动物遗传学 第十一章 动物基因工程

SV40病毒
1、优点
基因组是由5224bp 构成的双链、共价闭 合的DNA小分子；
其复制和转录已很 清楚； 感染率高，每细胞感染病毒的量也很多；
DNA复制的量大，能产生大量外源基因所编码的蛋 白质；
能提供完整的真核基因转录所需的成分。
2、对猴细胞的裂解侵染
初期：在侵染的最初8h， 病毒颗粒去掉外壳，DNA 向寄主细胞核移动；
基因工程的基本操作程序
目的基因的获取；
用工具酶对目的基因和载 体进行加工处理，把目的基 因与载体结合成重组DNA分 子；
把重组的DNA分子引入受 体细胞，并使目的基因和载 体上其他基因得以表达；
转化体细胞的扩增、鉴定 与筛选。
第二节 基因操作中的工具酶
一、限制性内切酶
(一)限制内切酶的概念
(二) 平头末端连接
T4DNA连接酶可催化 相同和不同限制性核酸内 切酶切割形成的平头末端 之间的连接。
平末端的连接效率要远 远低于粘性末端，一般只 有粘性末端连接效率的 1%。
可通过载体末端去磷酸 化、增大目的DNA片段 浓度等方法提高连接效率。
(三) 人工接头连接
人工接头：是人工 合成的具有特定限制 性内切酶识别和切割 序列的双股平端DNA 短序列，将其接在目 的基因片段和载体 DNA上，使它们具有 新的内切酶位点。
载体具备的基本特点：
①在宿主细胞中能独立自主地复制； ②表达载体含有强启动子，能驱动靶基因在宿主细胞中表 达； ③容易从宿主细胞中分离纯化； ④载体DNA基因组中有一段不影响它们复制的非必需区域， 插在其中的靶片段能被动地跟着载体DNA一起复制，就像载 体的正常成分一样。
载体的种类(按用途)
早期：接着4h，合成早 期mRNA和蛋白质，寄主 细胞DNA的合成也受到病 毒诱导和刺激；
晚期：早起后36h，合成病毒DNA、晚期mRNA和 晚期蛋白质，以病毒的组装和寄主瓦解而告终。
第四节
获取真核生物目 的基因的方法
一、利用PCR法获取基因
(一)PCR的概念
* PCR：即聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)， 是一种在体外快速扩增特定 基因或DNA序列的方法。 * 由1985年穆里斯（K. Mullis） 发明，他也因此获得了1993 年的诺贝尔化学奖。
5 OH 3 OH 3
mRNA
AAAnA
Alkali digestion of mRNA template
cDNA
TTTnT 5
DNA polymerase I dNTPs
AAAnA
OH 3
TTTnT 5
S1 nucleaseFra bibliotekOH 3 5Single-stranded hairpin susceptible to S1 nuclease
1次约20min
1次4～6min
(三) PCR引物
PCR引物是一段长度10～30bp的单链DNA序列。 1、特异引物：引物序列与目的基因DNA完全配对。 2、同源引物：根据同源序列设计的扩增同源基因 的引物。 3、简并引物：根据蛋白质序列设计的引物。 4、随机引物：人工随机合成的引物。
(四) 引物设计的原则
(二) 质粒的类型
严谨型质粒——每个细胞中有1～2个拷贝，具有 自身传递能力，分子量大。 松弛型质粒——每个细胞中有10～100个拷贝， 不具有自身传递能力，分子量小。基因工程常用 此类质粒。 常用的质粒有：pBR322、Psc101、ColE1、 Psc134等。 质粒载体一般能克隆10Kb左右的DNA片段。
第十一章
动物基因工程
（Animal Genetic Engineering）
第一节 基因工程概述
基因工程：是应用DNA重组 技术，把供体细胞中的基因或 基因组提取出来，按照预先设 计的蓝图，经过体外加工重组， 或者把人工合成的基因转移到 受体细胞，并获得新的遗传特 性的技术。
基因工程的核心技术是DNA 的重组技术，还包括基因的表 达技术、基因的突变技术、基 因的导入技术等。
pBR322质粒
①4363 bp
②含一个复制点
③含一个抗氨卞青霉素标记 (ampR)
④一个抗四环素标记(tetR)
⑤ampR和tetR基因内各有一些限 制酶的酶切位点，供外源基因插 入。
当外原基因插入抗药基因位点 时，AmpR→Amp敏感(AmpS )、 TetR→Tet敏感(TetS).
pUC系列质粒
限制性内切酶：简称 限制酶，是一类能识别 双链DNA分子中特定核 苷酸序列，并由此切割 DNA双链结构的核酸内 切酶。
(二)限制性内切酶的命名
属名＋种名＋菌株类型＋限制性酶种类
(三)限制性内切酶分类
(四)Ⅱ型限制性内切酶的基本特征
在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割，使 DNA双链断裂。 识别序列一般为4、5、6个碱基对。 切割方式有两种：平头末端和粘性末端。
Streptomyces albus Subspecies pathocidicus 白色链球菌
酶名称 BamHⅠ
Bgl Ⅱ EcoRⅠ Hind Ⅲ
PstⅠ SalⅠ
识别顺序 GGATCC CCTAGG
ACATCT TCTACA
GAATTC CTTAAG
AAGCTT TTCGAA
CTGCAG GACGTC
(三) 理想质粒载体的基本要求
能够在宿主细胞中大量自我复制，以便得到大量的重 组DNA分子。 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点 插入外源DNA片段。 分子量应尽量小。 包含一个可供选择的标记基因，其中间可插入一段外 源DNA而失活，导致表型改变。 包含一个标记基因，以区别转化细胞和非转化细胞。
AAAnA
3
TTTnT 5
Double-strand cDNA
3、锚定PCR与基因克隆
特点是有一个 特异性的引物。 适合于扩增那 些只知道一端序 列的目的DNA。
4、DDRT-PCR法
即差异显示反 转录PCR。 是一种根据两 种组织之间的差 途径
溶菌性生长
溶源性生长
三、科斯质粒(Cosmid)
由DNA的Cos区与质粒 构建，容量35～40kb，又 叫粘性质粒。 环状双链DNA。 特点：①含质粒的抗性 标记如Amp，Tet；②带 Cos 区 ， 可 进 行 体 外 包 装 ；③一个或多个酶切位点 ；④分子量小，容量)：是指一个 包含了某一A的提取和大小片段的制备； ②载体DNA的制备； ③载体与外源大片段连接； ④体外包装及基因组DNA的扩增； ⑤重组DNA的筛选和鉴定。
GTCGAC CAGCTG
产生的末端类型 5’突出
平头末端 5’突出 5’突出 3’突出 5’突出
(五)Ⅱ型限制性内切酶的主要用途
1、重组DNA分子 2、绘制物理图谱
二、DNA聚合酶
三、DNA连接酶(DNA ligase)
DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双 链DNA中一条链的3'－OH与另一条链的5'－PO3H2 形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长 链。
(二) PCR的原理
体外复制DNA片 段。 包括高温变性、 低温退火和中温延 伸过程。
PCR与大肠杆菌DNA复制的差异
大肠杆菌DNA PCR
1、引物
RNA
DNA
2、酶
DNA聚合酶Ⅲ TaqDNA聚合酶
3、模板的解链方式 酶和蛋白质作用 热变性
4、温度
37℃
3个温度
5、校对功能
完善
易突变
6、循环
四、YAC载体
YAC是酵母人工染色体的缩 写，是目前能容纳最大外源 DNA片段(100万碱基以上)。
YAC的主要缺点： 1．存在高比例的嵌合体； 2．部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排； 3．难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的 结构。 4．操作时容易发生染色体机械切割。
常用限制性核酸内切酶的特性
微生物名称 Bacillus amyloliquefaciens H 解淀粉芽孢杆菌
Bacillius globigil 球芽孢杆菌
Escherichia coli RY13 大肠杆菌
Haemophilus influenzae 流感嗜血菌
Providencia stuartii 164 普罗威登细菌
2、质粒大小：相差很大(从小于1Kb到大于500Kb)， 都有一个复制起点。
3、质粒的拷贝数：高拷贝质 粒可以有10～100个拷贝，低 拷贝只有1～4个拷贝。
4、质粒的不亲和性：也称不 相容性，两种或两种以上亲缘 关系密切的不同质粒不能够在 同一宿主细胞中稳定地共存。
5、质粒的宿主范围：窄宿主范围质粒(只能在一种特 定的宿主细胞中复制)和广宿主范围质粒(复制起始点 不特异，可以在许多细菌细胞中复制)。
1、引物长度：通常在15 ～30核苷酸之间 。 2、G/C含量：一般在50%左右。 3、引物二聚体：不应出现。 4、引物交叉二聚体：不应出现。 5、发夹结构：避免。 6、结合位点：应该只出现一个。 7、引物3’末端最好以G/C结束。
(五) 基于PCR的基因克隆
1、通过反向 PCR进行基因 组DNA片段的 克隆
1、克隆载体：以繁殖DNA片 段为目的的载体。
2、穿梭载体：既能在真核细 胞又能在原核细胞繁殖的载体。
3、表达载体：用来将克隆的 外源基因在寄主细胞内表达成 蛋白质的载体。
一、质粒 (plasmid)
(一)质粒的一般性质
1、质粒的概念：是细菌 细胞染色体外存在于细胞 质中能进行自我复制的一 类小型DNA由已知氨基酸 序列推测可能 的DNA序列
第五节 DNA体外重组与基因转移
一、载体与目的基因的连接
(一) 粘性末端连接法
同一种酶切割不同DNA 分子产生相同的突出末端； 不同酶切割不同DNA分 子产生相同的突出末端。 不相同的突出末端，先补 平(Klenow)或修平后再连 接。
碱性磷酸酶 T4多聚核苷酸激酶
末端脱氧核苷酸转移酶
活性 识别特异序列，切割DNA 催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基 形成磷酸二酯键 以DNA为模板合成DNA 以RNA为模板合成DNA 切除末端磷酸 催化核酸5'-羟基磷酸化 催化3'-端合成同聚体尾
第三节 基因克隆常用的载体
载体(vector)：是把外源基因(目的基因)片断引入 受体细胞，并在其中能自我复制的小型DNA分子。
五、动物病毒
1、作为基因转移的病毒载体须具备以下基本 条件：
具有动物病毒的复制起始部位及启动子； 具有可供选择的标记基因； 具有适当的多种单一内切酶位点供外源基因插入。
目前常用的基因转移载体有：(1)猴空泡病毒(SV40)；(2)腺病毒 (adenovirus)；(3)乳头状病毒(papilloma virus)；(4)逆转录病毒 (retrovirus); (5) 牛痘(vaccinia)病毒; (6)牛疣病毒(bovine papilloma virus)等。
(1)两个双链DNA片段连接起来
5ˊ- ACG AATTCGT-3ˊ T4DNA连接酶 5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ
3ˊ- TGCTTAA GCA-5ˊ
3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ
(2) 修补带有缺口的双链DNA分子
T4DNA连接酶
重要的工具酶
工具酶 限制性核酸内切酶
T4 DNA连接酶
DNA聚合酶 逆转er 3 OH
TTTnT 5
是一种酶促合成法。
5 OH 3
OH 3
mRNA
AAAnA
Poly A tail
Reverse transcriptase dNTPs
cDNA
TTTnT 5
以mRNA为模板，在反 转录酶的作用下，以4种 脱氧核苷三磷酸为材料合 成DNA(cDNA)，再经复 制后即成双链DNA。
由pBR322和M13噬菌体构 建而成的双链质粒载体；
2674bp； 有ampr和与M13噬菌体相 同的多克隆位点(MCS)；
有一个来自大肠杆菌的LacZ 操纵子的DNA片断, 编码半乳 糖苷酶。
二、λ噬菌体
双链线状DNA分子， 全长49kb， 含65个基因，
在其分子两端各含有12 个碱基的互补单链，是天 然的粘性末端，被称为 COS位点。