动物细胞传代培养

动物细胞传代培养
一、【实验目的】
1、掌握消化法细胞传代培养的原理
2、了解细胞传代培养所需专用设备、试剂
3、学习细胞传代培养操作
二、【实验原理】
动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。

这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。

80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。

消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。

三、【实验仪器及试剂】
仪器：改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、抽滤装置、超纯水器、倒置显微镜、二氧化碳培养箱
试剂：PE液、0.25%胰蛋白酶液、MEM+10%小牛血清液
其中，二氧化碳培养箱用于开放或半开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出至培养箱中，再通过稳定调节箱中5%的CO2，与培养基中的NaHCO3处于动态平衡状态，使PH保持稳定。

四、【实验内容及步骤】
（1）内容
成纤维细胞传代培养6天，细胞汇合长满培养瓶底，刚传代好的细胞，圆球型亮圈，呈流动状态，传代培养1天，细胞贴壁，数量还不太多，上皮细胞培养至细胞汇合长满培养瓶底。

1、用酒精棉球擦拭培养用液瓶盖，打开瓶盖在酒精灯火焰上一过，盖上瓶盖，但不必拧紧
2、将培养瓶内的旧培养液倒入烧杯中（注意瓶盖在酒精灯火焰附近），旧培养液倒掉后，镜下观察细胞十分干净、清晰
3、从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器，注意吸管的刻度面向上，加样器的柄面偏左侧，以便于操作时观察。

4、将吸管过火焰（竖向横向各过一到两次），吸取PE液5ml从侧面加入瓶内，平放轻摇40下，放置2~5分钟将PE液倒出
PE液的作用：络合、吸收、去除维持组织完整性的钙、镁离子，促进细胞分离，钙、镁离子有抑制胰酶的消化作用，因此用PE液去除，将残余未倒尽的血清除尽，因为血清也会抑制胰酶的消化作用；洗去未倒尽的死细胞。

5、吸取胰酶0.3ml，将胰酶加入瓶中，加入时直冲细胞贴壁处，平放轻摇，使酶液漫过整个瓶底部，放置1-2分钟，可于镜下观察，并轻拍
6、在倒置显微镜上观察，发现细胞质渐渐回缩，细胞间隙增大，细胞慢慢变圆时用手掌拍打瓶底和瓶侧，使细胞从瓶壁脱落下来并悬浮和流动起来，再在显微镜下观察。

胰蛋白酶的作用：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，水解除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，从而使细胞分离。

胰蛋白酶液浓度越高，消化作用越强，但超过一定限度会损伤细胞，消化时间也要适度。

7、准备好一个新瓶，松开瓶盖一圈，吸取MEM培养液5ml准备加入培养瓶，将培养液加入原培养瓶，用吸管向瓶壁吹吸数次，混合成均匀的细胞悬液后，吸出2ml，装入一新瓶内，剩余的留于瓶内，再在两瓶中分别加入1ml和2ml的新鲜培养液，将培养瓶口及盖过火焰后拧紧，做上标记。

刚传代好的细胞，圆球型亮圈，呈流动状态，数量较少。

培养：
将传代好的培养瓶放置于合适温度的培养箱中（视不同细胞要求而确定培养温度）培养细胞由刚传代好时的圆球型（游离期）→贴附（贴壁期）→伸展（铺展）→扁平或梭型或多边形→繁殖→长满整个培养瓶底→下一次传代（或冻存）
（2）具体操作步骤
1、75%酒精消毒双手、工作台面、培养瓶、瓶盖、试管，并过火焰。

2、加入2mlPE于侧壁，轻摇后倒掉
3、再加入5ml PE于侧壁，轻摇4-5min，于镜下观察，倒掉。

4、加入0.3ml 胰酶，扭紧瓶盖，观察，并轻拍
5、大部分细胞脱壁后加入5mlMEM(含10%血清)，吹打
6、将2ml细胞悬液移至玻璃培养瓶中，并取3ml MEM，加1ml MEM于玻璃培养瓶中，另外2mlMEM加入到塑料培养瓶中，过火焰，扭紧瓶塞。

7、标记如FG（细胞名），时间，操作人1-名字
8、移液管用过后不能再使用，以防污染
五、【实验结果及讨论】
细胞经过传代培养，细胞由初期的球形游离期转变为贴壁期，再转变为伸展期，在培养瓶上呈现扁平或梭型或多边形细胞形态，最后长满整个培养瓶底。

实验图片如下：
游离细胞
细胞贴壁
这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面,细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长，繁殖。

当细胞在该表面生长后，一般呈扁平或梭型或多边形，这里的泥鳅心脏组织细胞的贴壁细胞成纤维细胞型。

成纤维型细胞：形态与体内成纤维细胞相似而得名，细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2-3个长短不同的突起。

卵圆形核
胞质突起
胞质突起
六、【实验注意事项】
1、严格的无菌操作
2、适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注
意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

3、注意EDT A不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁
七、【思考题】
1、细胞传代培养的目的是什么？
答：通过控制一定的生长环境，抑制其他细胞的生长从而达到纯化的目的。

2．判断细胞健康的标准是什么？
答：生长状态良的健康细胞：透明度大、细胞内颗粒少、没有空泡，胞膜清晰,胞液清晰透明，悬浮细胞碎片少。

生长状态不良的细胞：胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒，细胞之间出现空隙，细胞形态不规则。