人乳头瘤病毒L1 基因与丹毒丝菌SpaA-N优势抗原表位序列的嵌合重组质粒构建及活鉴定

·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN2011年第10期
人乳头瘤病毒L1基因与丹毒丝菌SpaA-N优势抗原表位序列的嵌合重组质粒构建及活性鉴定
庆格乐图杨薇薇晏鹏飞苏幼红李江伟
（新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046）
摘要：为确定丹毒丝菌表面保护性抗原A的N-末端（SpaA-N）优势抗原表位，研发新型表位DNA嵌合疫苗，利用生物信息学软件对丹毒丝菌SpaA-N的优势B细胞抗原表位进行预测，以重叠PCR将优势表位插入人乳头瘤病毒16型的主要衣壳蛋白（HPV-16L1）HI环结构的编码序列中，构建获得重组嵌合质粒pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA。

该重组质粒经体内、外瞬时转染后，RT-PCR均扩增获得了1500bp左右的目的片段。

免疫印迹试验显示，体外转染嵌合质粒的细胞总蛋白能够与GST-SpaA-N重组蛋白免疫血清在56kD处产生特异性结合。

ELISA分析显示嵌合质粒可在小鼠体内产生差异显著的特异性抗体（P＜0.01），抗体滴度为1ʒ1000。

此外，pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA制备的抗血清至少可在1ʒ10稀释度条件下，介导外源补体对半数以上的菌体进行杀伤。

该研究表明，获得的SpaA-N表位DNA嵌合疫苗具有免疫活性，为研发安全有效的丹毒丝菌新型DNA疫苗提供了一个新思路。

关键词：丹毒丝菌SpaA-N表位预测HPV-16L1嵌合质粒瞬时表达杀菌活性
Construction and Active Identification of Recombinant Plasmid with Chimeric Human Papillomavirus Type16L1Expressing an
Epitope of Erysipelothrix rhusiopathiae SpaA-N
Qinggeletu Yang Weiwei Yan Pengfei Su Youhong Li Jiangwei
（Key Laboratory of Molecular Biology，Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic
Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi830046）
Abstract：To comfirm the B cell epitope of N-terminal of surface protective antigen A（SpaA-N）from Erysipelothrix rhusiopathiae and develop an efficient DNA vaccine，an experimental DNA plasmid was constructed based on the predicted B cell epitope derived from SpaA-N，and then the predominant epitope was inserted into the coding sequence of human papillomavirus type16major capsid protein（HPV-16L1）HI loop by overlap PCR．pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA were transfected in vitro and in vivo，the results of RT-PCR showed that the1500bp round products were amplified，while Western blotting illustrated the total proteins of cells which transfected pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA plasmid can bound with mouse against GST-SpaA-N antiserum at56kD specifically．Antiserum from mice immunized with pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA showed could bind to SpaA-N recombinant protein in ELISA detection，and the titer of anti-body was1ʒ1000（P＜0.01）．In addition，in vitro bactericidal assay showed the antiserum from pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA immunized mice mediated efficient killing of Erysipeolothrix rhusiopathiae by addition of complements at lest in dilution of1ʒ10．This results indica-ted that the DNA vaccine with chimeric human papillomavirus L1expressing an epitope of SpaA could induce efficient immune response to Erysipeolothrix rhusiopathiae infection in mouse，and provided a selective strategy for developing a safer and more efficient DNA vac-cine to control Erysipeolothrix rhusiopathiae infection．
Key words：Erysipeolothrix rhusiopathiae SpaA-N Epitope prediction HPV-16L1chimeric plasmid Transient expression Bactericidal assay
收稿日期：2011-03-21
基金项目：新疆自治区高校科研计划重点项目（XJEDU2005105）
作者简介：庆格乐图，男，硕士研究生，研究方向：感染与免疫；E-mail：qgle@qq．com
通讯作者：李江伟，男，副教授，研究方向：肿瘤免疫学；E-mail：lijiangwei67@gmail．com
生物技术通报Biotechnology Bulletin2011年第10期
丹毒丝菌（Erysipeolothrix rhusiopathiae）为革兰氏阳性菌，是导致猪、牛和羊等动物丹毒病症的病原菌。

猪及其他动物感染后，常引发慢性多发性关节炎、心内膜炎和败血症等，使世界各地的畜禽生产遭受巨大经济损失［1］。

目前国内外主要采用减毒疫苗和灭活疫苗对丹毒爆发进行预防和控制，但这类减毒疫苗仍存在较大的安全性问题，为此研发安全可靠的新型丹毒丝菌疫苗具有重要意义。

近年来研究表明，丹毒丝菌表面保护性抗原A氨基端（N-ter-minal of surface protective antigen A，SpaA-N），具有强免疫保护性，对不同血清型丹毒丝菌具有交叉免疫保护效应，可作为抗丹毒丝菌感染的最佳亚单位疫苗候选抗原［2－4］。

但是，蛋白疫苗的研制，涉及表达系统优化和表达产物纯化，工序较繁琐，周期较长，免疫动物时所添加的外源佐剂还可能对机体产生副作用。

而基于抗原表位的DNA重组疫苗，不仅能有效诱导免疫应答，减少免疫无关冗余序列产生干扰，而且还具备安全、稳定、制备方便、成本低廉等优势，目前已有多种DNA疫苗获批上市［5］。

由于表位DNA一般较短（仅编码8－10个氨基酸），易降解，故需嵌合递送载体。

有研究表明人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1（human papillomavirus type16major cap-sid protein，HPV-16L1）可在体内外自我装配形成病毒样颗粒，具有潜在的抗原载体效应，有可能增强表位DNA疫苗诱导的免疫应答［6－8］。

为此，本研究拟通过生物信息学软件预测SpaA-N优势B细胞抗原表位，构建SpaA-N优势表位嵌合HPV-16L1的DNA疫苗，免疫小鼠并分析表位DNA嵌合疫苗的免疫活性，为研发安全有效的新型DNA疫苗用于预防和控制丹毒丝菌感染提供借鉴。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种质粒及主要试剂丹毒丝菌XJ1249购自国家菌种保藏中心；大肠杆菌DH5α，TOP10菌株及重组质粒pcDNA3-HPV-16L1（该质粒包含编码人乳头瘤病毒的16型主要衣壳蛋白的基因片段，体外转染细胞能够形成病毒样颗粒，VLP）均为本实验室保存；Trizol试剂，购自Invitrogen公司。

pMD18-T simple vector为TaKaRa公司产品。

Ex Taq酶、AMV 酶、T
4
DNA连接酶及Xho I，Hin d III等限制性内切酶为TaKaRa公司产品；DNA回收试剂盒购自天根生物有限公司；羊抗鼠HRP-IgG为博奥森公司提供；NC膜为Minipore公司产品；丹毒丝菌XJ1249表面抗原A氨基端融合蛋白（GST-SpaA-N）为本实验室自制［4］。

1.1.2试验动物4－6周龄雌性昆明白小鼠购自新疆医科大学动物实验中心。

1.2方法
1.2.1SpaA-N优势B细胞抗原表位预测利用生物信息学软件DNASTAR，分别以Garnier-Robson法和Chou-Fasman法对长为320个氨基酸的丹毒丝菌XJ1249株表面SpaA-N二级结构进行预测［9］，分析其柔韧性区域；以Hopp-woods法和Emini法分析其亲水性和表面可及性［10］；最后以Jameson-Wolf法预测其抗原性指数［11］，综合上述分析预测丹毒丝菌XJ1249SpaA-N 潜在的抗原优势表位，并命名为ΔSpaA。

1.2.2重叠PCR扩增HPV-16L1-ΔspaA嵌合基因
通过重叠PCR将SpaA-N优势抗原表位ΔSpaA序列插入HPV-16L1第359位和360位氨基酸编码序列之间（即第1077和1078位核苷酸间）。

重叠PCR引物设计如图1所示，以ΔspaA为引物重叠部分设计两套引物用于扩增HPV-16L1-ΔspaA全长片段，并于该片段的5'端和3'端分别引入Hin d III和Xho I酶切位点，引物序列见表1，下划线表示酶切位点。

PCR反应策略，首先以P1和yspa1扩增HPV-16L1（A）片段，yspa2和P2扩增HPV-16L1（B）片段，再以HPV-16L1（A）及HPV-16L1（B）片段的混合物为模板扩增HPV-16L1-ΔspaA全长。

反应程序：95ħ预热5min；95ħ变性30s，60ħ退火30s，72ħ延伸2min；35个循环后，72ħ反应7min。

重叠PCR扩增产物，连接pMD18-T 载体后送测序。

图1重叠PCR引物设计策略
641
庆格乐图等：人乳头瘤病毒L1基因与丹毒丝菌SpaA-N优势抗原2011年第10期表位序列的嵌合重组质粒构建及活性鉴定
表1重叠PCR扩增HPV-16L1-ΔspaA的引物
引物名称引物序列（5'－'3）
P1CCAAGCTTACATGCAGGTGACTTTTATT
P2CCCAAGCTTACATGCAGGTGACTTTTATT
yspa1CTCTACTTTAGAATCACTTTCTTCGTTAGTATTTT-
TATATGTAG
yspa2GAAGAAAGTGATTCTAAAGTAGAGTTTAAGGAG-
TACCTACGAC
1.2.3嵌合质粒pcDNA3-HPV-16L1-ΔspaA的构建pMD18-T-HPV-16L1-ΔspaA经测序鉴定后，亚克隆至pcDNA3真核表达质粒，转化E．coli（TOP10）感受态细胞，0.1%氨苄青霉素抗生素筛选阳性克隆，以Hin dⅢ及XhoⅠ进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4嵌合质粒体内外瞬时表达检测采用Lipo-fectamine2000（Invitrogen，USA）试剂盒，将重组质粒瞬时转染293T细胞。

分别设pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA组和空载质粒pcDNA3组。

在6孔细胞培养板孔内接种293T细胞，接种量为1ˑ106细胞/孔，以含10%FBS的DMEM培养基37ħ培养36h，转染前将细胞培养基换为无血清的DMEM培养基。

取4μg嵌合体质粒DNA及10μL Lipofectamine，均以250μL无血清DMEM培养基进行稀释后混合。

在6孔板中加入DNA-Lipofectamine混合物，轻摇混匀，于37ħ、5%CO
2
培养箱中培养4－5h后更换为生长培养基继续培养48－72h。

收集转染后的细胞，按照文献［12］，TRIZOL法同时提取细胞总RNA 和细胞总蛋白。

将RNA反转录成cDNA后PCR扩增。

提取的细胞总蛋白，经离心（10000r/min，4ħ，10min）并浓缩后，按常规进行蛋白定量，并用上样缓冲液稀释至2500μg/mL后进行SDS-PAGE 电泳，再经湿式电转转印至NC膜上，依次孵育一抗和二抗进行免疫印记分析。

一抗用SpaA-N重组蛋白免疫血清（1ʒ1000），二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG（1ʒ5000）。

按照文献［13］的方法在高压下通过小鼠尾静脉转染25μg pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA质粒，12h后处死转基因小鼠。

剪碎肝细胞，用TRIZOL法提取细胞总RNA，并将RNA反转录成cDNA后，PCR扩增目的基因HPV-16L1-ΔspaA。

同时设空载质粒pcDNA3的对照组，同法转染25μg质粒。

1.2.5小鼠抗血清的制备嵌合质粒pcDNA3-HPV-16L1-ΔspaA免疫小鼠制备抗血清，另设pcDNA3-HPV-16L1阴性对照免疫组和生理盐水空白免疫组，每组10只小鼠。

免疫方式为大腿内侧肌肉多点注射，免疫剂量为100μg质粒/小鼠，每10d加强免疫一次，共进行5次免疫。

每次免疫前一天及终免14d 后收集各组小鼠的免疫血清，－20ħ保存备用。

同时，制备抗GST-spaA-N重组蛋白小鼠抗血清，用于检测嵌合质粒pcDNA3-HPV-16L1-ΔspaA瞬时转染293T细胞的蛋白表达情况及体外杀菌试验，共免疫5只小鼠，参照文献［4］进行免疫。

1.2.6间接ELISA检测免疫血清特异抗体水平
以GST-SpaA-N重组蛋白为抗原，间接ELISA检测嵌合质粒免疫小鼠抗血清中特异抗体水平。

碳酸盐包被缓冲液将GST-SpaA-N重组蛋白稀释至2μg/mL，4ħ包被过夜。

次日，3%BSA37ħ封闭2h，洗涤；再以各组小鼠免疫血清的梯度稀释液为一抗37ħ孵育2h，洗涤；最后以羊抗鼠IgG-HRP1ʒ5000稀释液为检测二抗，TMB显色，于OD
450
处测定吸光值，统计分析，比较各组小鼠免疫血清的特异抗体水平差异。

1.2.7免疫血清体外杀菌活性分析参照文献方法［14］，检测SpaA-N抗原特异抗体介导补体共同参与对丹毒丝菌的体外杀伤效应。

将各组免疫血清灭活补体后（56ħ，30min），PBS梯度稀释，以100μL/孔加入96孔板中，与丹毒丝菌XJ1249菌悬液25μL/孔（约含1000CFU）混匀后，再添加外源补体，37ħ共孵育1h。

最后计算各孔存活丹毒丝菌CFU，比较各组免疫血清的杀菌活性。

各稀释度血清样品均设3个平行孔，同时设外源补体对照孔。

杀伤效应在50%以上被认为具有杀菌活性。

2结果
2.1SpaA-N优势B细胞抗原表位预测
利用DNASTAR生物信息学软件对丹毒丝菌XJ1249SpaA-N蛋白B细胞优势抗原表位预测结果如下：以Hopp-woods法分析显示SpaA-N的245－263、268－278和290－310区段具有较高亲水性，提示这些区域暴露于表面的几率较大；Emini法分
741
生物技术通报Biotechnology Bulletin2011年第10期
析认为SpaA-N中269－277和295－310区段的表面可及性较高；Jameson-Wolf法预测其抗原性指数较高的区域有196－216、222－236、245－263、269－280、290－310，提示这些区段含有潜在抗原表位；综上分析显示，269－277及295－310区段可能为优势表位，但由于Garnier-Robson法和Chou-Fasman法预测的SpaA-N二级结构结果中，265－284为β片层，290－295为α螺旋，不利于抗原表位展示。

因此，综合上述预测及分析结果选择位于295－302区段的8个氨基酸残基EESDSKVE作为SpaA-N的B 细胞优势抗原表位。

2.2嵌合质粒pcDNA3-HPV16-L1-ΔspaA的构建
通过重叠PCR将SpaA-N优势抗原表位ΔSpaA 序列嵌合入HPV-16L1，测序结果显示成功扩增获得全长为1539bp的HPV-16L1-ΔspaA基因片段，与理论值大小一致。

随后，将其亚克隆至pCDNA3真核表达质粒，Hin dⅢ和XhoⅠ双酶切鉴定重组阳性克隆，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，双酶切后出现与预期结果一致的条带，表明成功构建获得重组嵌合质粒pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA。

M．DL15000；1，2．Hin dⅢ＆XhoⅠ双
酶切pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA
图2pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA的酶切鉴定结果
2.3嵌合质粒瞬时表达检测
将pcDNA3-HPV3-L1-ΔspaA通过脂质体转染293T细胞，提取的细胞总RNA进行RT-PCR。

结果显示，扩增获得了1500bp左右的目的条带。

生理盐水、pcDNA3转染细胞和用β-actin扩增pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA转染的RT-PCR结果均无此条带（图3）。

M．DL5000；1．RT-PCR扩增生理盐水总RNA；2．RT-PCR
扩增pcDNA3总RNA；3．通过P1＆P2引物RT-PCR扩增
pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA总RNA；4．通过β-actin引物
RT-PCR扩增pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA总RNA
图3RT-PCR检测质粒pcDNA3-HPV-
16L1-ΔspaA的体外表达
Western blotting结果（图4）显示，嵌合质粒pcDNA3-HPV-16L1-ΔspaA转染293T细胞后，其细胞总蛋白能够与GST-SpaA-N特异性抗血清在56kD左右处发生特异结合反应，与理论预测值相符；阳性对照GST-SpaA-N重组蛋白在65kD 处有一条特异性条带，与其蛋白大小相符；空质粒pcDNA3转染293T细胞后，细胞总蛋白未检测到条带。

M．蛋白质Marker（14－94kD）；1．GST-SpaA-N重组蛋
白；2．转染pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA的293T细胞总蛋
白；3．转染pcDNA3的293T细胞总蛋白；
图4Western blotting检测嵌合质粒pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA在293T细胞中蛋白水平的表达情况
841
庆格乐图等：人乳头瘤病毒L1基因与丹毒丝菌SpaA-N优势抗原2011年第10期表位序列的嵌合重组质粒构建及活性鉴定
为了确定水动力转染的嵌合质粒pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA在小鼠体内是否转录，转染12h内断髓处死小鼠，取肝脏按Trizol方法提RNA，RT-PCR检测目的基因在mRNA水平上的转录。

结果（图5）显示特异性引物P1、P2扩增获得了1500bp左右的目的条带。

而pcDNA3转染的细胞和内参照β-actin扩增均无此目的条带。

M．DL5000；1．RT-PCR阴性对照；2．RT-PCR扩增
pcDNA3总RNA；3．通过P1＆P2引物RT-PCR扩增
pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA总RNA；4．通过β-actin引物
RT-PCR扩增pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA总RNA；5．通
过P1＆P2引物PCR扩增pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA总
RNA；6．PCR阴性对照；7．PCR阳性对照
图5pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA在小鼠肝
细胞中瞬时表达RT-PCR检测
2.4嵌合质粒免疫血清特异抗体水平检测
pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA免疫小鼠后，可激发产生特异性抗体，抗体滴度达1ʒ1000，而pcDNA3-HPV-16L1阴性对照免疫组和生理盐水空白免疫组的小鼠免疫血清中均检测不到特异性抗体（数据未显示）。

统计分析（图6）显示，在1ʒ100血清稀释度下，嵌合质粒免疫血清的抗原特异抗体水平与阴性血清及空白血清相比，具有显著差异（P＜0.01）。

图6ELISA检测各免疫血清特异抗体水平
2.5抗体的体外杀菌活性分析
嵌合质粒免疫血清的体外杀菌活性检测结果（图7）显示pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA免疫抗血清可在1ʒ10稀释度产生半数以上丹毒丝菌的杀伤效应，与pcDNA3-HPV-16L1免疫血清相比，具有显著杀菌效果。

而GST-SpaA-N蛋白免疫阳性血清可在1ʒ1000稀释度杀伤半数以上的丹毒丝菌。

图7免疫血清的杀菌活性分析
3讨论
目前，我国对丹毒丝菌感染的预防和控制仍依赖于传统的灭活疫苗及减毒疫苗，存在较大的安全问题。

近几年，Shimoj等［3］研究者制备的SpaA-N 亚单位疫苗显示出对丹毒丝菌感染小鼠有完全的免疫保护力，我们的前期试验也证实SpaA-N重组蛋白免疫小鼠后可产生特异抗体抵御丹毒丝菌感染［4］。

为了进一步确定SpaA-N区段中的优势抗原表位，构建新型表位嵌合DNA疫苗，用于有效诱导抗丹毒丝菌感染免疫应答，本研究通过生物信息学软件预测了SpaA-N区段二级结构，并对SpaA-N各区段抗原性参数进行综合评测，结果显示位于295－302区段的8个氨基酸残基EESDSKVE是SpaA-N 的潜在B细胞优势抗原表位，并以重叠PCR将其嵌合至HPV-16L1的HI环编码序列中。

由于HPV-16 L1表面有3个主要环结构DE
111－151
，FG
257－298
以及
HI
349－359
，将外源短肽段插入这三个环中，可在不破坏HPV-16L1自我装配成病毒样颗粒的同时，将外源肽段展示于其表面，诱导机体产生强烈的表位特异免疫反应。

Slupetzky等研究也表明将HIV gp41-的B细胞表位肽段插入HPV-16L1内，可显著提高该表位的免疫原性，所产生的抗体具有较强的病毒中和活性［9］。

941
生物技术通报Biotechnology Bulletin2011年第10期
本研究利用HPV-16L1具有展示外源抗原短肽增强免疫应答效应的特性，及核酸疫苗研制方便等优势，构建了SpaA-N抗原表位嵌合HPV-16 L1的DNA疫苗pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA。

表位嵌合疫苗免疫小鼠后可激发产生抗原特异抗体，且产生的抗体可介导外源补体对丹毒丝菌产生杀伤效应。

该结果表明构建获得的SpaA-N表位嵌合DNA疫苗具有免疫活性，不仅克服了蛋白疫苗研制效率低等缺陷，也证实可有效诱导免疫应答，可为研发新型表位DNA疫苗用于防控感染性疾病提供参考。

参考文献
［1］Brooke CJ，Riley TV．Erysipelothrix rhusiopathiae：bacteriology，epi-demiology and clinical manifestations of an occupational pathogen．J Med Microbiol，1999，48：789-799．
［2］Ho To，Nagai S．Genetic and antigenic diversity of the surface protec-tive antigen proteins of Erysipelothrix rhusiopathiae．Clin Microbiol，2007，14（7）：813-820．
［3］Shimoji Y，Mori Y．Fischetti VA．Immunological characterization of a protective antigen of Erysipelothrix rhusiopathiae：Identification of the region responsible for protective immunity．Infect and Immun，1999，67：1646-1651．
［4］曹文尧，李江伟，吕芳，等．丹毒丝菌spaA基因免疫保护区的克隆与功能研究．中国预防兽医学报，2007，（07）：496-500．
［5］Bergman PJ，Camps-Palau MA，McKnight JA，et a1．Development of
a xenogeneic DNA vaccine program for canine malignant melanoma at
the Animal Medical Center．Vaccine，2006，24（21）：4582-4585．［6］Bryce C，Douglas RL，John TS．Conjugation of a self-antigen to papillo-mavirus-like particles allows for efficient induction of protective au-toantibodies．J Clin Invest，2001，108：415-423．
［7］Baud D，Ponci F，Bobst M，et a1．Improved efficiency of a Salmonella-based vaccine against human papillomavirus type16virus-like parti-cles achieved by using a codon-optimized version of L1．J Virol，2004，78（23）：12901-12909．
［8］Slupetzky K，Shafti-Keramat S，Lenz B，et al．Chimeric papillomavirus-like particles expressing a foreign epitope on capsid surface loops．J Gen Virol，2001，82：2799-2804．
［9］Chou PY，Fasman GD．Prodection of the secondary structure of protein conformation［M］．New York：Plenum Press，1990：549-586．
［10］Hopp TP，Woods KR．Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences．Proc Natl Acad Sci，1981，12：78-3824．［11］Jameson BA，Wolf H．The antigenic index：A novel algorithm for pre-diction antigenic determinants．Comput Appl Biosci，1988，4：
181-186．
［12］董华，王军军，应天翼，等．一种同时提取细胞总RNA和总蛋白的方法．生物技术通讯，2005（6）：649-650．
［13］Liu F，Song Y，Liu D．Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA．Gene Ther，1999，6
（7）：1258-1266．
［14］Zhu D，Williams JN，Rice J，et al．A DNA fusion vaccine induces bactericidal antibodies to a peptide epitope from the PorA Porin of
Neisseria meningitidis．Infect and immun，2008，76（1）：334-338．
（责任编辑狄艳红）
051。