有机酸工艺学-柠檬酸发酵微生物与发酵机制2

1-扇形划线法 2-分区划线法 3-方格划线法 4-连续划线法
■ 该法简单、快速、易行、理想的单菌落获得率较低。
（2）稀释平板分离纯化培养
■ 取已经灭菌的装有9mL无菌水试管数支，做好标 号，另用无菌吸管吸取上述玻璃珠振荡而制得的悬 浮液少许，注入1号试管内，充分的摇匀，吸取此 悬浮液1mL注入第二支试管中，以此类推，直至最 后一支试管，每稀释一管，必须更换一支无菌吸管。 再从最后2-3支无菌试管中吸取1mL倒入融化冷却 至42-45℃的麦芽汁培养基中，充分摇匀，静置凝 结成平板。倒置于恒温箱中，于35～37 ℃下培养 40～48h，挑取单个菌落，移接到斜面试管培养基 中，待检。
■ 在柠檬酸产酸期，也存在HMP途径的酶，其比率为 EMP/HMP=4:1，即80%的葡萄糖由酵解途径代谢的。 HMP途径主要存在于孢子形成阶段，因为它提供合成核酸 所需的前体物质。
五、黑曲霉积累柠檬酸基本条件： 耐受高浓度柠檬酸（20%以上） 耐受高浓度葡萄糖，粉浆浓度18%-20% 对磷、锰、铁、锌等无机盐耐受
（2）发酵过程pH值的变化
■ 在发酵过程中，随着菌种对培养基种碳、氮源的利用，随着有机酸和氨基 酸的积累，会使pH值产生一定的变化。
■ ①生长阶段：菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质，生成铵 离子，使pH上升至碱性；随着菌体量增多，铵离子的消耗也增 多，另外糖利用过程中有机酸的积累使pH值下降。
■ ②生产阶段：这个阶段pH值趋于稳定。 ■ ③自溶阶段：随着养分的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中
浓度范围
u2+
高浓度Mn2+将刺激乙酰辅酶A，造成草酰乙酸浓度下降，不利 于合成柠檬酸。
高浓度Zn2+抑制柠檬酸合成酶，不利于合成柠檬酸。当培养基 中 Zn2+浓度低时, 黑曲霉的生长受到抑制从而进入柠檬酸积累 阶段。
适当的 Mg2+有利于提高柠檬酸产量 ,但过量的 Mg2+使黑曲霉生 长受到限制 ,最终导致产酸减少。
2.分离筛选(纯化)方法
平板划线分离纯化培养 稀释平板分离纯化培养 小滴分离纯化培养
前两种方法不易一次就分离到纯的黑曲霉柠檬酸生产菌株， 要反复进行数次。
➢ 分离筛选的主要原理是在平板上出现有单孢子形成的肉眼可见的单 菌落中，挑选具有以下特征的菌落：
■ （1）成熟时菌落中央稍隆起，出现绒毛状覆盖物者； ■ （2）分生孢子梗短，分生孢子头大，圆形黑色，老熟时开花状； ■ （3）次生小梗少，大部分不分枝；
氨基氮增加，致使pH又上升，此时菌体趋于自溶而代谢活动终 止。
pH值
培养过程中培 养液pH值的大 致变化趋势
培养时间
由此可见，在适合于菌生长及合成产物的环境条件下， 菌体本身具有一定的调节pH的能力，但是当外界条件变 化过于剧烈，菌体就失去了调节能力，培养液的pH就会 波动。
该方法操作要细、要严，易分离到单细胞的纯菌株
3.摇瓶筛选与性能测定
摇瓶筛选
挑出单一菌落
33℃
麦芽汁琼脂斜面 培养6-7d
分别接入三角瓶
摇瓶发酵(初筛,复筛)
筛选出产柠檬酸高、糖酸转化率高、产 酸稳定性强的菌株
性能测定
抽取发酵液 1ml
0.1mol/
产酸高
L NaOH滴定酸
度
测定柠檬酸产量
纸层析
草酸定性检验
小滴分离培养
■ 在显微镜下检查每个小滴，记下只有一个孢子的
小滴位置，把它们置于33 ℃恒温箱内培养2～5d， 挑选出单菌落，于斜面试管培养基上。
■ （b）取与培养皿内径大小相同的滤纸3～4层，浸泡在溴甲 酚绿的培养液中，取出，放在培养皿内，盖好皿盖，一起 灭菌。吸取上述稀释好的悬浮液，点布在滤纸上，每皿平 均点20～25滴，每滴约出现10个菌落。置于33 ℃恒温箱内 培养2～5d，挑选出单菌落，于斜面试管培养基上。
■ 四、黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征
■ ①能耐高浓度柠檬酸（20%以上），而不利用和分 解柠檬酸。
■ ②耐高浓度葡萄糖（25%），
■ ③黑曲霉糖化酶最适作用pH在4.0～4.6，最适温度 为60～65℃，
■ 柠檬酸黑曲霉产生和分泌大量的酸性α-淀粉酶和酸 性糖化酶，其中α-淀粉酶在pH2.0能保持原活力的 80%以上，在pH2.5，40℃下作用30min尚不失活。 在柠檬酸发酵条件下，当培养pH下降至2.0以下时， 仍能保持大部分活力。
■ ⑥形成菌丝球
■ 深层液体通风培养时，能形成大量的细小菌球体， 菌球体直径为0.1mm,菌球体数量达104个/mL以上。 极大地降低发酵醪的黏度。
■ ⑦ NH4+浓度调节在生长、繁殖期，细胞内具有较高水平的 氨基酸、NH4+,即NH4+库水平高；在产酸期，细胞内蛋白质， 核酸水平低
■ ⑧具有很强的侧系呼吸链活性，此侧系呼吸链不产生ATP.
■ 传统淀粉质粗料发酵模式的液化工艺缺乏精细化调控，液化组分中多糖分 子量分布不均， 导致后期发酵过程不稳定
■ 衡量液化工艺的标准：
■ DE值，残淀粉量，制糖粮耗，能耗（时间、温度）
影响液化的因素：最佳温度、最佳 pH、最佳加酶量和最佳 液化时间
液化温度 95 ℃ ，调浆 pH 5. 4、加酶量 0. 5 kg /t, 时间90分钟
3.2发酵控制技术
一. 发酵温度为36±1℃。 二．pH自然5.5， 三．溶氧控制通风搅拌 四. 菌体浓度和基质对发酵的影响及其控制 五. 发酵终点控制
一、 发酵温度为35±1℃
■ 1、最适温度的选择
■ 在生长阶段，应选择最适生长温度； ■ 在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。 ■ 发酵温度可根据不同菌种、不同产品进行选择
2020408思考题
■ 查阅文献并结合课程内容阐述二价阳离子金属盐：Mn,Zn,Mg,Fe,Cu,Ca对黑曲霉柠檬酸发酵的影响？这 些盐离子在柠檬酸发酵时的浓度控制在什么范围？ 0.02% Mn2+ 、0.01% Zn2+ 、0.01% Cu2+ 、0.1% Fe2+ 条件下不影响产酸。
金属离子
对黑曲霉柠檬酸发酵的影响
Ca2+ 高浓度Ca2+抑制柠檬酸合成酶，不利于合成柠檬酸。
<0.01%
第三节 柠檬酸深层发酵工艺及控制条件
■ 1、柠檬酸深层发酵工艺 ■ 2、柠檬酸发酵原料预处理 ■ 3、柠檬酸深层发酵控制技术
1、柠檬酸深层发酵工艺
■ 不同原料的深层发酵工艺大同小异，主要差别在于： ■ ⑴原料处理工艺的不同，薯干粉、木薯粉、大米粉
该法简单、易行、分离的菌落较为均匀、 单一，纯菌获得率大。
（3）小滴分离纯化培养
➢ （a）将待分离纯化的孢子悬浮液接入无菌水中，经多次稀释 至1500个活孢子/ml，用校正口径的滴管吸取并滴布在无菌的 盖玻片上，把盖玻片小心翻转扣在凹形载玻片的空穴上，穴 内加一滴已灭过菌的培养液，盖片与载玻片之间用凡士林密 封。
■ 补充发酵所需氮源 ■ 与聚戊糖、色素等胶体杂质影响后期发酵和提取收率。 ■ 过滤去渣
玉米中脂肪
玉米原料喷射液化过程
喷射液化技术原理
■ 黑曲霉糖化酶作用于长链的活性更大 ■ 研究发现黑曲霉糖化酶对低聚糖的 ■ Km 值为 0. 02 ～ 0. 14 mmol /L
麦芽糖 Km 值为 0. 18 ～ 1. 4 mmol /L，
■ 具有氰化物非敏感性呼吸侧链（即水杨苷氧肟酸敏感性呼吸 侧链），此侧呼吸链不产生ATP。在柠檬酸产期，一旦通气 （供氧）突然切断时，柠檬酸生产量发生不可逆转的降低。
■ ⑨在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上，生长不好，生 成小菌落，孢子形成能力弱。
■ 黑曲霉柠檬酸产生菌在生长期，葡萄糖的降解是由酵解 （EMP）和磷酸戊糖途径（HMP）共同完成的，其比率为 EMP/HMP=2:1。
六、黑曲霉分离纯化和诱变筛选 1.分离筛选(纯化)培养基
麦芽汁琼脂：适用于霉菌、酵母的分离 米曲汁琼脂：适用于霉菌、酵母的分离 马铃薯琼脂：适用于霉菌、酵母的分离 察氏琼脂：适用于所有霉菌，能分离较多的菌株 酸性蔗糖琼脂：抑制不耐酸的霉菌，适用于耐酸的黑曲霉分离纯化 酸性薯干粉平板：分离直接利用薯干粉的耐酸黑曲霉 酸性淀粉平板：分离直接利用淀粉的耐酸黑曲霉 酸性玉米粉平板：分离直接利用玉米粉的耐酸黑曲霉
主要是乌头酸水合酶及异柠檬酸脱氢酶的激活剂，柠檬酸发酵 开始时，需要少量铁存在以促进菌体生长和为柠檬酸合成作准 备，随后要控制Fe2+的存在才能开始并大量积累柠檬酸。
能抑制柠檬酸裂解酶的活力，培养基中添加适量 Cu2+, 有利于 得到较高产量的柠檬酸 。
<0.02% <0.01% <0.1% <0.1% <0.01%
可获得单孢子的纯柠檬酸生产菌株。
（1）平板划线分离纯化培养
■ 用无菌吸管取上述“富集”培养液于盛有无菌水及 玻璃珠的三角瓶中，置于摇瓶上振荡5分钟，使菌悬 浮于水中，将接种环经火焰灭菌并冷却后沾一环上述 悬浮液于已灭菌的麦芽汁加2%琼脂平板上，划线后， 倒置于35-37℃保温箱中，培养40-44小时。挑取适当 的单一菌落，移接到麦芽汁斜面试管培养基上，待检。
3、柠檬酸深层发酵控制技术
■ 3.1培养基制备：
■ （1）种子罐培养基及培养：玉米液化液10～11%，（NH4） 2SO40.5%，0.1MP蒸汽灭菌30min，接入1000ml三角瓶麸曲 菌种20～50只（根据发酵罐容积而定，35±1℃培养16～24 小时，发酵罐的接种量为10%。
■ （2）发酵培养基：玉米液化液16～20%，115℃灭菌10～ 15min，玉米粉采用高温α-淀粉酶二次喷射液化，液化后过 滤除渣，应控制并调配其发酵培养基中蛋白质含量为0.2～ 0.4%，采用连续灭菌。
高效液相色谱 分析仪
高产柠檬酸黑曲霉的选育
■ （1）进一步提高葡萄糖进入细胞被代谢的活力，进一步增 强EMP的代谢流。
■ 手段：采用C060,γ-射线 或EMS等诱变剂进行诱变使致死率为 70-80%。
■ 选育方法为： ■ ①在高糖（蔗糖）25%的培养基平板上分离出比原株生长更
好的突变株有可能获得己糖激酶和磷酸果糖激酶活性更高的 菌株。 ■ ②选育能成长在纤维二糖上并具有2-脱氢葡萄糖抗性的突变 株有可能获得以淀粉为原料的高产柠檬酸突变株。 ■ ③进一步选育抗金属Mn2＋、Zn2＋、能力强的突变株。 ■ （2）进一步降低副产有机酸如葡萄糖酸和草酸能力，采用 基因工程的手段构建葡萄糖氧化酶和草酰乙酸水解酶丧失的 工程菌。
■ 2、温度的控制 ■ 工业生产上，所用的大发酵罐在发酵过程中一般不需要加热，
因发酵中释放了大量的发酵热，需要冷却的情况较多。 ■ 利用自动控制或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹
层或蛇行管中，通过热交换来降温，保持恒温发酵。 ■ 如果气温较高（特别是我国南方的夏季气温），冷却水的温
度又高，致使冷却效果很差，达不到预定的温度，就可采用 冷冻盐水进行循环式降温，以迅速降到最适温度。因此大工 厂需要建立冷冻站，提高冷却能力，以保证在正常温度下进 行发酵。
■ ④广泛原料适应性
■ 淀粉质原料：薯干粉、木薯粉、玉米粉、大米粉、 小麦粉、马铃薯、糖蜜、淀粉、葡萄糖母液等原料 发酵生产柠檬酸。
■ ⑤耐受多种金属离子
■ 高产柠檬酸菌株TD-01能在0.02% Mn2+ 、0.01% Zn2+ 、 0.01% Cu2+ 、0.1% Fe2+条件下不影响产酸。因此， 配制发酵培养基无须使用去离子水。
二、pH值控制
■ （1）pH值对发酵的影响 影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体 的新陈代谢；
■ 影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响 微生物对营养物的吸收和代谢产物的排泄；影响培养基中某些组 分的解离，进而微生物对这些成分的吸收；
■ pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和 比例发生改变。
采用实罐液化或一次喷射液化而玉米粉采用二次喷 射液化。 ■ ⑵发酵工艺上的主要不同为： ■ ①带渣和去渣发酵； ■ ②孢子接种和菌丝接种发酵。 ■ ⑶一次高糖浓度糖发酵和补料发酵。
柠檬酸深层发酵工艺流程
2、柠檬酸发酵原料预处理 玉米淀粉
玉米全籽淀粉 含量在68%左
右
玉米蛋白质
■ 玉米粉蛋白质含量达9.3%， ■ 蛋白质种类：醇溶蛋白、谷蛋白和球蛋白 ■ 醇溶蛋白占40%,易加热后凝固。 ■ 对柠檬酸发酵的作用：