微生物学类实验指导书(下)蛋白酶产生菌活力测定及果酒酵母分离纯化

实验一产酶微生物的分离、纯化与选育
酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。

由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒,环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。

目前,能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶,葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的.通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。

2。

蛋白酶产生菌的分离与纯化
2。

1 实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化.
2。

2 实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌.本实验将土壤样品（或其他样品)悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛.也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。

2.3 实验仪器与材料土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液;显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。

2。

4 实验方法与步骤
2。

4.1 分离
1)采集土壤样品，用无菌水制备1:10土壤悬液；
2）取1:10土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75—80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌；
3）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板，将平板倒置,于30-32 ℃培养24-48 h；
4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。

2。

4。

2 筛选1）从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于含酪蛋白的平板，30-32 ℃培养24—48 h，测定平板上菌苔直径和水解圈直径.2）水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物，可作为进行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。

2.5 实验结果
在含酪蛋白的平板上，产蛋白酶的芽孢杆菌可形成蛋白质水解圈。

自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶活力有很大差异，有些芽孢杆菌酶活力超过4000 U/mL。

1）描述你所分离的蛋白酶产生菌的菌落特征和个体形态特征；2)报告你所分离的蛋白酶产生菌的初筛（水解圈与菌苔直径的比值)结果。

2.6 注意事项1)土壤悬液加热处理的温度和时间应准确控制；2）点接含酪蛋白的平板时,接种量及接种面积要基本相同。

2.7 分析与讨论在酪蛋白平板上水解圈与菌落直径比值大的菌落,其蛋白酶活力不一定大,因此，对初筛选出的水解圈与菌落直径比值大的菌落要进行发酵培养,进一步对发酵液进行酶活力测定。

2.8 思考题1）对所筛选的菌株如何进一步提高酶活力?请写出设想和方案;2)蛋白酶有哪些方面的应用。

参考书目
[1］扬文博,微生物学实验。

北京：化学工业出版社，2004.
［2］黄秀梨、辛明秀主编,微生物学实验指导，高等教育出版社,2008年。

附：相关培养基
1．酪素培养基：牛肉膏0.3g、NaCl 0.5g，酪素1.0g，琼脂2。

0g，水100mL，pH 7。

6-8.0。

配制方法:称取酪素1g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水,在沸水浴中加热并搅拌,至完全溶解，补足水量至100mL,加入其他成分,调整pH值，灭菌备用.
2．产蛋白酶发酵培养基：玉米粉6。

0g，豆饼粉4。

0g，Na2HPO4 0。

4g，KH2PO4 0。

03g，Na2CO3 0.1g，自来水100 mL，pH 9。

0（灭菌前).配制方法：称取玉米粉3g、豆饼粉2g，置于洁净干燥的500mL锥形瓶中，轻轻摇动，使物料混匀。

按上述配方用自来水配置无机盐溶液50mL,调pH值，倒入装有物料的锥形瓶中,混匀,0。

1MPa压力，灭菌30min。

3．淀粉培养基:牛肉膏0。

5 g，可溶性淀粉0。

2 g，蛋白胨1.0 g,琼脂2。

0 g,NaCl 0.5 g，蒸馏水100 ml，pH值7。

2-7。

4。

配制方法:先用少量蒸馏水将可溶性淀粉在沸水浴中煮融，至淀粉液透明，补足水量,将其他成分溶入，调pH值，0。

01 MPa压力，灭菌30 min.
4．产淀粉酶发酵培养基:玉米粉8。

0 g,蛋白胨0。

5 g，豆饼粉4.0 g，K2HPO4 0。

5 g，(NH4)2SO4 0。

4 g，蒸馏水100 ml，自然pH，0。

05 MPa压力，灭菌30min.
4。

产酶微生物菌种的选育
生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的.基因突变，又称点突变（point mutation)，包括自发突变和诱发突变，前者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变,后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变.两种突变都是由于一个或几个碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。

这一部分的实验是以紫外线和亚硝基胍为例介绍了物理因素和化学因素对微生物的诱变作用.本实验中,学生将筛选出的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线和亚硝基胍即物理因素和化学因素对微生物的诱变作用，对以上菌株进行选育工作。

特以淀粉酶产生菌株作为出发菌株,经过紫外线和亚硝基胍的诱变作用，根据透明圈直径与菌落直径的比值，可初步确定淀粉酶的高产菌株为例来介绍本实验内容。

4。

1 实验目的通过实验观察紫外线和亚硝基胍等理化因素对微生物的诱变效应,并掌握基本方法.
4.2 实验原理
基因突变可分为自发突变和诱发突变。

许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作
用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂.
紫外线(UV）是一种最常用的物理诱变因素.它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变.紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状.因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行,并且照射处理后的微生物放在暗处培养.
亚硝基胍(NTG，N—甲基— N-硝基—亚硝基胍）是一种有效的诱变剂,在低致死率的情况下也有很强的诱变作用,故有超诱变剂之称。

它的主要作用是引起DNA链中GC-AT的转换.亚硝基胍也是一种致癌因子，在操作中要特别小心，切勿与皮肤直接接触。

凡有亚硝基胍的器皿,都要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。

本实验分别以紫外线和亚硝基胍作为单因子诱变剂处理产生淀粉酶的菌株，根据试验菌诱变后在淀粉酶培养基上透明圈直径的大小来指示诱变效应。

一般来说，透明圈越大，淀粉酶活性越强.
4。

3 实验仪器与材料筛选出的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的产生菌株、淀粉培养基、LB液体培养基、溶液和试剂、亚硝基胍、碘液、无菌生理盐水、无菌水试管等；1 mL无菌吸管、玻璃涂棒、血细胞计数板、显微镜、紫外线等（15W）、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器等。

4。

4 实验方法与步骤
4。

4。

1 紫外线对出发菌株的诱变效应
1）菌悬液的制备：①取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支,用10 ml 无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块.②将上述菌液离心（3000 r/min,离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次,最后制成菌悬液。

③用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。

2）平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板27套,凝固后待用。

3)紫外线处理：①将紫外线灯开关打开,预热约20分钟.②取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。

③将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm,功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。

盖上皿盖,关闭紫外灯。

4）稀释：在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10—1-10—6（具体可按估计的存活率进行稀释）。

5）涂平板：取10—4、10—5、10—6三个稀释度涂平板,每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0。

1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。

以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照.
6)培养：将上述涂匀的平板,用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。

注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。

7)计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数,根据对照平板上菌落数,计算出每毫升菌液中的活菌数。

同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。

8）观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。

分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值(HC值）。

与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。

并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。

此斜面可作复筛用。

4。

4。

2 亚硝基胍对试验菌的诱变效应
1）菌悬液的制备：①将试验菌斜面菌种挑取一环接种到含5 ml淀粉培养液的试管中,置37℃震荡培养过夜.②取0。

25ml过夜培养液至另一支含5 ml淀粉培养液的试管中,置37℃震荡培养6—7h。

2)平板制作:将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板10套，凝固后待用.
3）涂平板：取0.2 ml上述菌液放到一套淀粉培养基平板上，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂满整个平板表面.
4）诱变：①在上述平板稍靠边的一个位点上放少许亚硝基胍结晶,然后将平板倒置于37℃恒温箱中培养24h。

②在放亚硝基胍的位置周围将出现抑菌圈。

5)增殖培养:①挑取紧靠抑菌圈外侧的少许菌苔到盛有20mlLB液体培养基的三角瓶中，摇匀，制成处理后菌悬液,同时挑取远离抑菌圈的少许菌苔到另一盛有20mlLB液体培养基的三角瓶中，摇匀,制成对照菌悬液.②将上述2只三角烧瓶置于37℃震荡培养过夜.
6）涂布平板:分别取上述两种培养过夜的菌悬液0。

1ml涂布淀粉培养基平板.处理后菌悬液涂布6套平板，对照菌悬液涂布3套平板。

涂布后的平板，置37℃恒温箱中培养48h。

实际操作中可根据两种菌液的浓度适当地用无菌生理盐水稀释。

注意每套平板背面作好标记，以区别经处理的和对照。

7)观察诱变效应：分别向菌落数在5-6个的处理后涂布的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。

分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值(HC值）。

与对照平板进行比较，根据结果,说明诱变效应.并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。

此斜面可作复筛用。

4。

5实验结果
1)将紫外线诱变结果填入下表;
稀释倍数
平均菌落
处理时间（数/皿)
诱变剂(min）
10—410—510-6存活率％致死率%
紫外线（UV）0（对照）
1
2）观察诱变效应，并填入下表；
4。

6问题和讨论
1) 用于诱变的菌悬液(或孢子悬液）为什么要充分振荡?2) 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？3) 分析你的实验结果：①你是否获得了比对照株产淀粉酶更高的突变株？试分析其可能的原因.②从你的实验结果中，说明致死率与诱变效应的相关性。

1。

4 实验方法与步骤
1。

4.1绘制试验菌的生长曲线
大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下,一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。

将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中,在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段.以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图，所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。

不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同.测定细菌的生长曲线,了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义.
通过细菌数量的测量，了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制试验菌的生长曲线(以细菌为例,如果试验菌是丝状微生物，测菌体湿重作为菌体生长量的指标)。

1) 将在种子培养基中培养20 h的培养液，3000rpm离心10min倾去上层液，加入无菌的生理盐水,成均匀液，细胞数达到109个/m1.
2）取10个盛发酵培养液的三角瓶，各接3m1菌液作种子，在摇床上相同位置30℃振荡培养，并立即取下一瓶为0时的增殖状态。

之后于培养1、2、3、4、5、6、7、8、9各取一瓶，约9个间隔的菌液分别吸取5m1菌于无菌试管中，置4℃下保存。

3) 用没接种的培养液为空白对照，将上述菌液于波长600nm处比色，但要求消光度在0.3-0。

6之间，若超过，用未接种培养液适当稀释.
1。

4.2 发酵
将产淀粉酶芽孢杆菌或产糖化酶黑曲霉斜面菌种接入含50ml液体发酵培养基的250ml三角瓶
中,30—32℃摇瓶发酵，50h后进行酶活力测定.(或挑取具有淀粉水解能力的菌株，接种于产淀粉酶发酵培养基中，振荡通气培养,设定发酵时间、取样时间，进行淀粉酶酶活力检测。

)
1.4.3 淀粉酶活力测定
见附录。

1。

5 实验结果
）将测定的OD600值填入下表:
光密度值OD600
2）以菌悬液0D值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出大肠杆菌培养的增殖曲线。

OD600值
培养时间（h）
报告你所分离的淀粉酶产生菌α—淀粉酶活力和葡萄糖淀粉酶活力结果。

1。

6 问题与讨论
1)如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同？两者各有什么优缺点?
2)细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短？若细胞密度为103／m1，培养4。

5h后，其密度高达2×108／m3，请计算出其代时。

3）次生代谢产物的大量积累在哪个时期？根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多？
4）测定还原糖有哪几种方法？各有什么优点和缺点？
2. 蛋白酶的发酵与酶活力测定
2。

1 实验目的
目的：1)了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线。

2）了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法.
内容：1）绘制试验菌的生长曲线.2)蛋白酶的发酵。

3）蛋白酶活力的测定。

2。

2 实验原理将活化好的试验菌种制成菌悬液,转接到产蛋白酶发酵培养基，直接进行发酵，30-32 ℃震荡培养48 h,将发酵液过滤或离心，取清液检测蛋白酶活力。

2.3 实验仪器与材料菌种：产蛋白酶芽孢杆菌斜面菌种;酶源：蛋白酶发酵液；培养基及试剂：产蛋
白酶发酵培养基；蛋白酶活力检测试剂；器具：紫外分光光度计、恒温水浴锅、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶等。

2。

4 操作步骤
2.4。

1 绘制试验菌的生长曲线（方法同上）
2.4。

2 发酵 将产蛋白酶芽孢杆菌接入含50 ml 液体发酵培养基的250 ml 三角瓶中,30-32 ℃摇瓶发酵，50 h 后进行酶活力测定。

（或挑取具有蛋白水解能力的菌株，接种于产蛋白酶发酵培养基中，振荡通气培养，设定发酵时间、取样时间，进行蛋白酶酶活力检测。

） 2。

4。

3 蛋白酶活力测定（紫外分光光度测定法）
1）原理：蛋白质或多肽在275 nm 波段处具有最大吸收值，利用蛋白酶同酪蛋白底物反应前后在三氯乙酸中可溶物的紫外吸收增殖,可表示蛋白酶活力高低。

将各管溶液混匀，40 ℃保温20 min ，用滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275 nm 的吸光值，用Excel 软件或最小二乘法求回归方程,并计算出1μg/ml 酪氨酸的吸光值。

3）操作：取5ml 用pH 8。

0硼酸缓冲液制备的0。

6％酪蛋白溶液于试管中，40 ℃预热2min 后加入1：20以pH8。

0硼酸缓冲液稀释的酶液1 ml,40 ℃反应10 min 后，加5 ml 0。

4mol/l 三氯乙酸以终止反应，并沉淀残余底物，40℃保温20min 使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm 的吸光值。

另以先加三氯乙酸使酶失活、后加酪蛋白的试管，按上述同样步骤测定吸光值,作为空白对照。

4）计算酶活力：以1min 内由酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm 的吸光值与1μg 酪氨酸相当时,其所需要的酶量为1个单位。

酶活力单位（U/ml ）=
n A A A **102
1—
式中，10-—反应时间10min ；A 1-—酶反应可溶物的吸光值；A 0-—空白对照可溶物的吸光值； A 2——1μg/ml 酪氨酸的吸光值。

2。

5 实验结果 报告你所分离的蛋白酶产生菌的蛋白酶活力结果。

2.6 问题与讨论 1）测定蛋白酶活力时,检测蛋白质水解产物除紫外分光光度法外，还可用什么方法？2)蛋白酶有哪些方面的应用。

附：相关培养基与试剂
产蛋白酶发酵培养基：玉米粉30 g，豆饼粉20 g，麸皮10 g，Na2HPO4 4 g，KH2PO4 0.3 g ，Na2CO3 1g，加水1000ml,pH 8.0，121 ℃湿热灭菌20 min。

蛋白酶活力检测试剂：
1）硼酸缓冲液(0。

05mol/L，pH8。

0）：称取硼砂（Na2B4O7·10H2O)19。

07g,溶于1000ml蒸馏水中,为A 液；称取硼酸（H3BO3)12。

37g，溶于1000ml蒸馏水中，为B液。

取A液30ml，B液70 ml,可得到100 ml0。

05mol/L,pH8。

0的硼酸缓冲液。

2）三氯乙酸溶液（0。

4mol/L）：称取65。

4g三氯乙酸以蒸馏水溶解定容至1000ml。

3）标准酪氨酸溶液(100μg/ml）：精确称取预先已在105℃干燥2-3h的L—酪氨酸0。

1g，逐步加入1 mol/L 盐酸6ml使溶解.用0。

2mol/L盐酸定容至100ml，得1mg/ml的酪氨酸溶液,取此溶液10ml，用0.2 mol/L 盐酸定容至100ml，即成100μg/ml酪氨酸溶液。

4．酪蛋白溶液（0。

6％）：用pH8。

0的硼酸缓冲液制备,称取酪蛋白0。

6g，用适量0.5mol/LnaHO湿润，以少许缓冲液溶之,然后在沸水浴中加热使完全溶解，冷却后调pH8.0，移入容量瓶,用缓冲液定容至100ml，置4℃冰箱保存,超过5d应另行配制.
实验三果酒酵母的分离、纯化及选育
果酒是利用新鲜水果为原料，在保存水果原有营养成分的情况下，利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。

果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分,还含有丰富的生理活性物质,经常适量饮用具有一定的保健作用.酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味,决定果酒品质的优劣。

果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母，前者的应用提高了果酒酿造的生产效率，后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的影响.野生型果酒酵母经分离纯化后，结合诱变、杂交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术，其酿造性能显著提高，酿造的果酒品质明显改善,因此果酒酵母的选育研究得到了重点关注。

本实验选用当季新鲜水果为原料，分离纯化3-5株酵母菌,并对其筛选使其适合果酒酿造。

一、实验目的和内容1。

学习掌握果酒酵母分离纯化的方法；2。

对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造.
二、实验原理
酿酒酵母细胞透明,呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为7×12μm,含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。

优良纯种酵母应具备下列性能:(1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。

（2）生长速度快，有较高的发酵能力,能将糖分全部发酵完.（3)具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。

(4）培养基成分简单，来源广泛,价格低廉，对温度，pH，离子强度,溶氧等环境因素不敏感。

（5）能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。

由此可见, 酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。

要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。

果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离,如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。

根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高,因
为它们的基质环境与酿酒环境很相似。

为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养,通过设置较高的酒精浓度、添加SO2、调整pH 等手段抑制不需要的微生物的生长,使希望检出的微生物得到增殖。

酵母检出后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。

三、实验仪器与材料
样品：新鲜水果榨汁。

YEPD 培养基（富集培养基）：蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母膏10g，蒸馏水定容至1000ml。

PDA培养基（酿酒酵母培养基）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml。

(马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮30分钟,然后用纱布过滤,再加糖及琼脂溶化后定容至1000 ml。

121℃灭菌30分钟。

）
PYG培养基（菌种保藏培养基)：蛋白胨3.5g，葡萄糖15g，酵母膏1。

5g，KH2PO42。

0 g，MgSO4·7H2O1.0 g，（NH4）2 SO41.0 g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000ml。

试剂:亚硫酸钠、乙醇，碘液，无菌生理盐水等.
器具:三角烧瓶（250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精喷灯、冰箱、玻璃涂棒,血细胞计数板，显微镜,磁力搅拌器，台式离心机,震荡混合器等。

四、实验方法与步骤
酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。

在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富,可针对不同水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。

1．酵母菌的分离初筛
1)菌种采样
样品土壤
叶片果实(带柄）腐果瓜根际土壤藤下方土壤垄间隙土壤
采集方法
用无菌小铲清去表层石块露出土壤后，戴好无
菌手套取500g左右的土样装入无菌袋内。

用无菌剪刀
剪取不同生
长阶段的叶
片装入无菌
袋内。

用无菌剪刀摘取
不同龄期的甜瓜
（幼龄期，膨大
期，成熟期）分
别装入无菌袋
内。

用无菌剪
刀摘取腐
烂的果实
装入无菌
袋内。

随机选择三块样地采样，每样采三份，将采集到的样品迅速保存在低温箱内(冰块降温）.
2)富集培养与纯种分离
方法一:配制YEPD培养基分装于100ml三角瓶内每瓶50ml高温灭菌冷却,然后分别取适量样品（土样1g，果皮5g ,果柄若干，叶片若干)各三份接种，120r/min，28℃摇床培养4天。

将富集培养液用接种环划线接种在PDA培养基上，每个样品接三个平板,28℃恒温培养.待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后,将其挑取于PDA平板划线并标号后28℃恒温培养。

待再次长出单菌落后，挑取划线于PDA培养基上，
28℃恒温培养。

菌种划线三到四次后基本纯化。

方法二：将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养。

腐果表面长有白色菌落，镜检为酵母菌后,用接种环将其划线至PDA培养基上,28℃恒温培养。

待长出单菌落后,挑取划线于PDA培养基上,28℃恒温培养。

菌种划线三到四次后基本纯化。

2．酵母菌种的复筛
选择果酒生产中生产性能优良的新鲜果汁液作为复筛培养基。

将初选菌种接入保藏培养基。

培养24 h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23—25 ℃的培养箱中培养,测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发酵的酵母菌种。

发酵力试验：采用CO2失重法,取100 mL 三角瓶（已经烘干、称重），各加入80 mL果汁，置于80℃的水浴杀菌5min，冷却到30℃后，按每升接种30 mL的比例分别接入酵母种子液，在20 ℃下发酵。

发酵过程中每24h 测定1次CO2损失量,每次测定时，摇晃瓶子，以排出CO2。

随着发酵时间的延续,瓶重逐渐减轻，直到减轻量不高于0。

2 g，即表示发酵结束,以CO2失重量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线,并确定菌株发酵力的强弱。

3．酵母菌的耐受性试验
采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（8％、10％、12％、14%、16％、18％、20％）、二氧化硫(60、80、100、120、140、160、180、200 mg/L）的耐性.将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中，在相同条件下培养,观察杜氏管中气泡产生情况，重复3 次。

活化条件：28 ℃条件下,将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h
发酵条件：28℃条件下，水果原汁培养基中静止发酵4 d；
接种量:1×107 cfu/mL.
1）耐酒精度试验
采用先分别量取无水酒精8、10、12、14、16ml, 再以水果原汁为培养基，制成含酒精量为10%、12％、14％、16% 、18％系列的液体培养基.
按下表在试管中加入果汁.然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115℃ 20min灭菌.灭菌完后,待试管温度为常温后按下表加入酒精,加完后摇匀。

最后在每个编号试管中接入对数期酵母1×107个,28℃静止培养。

观察产气情况,选出耐酒度比较好的菌种。

将标签贴于各试管上，标10、12、14、16、18，按下表每管加入果汁量:
试管编号0 10 12 14 16 18 20
95%酒精/mL 0 1。

05 1.26 1.4 1。

68 1。

90 2.15
果汁/mL 10 8。

95 8.74 8。

60 8。

32 8。

10 7.85
培养液含酒精％（v/v) 0 10 12 14 16 18 20
2）耐SO2试验
按亚硫酸含量为6％计, 计算出60、100、120、180、240 mg/L浓度所需的量，分别加入到果汁中制成SO 2 不同浓度系列的液体培养基。