养物质混合在一起而配制的营养基质。
2．平板培养基将溶化后的固体培养基基质倒入无菌培养皿中，冷却凝固后制成的培养基。
二、无菌技术1．目的和要求在微生物的分离和纯培养中，一定不能有外来的污染性杂菌，所以必须采用无菌技术进行操作。
因此，在实验过程中，要对所用的器材、培养基进行严格的灭菌，对工作场所要进行消毒。
2．灭菌和消毒(1)灭菌：用强烈的理化因素杀死环境或物体内外所有的微生物，常用的方法是高温灭菌法。
(2)消毒：用相对温和的理化方法杀死环境或物体上的病原微生物和有害微生物的营养细胞，常用的方法是射线消毒法和化学药剂消毒法。
三、接种技术1．含义把相应的研究对象移入培养基中的过程。
2．分类在平板培养基上接种的方法有平板划线法、稀释平板涂布法、稀释混合平板法等。
预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题1问题2问题3问题4一、微生物的概念及特点 1．概念微生物是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称。
2．特点微生物⎩⎨⎧小个体微小⎩⎪⎨⎪⎧ μm 微米级：光学显微镜下可见细胞nm 纳米级：电子显微镜下可见细胞器、病毒微生物⎩⎪⎪⎨⎪⎪⎧ 简构造简单⎩⎪⎨⎪⎧单细胞简单多细胞非细胞即“分子生物”低进化地位低⎩⎪⎨⎪⎧原核类：细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体、蓝细菌真核类：真菌酵母菌、霉菌、原生生物非细胞类：病毒、类病毒、朊病毒二、微生物的营养及功能微生物的化学组成成分与其他生物大体相同，也是由C 、H 、O 、N 、P 、S 等元素组成，其中C 、H 、O 、N 占细胞干重的90%以上，这些元素最终来自外界环境中的各种无机化合物和有机化合物。
这些化合物可归纳成碳源、氮源、生长因子、无机盐和水这五大类营养要素。
营养物质定义作用主要来源碳源凡能提供所需碳元素的物质构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机化合物：CO 2、NaHCO 3等；有机化合物：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等氮源凡能提供所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐；有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长必不可少的微量有机物酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等水在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定外界摄入无机盐为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂无机化合物①微生物最常利用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。
沈萍微生物学第二章
放线菌形态
放线菌生活史
放线菌孢子丝
2、古细菌
3. 原核生物的细胞大：纳米（nm10－9m） 细胞大小的形象比较
大肠杆菌：0.5×2um 芝麻：3mm
常见细菌的大小
球菌：直径 0.5×2um 杆菌：宽×长 0.5～1×1～5um 螺形菌：宽×长 0.5～1×1～50um
六，微生物的保藏技术 1.保藏的目的 2.保藏的原理 3.保藏的方法 传代培养 4℃ 冷冻保藏 -196℃， - 70℃ ， -20~-30℃ 干燥保藏 沙土管，安瓿管 其他方法
第三节
显微镜下的微生物
一， 细菌
细菌的定义： 以二分裂为主要繁殖方式的单细胞原核 微 生物。 1.细菌的形态和排列 三种基本形态：
杆菌
杆菌的基本形态
短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节状 等；按杆菌细胞繁殖后的排列方式则有链状、栅状、 “八”字状等
杆菌细胞的排列方式
链杆、栅状、八字状、鞘衣包裹的丝状等
短杆菌
长杆菌
梭状芽孢杆菌
Scanning electron micrographs illustrating external features of the rodshaped bacterium E. coli.
球状
一个分裂面 二个分裂面 三个分裂面 无定向分裂面
单杆，链杆，栅状 ，八字 弧菌，螺旋菌
杆状， 螺旋状
单球菌
细胞分裂沿一个平面进行， 新个体分散而单独存在. 如尿素微球菌
显微镜下示意图
双球菌
细胞沿一个平面分裂， 新个体成对排列. 如肺炎双球菌
四联球菌
细胞分裂是沿两个相垂直的平 面进行，分裂后每四个细胞特 征性地连在一起，呈田字形. 如四联微球菌
第二章--微生物的纯培养和显微技术
第二节 显微镜和显微技术
一、显微镜的种类及其原理 二、显微观察样品的制备 三、显微镜下的微生物
几个基本概念：
一、显微镜的种类及原理
1.普通光学显微镜（复式显微镜）
机械装置: 镜座、支架、载物台、调焦螺旋等 光学系统: 物镜、目镜、聚光镜等
使用油镜时加镜油的目的: (1)增加照明亮度 (2)增加显微镜的分辨率
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线 照射后可激发荧光；另有一些物质本身虽 不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗 体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧 光显微镜就是对这类物质进行定性和定量 研究的工具之一
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荧 光 显 微 镜 观 察
5、 透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM)
原理：用一束电子作为它的能源，电子的波长很短，能够 检测极细微的物体，如病毒和分子。
应用：通过细胞超薄切片，观察细胞内部的详细结构如细 胞膜、细胞核等。（可放大几万倍）
6、 扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM)
原理：类似于电视或电传真照片。即利用电子“探针”，在 样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电子，二次电子由 探测器收集，并转变为光信号。
光学显微镜
光学理论依据
德国理学家Ernst Abbe，在19世纪70年代建立的 在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距 离被称为最小距离（d）
最小距离=0.5/nsin= 0.5/NA
分辨率（R) ∝ 1/d
分辨率(最小可分辨距离)=0.5λ∕ n sinθ = λ∕2NA
波长与分辨率
高压蒸汽灭菌锅
2、接种操作
接种工具： 白金or镍铬合金接种针/环
无菌操作技术在微生物四项基本实验技术中的应用和意义
无菌操作技术主要是指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌实验器材及无菌操作方法等。
微生物学四项基本实验技术是指显微镜技术、无菌操作技术、纯种分离技术和纯种培养技术。
微生物学实验技术所用玻璃器皿。
不但要像化学实验那样要求清洁，而且还要无菌（玻璃器皿、接种工具、材料要灭菌），实验过程中要严格无菌操作。
实验结束后若桌面被菌液污染，可用3％来苏尔液擦拭干净，带菌工具（吸管、塑料吸嘴、玻璃刮棒、染色涂片等）洗涤前浸泡在3％来苏尔液中，消毒后再清洗。
有微生物污染的废物要集中处理，不能污染环境。
无菌操作一般是在无菌环境条件下，使用无菌器材进行检验或实验过程中，防止微生物污染和干扰的一种常规操作方法。
无菌操作的目的，一是保持待检物品不被环境中微生物所污染；二是防止被检微生物在操作中污染环境和感染操作人员，因而无菌操作在一定意义上讲又是安全操作。
无菌操作技术在微生物四项基本实验技术中的应用和意义从以下四个方面做简要的论述：一、在显微镜技术中的应用和意义微生物个体微小，必须借助显微镜才能观察到，因此在微生物学的各项实验技术中，显微镜就成为研究者不可缺少的工具。
显微镜的种类很多，根据其结构，一般分为光学显微镜和非光学显微镜两大类，在实验室观察微生物形态常用的显微镜，以光学显微镜最为常见。
在显微镜技术中必不可少的是涂片、染色等技术，无论是在制片还是染色等过程中，防止杂菌的污染即无菌操作都是非常重要的，一旦被观察的玻片遭到杂菌污染，将使观察结果受到严重偏差和影响。
因此在操作过程中为保证无菌操作应注意：①在实验室观察平板培养物时，一般不宜开盖观察；检验结果，可以开盖检查。
如取菌作涂片染色或移植培养时。
培养皿上下盖可适度开缝，但不准完全揭开；②涂片染色时应使用夹子夹持玻片，切勿用手直接拿玻片，以防感染细菌；③用过的玻片应放置消毒液中或直接煮沸消毒，冲洗液也应煮沸或消毒处理后再倒掉以免污染环境。
微生物的分离和纯培养
在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture)，而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pure culture)。
由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
一、无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。
因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptic technique)，它是保证微生物学研究正常进行的关键。
1、微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿(culture dish，petri dish)等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不合任何生物。
培养微生物的营养物质[称为培养基(culture medium)]可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。
为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。
而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。
2、接种操作用接种环或接种针分离微生物，或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养，是微生物学研究中最常用的基本操作。
由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染，因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行，其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。
微生物检验的基本操作技术
1）、在固体培养基上，观察： 菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶
性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特 征及迁移性等； 2）、在液体培养中： 表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等； 3）、半固体培养基穿刺接种：
观察运动、扩散情况。
1.点状 2.圆形 3.丝状 4. 不规则形 5.假根状 6.纺锤 状
d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及 表面特征（光滑、颗粒、皱状）；
e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则 主要观察是否产酸和有无气体。
5）、穿刺接种法（半固体接种）
多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以 用于观察细菌的某些生化反应。 （1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管； （2）以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基的中 心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能 完全刺到管底），接种针应沿原路退出； （3）经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生长， 线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺线模糊不清， 或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊表示细 菌有动力。
③ 处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随 意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无 菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。
2、超净工作台
超净台的使用与保养: （1）风速保持在0.32-0.48米/秒; （2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上; （3）让超净台预工作10－15分钟; （4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干
（1）取菌技巧 D
1. 调整 Pipetman 刻度 (P1000 吸取 范围 200 ~ 1000μl)
2. 插上灭过菌之 Tip
(用力插紧)
微生物的分离和纯培养无菌技术无菌技术-2022年学习资料
3、无菌的环境-1在操作过程中的无菌要求：接种、-分离过程的无菌效果（在火焰上部进行操-作。-2在超净工作 、无菌室和无菌箱中-进行操作。使用甲醛、紫外线、75%的之-醇等进行预处理及其他的必要措施。-3如进行好氧 养鼎对空气进行处理，-实验室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空-气，工业中使用空气过滤器过滤空气。
特点：快速、方-便。-分区划线适用于-浓度较大的样品-图1平板划线操作图-连续划线适用于-开始处-浓度较小 样品；-图5划线分离图
干始处-菌苔、-菌落-d-连续划线-划线分离后平板上显示的菌落照片
2、稀释分离法-1-液体稀释法-1.0ml-10m-Tentold-Tantold-Ten'old-100 dilution-bacteria-Agar poured into-sierile Petri dish Original-3 ml HeO-9'ml H2O-t0 ml molted agar at 45"-s mple af-1,000 bacteria/'ml-1100 bacteria.ml-10 bacter a/ml:100-102ml-bacteria iotal per lubel-103mf-iQ.0的0 cteria/mi-10'ml-10%/ml
连续培养原理-当微生物在单批培养方式下生长达到对-数期后期时，一方面以一定的速度流进新-鲜培养基并搅拌，另 方面以溢流方式流-出培养液，使培养物达到动态平衡衡，其中-的微生物就能长期保持对数期的平衔生长-状态和稳定 生长速率。
微生物培养技术
（3）按成分分：合成培养基和天然培养基
合成培养基:
用化学成分已知的化学物质配成的，因成分明确， 常用于分类、鉴定等
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化 合物、无机盐和其它一些辅助物质。
或 80 ℃下煮15min C、化学药剂消毒法:用酒精进行皮肤消毒;
氯气消毒水源 D、射线消毒法
2、灭菌
（1）定义：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的
微生物，包括芽孢和孢子 。
（2）灭菌的方法：
A、灼烧灭菌
B、干热灭菌：
160-170 ℃下加热1-2h。
C、高压蒸汽灭菌：
100kPa、121 ℃下维持 15-30min.
（四）案例：大肠杆菌的分离和纯培养
1、微生物实验室培养的基本操作程序
（1）器具的灭菌 （3）培养基的灭菌 （5）微生物接种 （7）菌种的保存
（2）培养基的配制 （4）倒平板 （6）恒温箱中培养
2、大肠杆菌的分离和纯培养步骤 （1）制备牛肉膏蛋白胨培养基
（2)配制培养基：计算称量；熔化； 调PH；分装； 灭菌； 倒平板
细菌：一般选用104 、105 、106倍的稀释液进行培养 放线菌：一般选用103 、104 、105倍的稀释液 真菌：一般选用102 、103 、104倍的稀释液
5、培养与观察：
细菌：30～370C的温度下培养1～2d； 放线菌：25～280C的温度下培养5～7d； 霉菌：25～280C的温度下培养3～4d。
养皿，立刻盖上皿盖。 ④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
倒平板技术
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连续培养：在微生物培养的过程中，不 断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌 体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物 长时间地处于对数生长期，以利于微生物 的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。 连续培养理论基础：由于对典型生长曲 线中稳定期到来原因的认识，采取相应有 效措施推迟其来临，从而发展出现在的连 续培养技术。
连续培养原理 当微生物在单批培养方式下生长达到对 数期后期时，一方面以一定的速度流进新 鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流 出培养液，使培养物达到动态平衡，其中 的微生物就能长期保持对数期的平衡生长 状态和稳定的生长速率。
连续培养和单批培养的比较
连续流入 新鲜培养液 单批培养 恒浊法
lg细胞数（个/ml）
4、选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种 微生物，可以根据该微生物的特点，包括 营养、生理、生长条件等，采用选择培养 的方法进行分离。 利用选择培养基进行直接分离 富集培养
三、微生物的培养
1、好氧培养和厌氧培养 好氧培养以空气为氧的来源。实验室 的培养方法用平皿培养和斜面培养；工业 生产时用自然对流和机械通风法来供氧； 液体培养时微生物利用培养液中的溶解氧； 液体三角瓶培养时利用摇床机达到供氧的 目的；发酵罐培养时用通入无菌压缩空气 达到供氧的目的。
微生物的分离和纯培养
一、无菌技术
无菌技术：是将微生物分离、转接及培 养时防止被其它微生物污染的技术。 1、对使用的器皿及用具的灭菌 2、对培养基的灭菌 通常使用的方法有高温蒸汽灭菌和高 温干热灭菌，效果达到无菌（不含任何微 生物)。
3、无菌的环境 （1）在操作过程中的无菌要求：接种、 分离过程的无菌效果（在火焰上部进行操 作）。 （2）在超净工作台、无菌室和无菌箱中 进行操作。使用甲醛、紫外线、75%的乙 醇等进行预处理及其他的必要措施。 （3）如进行好氧培养需对空气进行处理， 实验室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空 气，工业中使用空气过滤器过滤空气。
恒化法
连续培养
单批培养
连续培养
时间
连续培养器
按控制方式分
内控制（控制菌体密度）：恒浊器 外控制（控制培养液流速、以控连续培养器 多级连续培养器 按细胞状态分 一般连续培养器 固定化细胞连续培养器
按用途分
实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐
恒化器
连续培养技术——恒浊培养 概念：通过调节培养基流速，使培养液 浊度保持恒定的连续培养方法。 原理：通过调节新鲜培养基流入的速度 和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即 浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时， 使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则 减慢培养基的流速。
厌氧培养是通过隔绝空气或驱除氧气 的方法来实现的。实验室培养时，可将 菌种接种到固体、半固体培养基的深层 进行培养，同时加入还原剂；也可将厌 氧微生物放入真空干燥器，抽出空气， 并充入氮气或氮气和二氧化碳的混合气 体。
2、分批培养和连续培养 分批培养：将微生物置于一定容积的、 定量的培养基中培养，培养基一次性加入， 不再补充和更换，最后一次性收获。分批 培养的过程中菌体、各种代谢产物的数目 与营养物的数目呈负相关性。当微生物生 长及基质变化达到一定时，菌体生长则会 停止。在发酵工业中可用中间补料或连续 流加物料，使培养基中营养物质的浓度保 持在适合菌体生长和有利于菌体积累代谢 产物的环境中。
二、微生物的分离方法
1、平皿划线分离法
将灭好菌的琼脂培养基倒入培养皿中， 凝固后用接种针取少量的需分离菌，在培 养基的表面上进行划线，经培养后形成菌 落。菌落在划线开始处较密集，在划线的 结束处少，当有单个孤立的菌落时，就达 到分离的目的。 划线的方法有：连续划线法、扇形划线 法、方格划线法和平行划线法。
（2）稀释倒平板法 首先将待分离的样品进行连续稀释， 取一定稀释度的样品涂布平板或者取一定 稀释度的样品和熔化的营养琼脂混合（对 于热敏感菌不适用），培养到平板上长出 单一的菌落。对于涂布平板的样品菌落通 常仅张在平板的表面，对于与营养琼脂混 合的样品菌落通常出现在平板的表面和内 部。
（3）涂布平板法 将经过稀释的样品滴加入已制好并灭 好菌的培养皿表面，用灭好菌的涂布棒将 菌液均匀 的涂抹在整个平板上，经培养 长出单一菌落。具体分为两种方法：将 0.1ml样品加入固体培养基表面，用无菌 涂布棒均匀涂抹进行培养（适用于某些严 格好氧菌）或者将样品加入到无菌的培养 皿中，加入45－50 ℃固体培养基迅速混 匀进行培养。
连续培养技术——恒化连续培养 概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而 保持细菌生长速率恒定的方法。 原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、 氮源、生长因子等） ，使其始终成为生长 限制因子，而达到控制培养液流速保持不 变，并使微生物始终在低于其最高生长速 率条件下进行生长繁殖。 特点：维持营养成分的亚适量，控制微生 物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均 一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究。
特点：快速、方 便。 分区划线适用于 浓度较大的样品； 连续划线适用于 浓度较小的样品；
连续划线
划线分离后平板上显示的菌落照片
2、稀释分离法 （1）液体稀释法
（1）液体稀释法 首先将待分离的样品进行连续稀释, 目的是得到高度稀释的效果,使一支试管 中分配不到一个微生物。如果经过稀释 后的大多数试管中没有微生物生长,那么 有微生物生长的试管得到的培养物可能 就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培 养物。 这种方法适合于细胞较大的微生物。
3、单细胞（单孢子）挑取法 采用显微分离法从混杂群体中直接分离 单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培 养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体， 适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取 单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制 成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞 的液滴来进行纯培养物的分离。