高效液相色谱HLPC共47页文档

反相色谱常用流动相及冲洗强度 H2O<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃 最常用组成：甲醇/H2O、乙腈/H2O 洗脱顺序：极性物先洗脱下来 正相色谱常用流动相及冲洗强度 正乙烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇
二、分离模式
• 正相HPLC • 反相HPLC • 离子交换HPLC • 凝胶HPLC • 亲和HPLC
3.标准加入法：以欲测组分的纯物质作内标物加入到待测样 品中
五、临床应用
• 氨基酸的分析 • 蛋白质、酶及多肽 • 糖类 • 核酸类 • 药物及毒物
1.紫外吸收检测器
2.荧光检测器
4.示差折光检测器
检测器
• 表.HLPC常用检测器
原理
检测下限（g/ml） 检测范围
紫外检测器 具有紫外吸收性质 10-7
荧光检测器 具有荧光物质
10-14
电化学检测器 具有电解活性物质 10-12
蛋白质、核酸、 氨基酸、多肽、 激素等
多环芳烃、氨 基酸、维生素 等
• 原理：用离子交换剂作固定相，根据不 同组分在一定pH下，组分电荷性质和数 量不同而分离的技术
• 分类：阳离子交换树脂：含酸性基团： 磺酸基、磷酸基等
阴离子交换树脂：合碱性基团：
季胺基、叔胺基等 应用：核酸、蛋白质、氨基酸等
（四）凝胶HPLC
（gel HPLC ,G- HPLC ）
• 原理：基于分子大小和形状的差异进行 分析的技术
食品、环境、 生化、医学等
示差折光检测器 与流动相折光率不同 10-7
糖类等
（五）不同HPLC产品介绍：
高效液相色谱仪器（１）
高效液相色谱仪器（2）
高效液相色谱仪器（3）
高效液相色谱仪器（4）
四、定性和定量
定性分析 １．保留值定性：比较未知峰与标准物的保留
值 ２．收集未知峰洗脱液定性：物理分析，化学
三、 HPLC仪器
HPLC仪 一般由输液系统、进样 系统、色谱柱、检测器、记录和 数据处理系统及计算机等几部分 组成
（一）输液系统：
• 贮液及脱气装置 • 梯度洗脱装置 • 高压输液泵
梯度洗脱装置
• 高压输液泵
（二）进样系统：
（三）柱系统：
（四）检测器：
与泵、柱组成HPLC的 三大关键部件
高效液相色谱
（high performance liquid chromatography,HPLC）
中南大学湘雅医学院医学检验系 徐克前
一 基本原理
（Байду номын сангаас）定义
• HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和 流动相之间的分配系数不同，进行连续的、 无数次的交换和分配而达到分离的过程。
组成： 固定相—柱内填料
(3) 短链烷基键合物
短链烷基（c3、 c4等）＋大孔硅胶 适用于氨基酸、小肽等生物小分子
键合物
(4)键合到基质上的官能团性质
• 反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，如 C18 、C8 、C4等
• 正相柱：填料是极性的，官能团为－CN、－ NH2等
• 离子交换键合相：阳离子官能团：－SO3H、 －COOH等
（reverse phase HPLC ,RP- HPLC ）
• 固定相：非极性物质，如C18(ODS)、 C10、C8 、C6 、C4 、C2
• 流动相：极性溶剂，如甲醇/H2O、乙腈/H2O等 • 洗脱顺序：极性、弱极性、非极性 • 应用：蛋白质、多肽等
（三）离子交换HPLC
（ion-exchange HPLC ,IE- HPLC ）
• 固定相：交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶 • 流动相：水、乙醇、丙酮等 • 应用：核酸、蛋白质、酶、多糖等
（五）亲和HPLC
（affinity HPLC ,AF- HPLC ）
• 原理：利用生物大分子间专一的亲和力 进行分离的技术
• 固定相：基质（琼脂糖凝胶等）交联配 基（亲和性）
• 应用：酶、抗体、抗原、受体等
分析，生物学 分析 ３．联机定性：液质联用（ＨＣＬＣ－ＭＳ） 液红联用（ＨＣＬＣ－ＩＲ）
定量分析
• 分析检测物质的量（或浓度）与检测器的 响应值（峰面积或峰高）呈正比
1.标准曲线法：也称外标法或直接比较法。用标准品等体积 直接进样，得标准曲线，再用待测样品的峰面积（或峰高） 与其对照
2.内标法：选择适宜的物质作为欲测组分的内标物加入到样 品中，内标物的选择是关键
（一）正相HPLC
（normal phase HPLC ,NP- HPLC ）
• 固定相：极性吸附剂（或极性键合 相），如硅胶、Al3O2
• 流动相：非极性或弱极性溶剂，如己烷、 庚烷等
• 洗脱顺序：非极性、弱极性、极性
• 应用：石油化工产品、染料、农药、医 药、有机酸、有机碱等
（二）反相HPLC
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硅胶 有机硅烷
R2
键合相
X: Cl、CH3O、C2H5O等 R: 烷C8(C8H17) 、C10(C10H21) 、C18(C18H37)等 R1 R2: Z、CH3等
(2)十八烷基硅烷键合硅胶填充料 （octadecylsilyl, ODS）—万能柱 即C18柱或ODS柱
主要用于反相HPLC中，适用于各种类型的生物 分子
流动相—洗脱剂
（二）固定相（stationary phase)和 流动相（mobile phase）
(1)化学键合相硅胶
化学官能团键合到硅胶表面
OH OH
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硅胶（SiO2• nH2O） ––Si –O –Si ––
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键合相反应
R1
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–Si –OH + X–Si–R ￫ –Si –O–Si–R + HX
阴离子官能团 －NH2、
－ R4N+等
2、流动相
（mobile phase）
• 流动相选择原则：
• 1.样品易污，且溶解度尽可能大 2.化学性质稳定，不损坏柱 3.不妨碍检测器检测分析 4.粘度低，流动性好 5.易于从中回收样品 6.无毒或低毒，易于操作 7.易于制成高纯度，即色谱纯 8.废液易处理，不污染环境