塞络通胶囊对多发梗死性痴呆大鼠认知功能障碍的干预作用

塞络通胶囊对多发梗死性痴呆大鼠认知功能障碍的干预作用
目的：研究塞络通胶囊（塞络通）对多发梗死性痴呆（multiinfarct dementia，MID）大鼠学习记忆功能的改善作用及其机制。

方法：SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组以及塞络通高、低剂量组。

采用SD大鼠颈内动脉注射微球血管栓塞剂的方法建立多发梗死性痴呆模型；手术成功后第10天，大鼠分别灌胃给予蒸馏水、盐酸美金刚（20mg·kg-1）以及高、低剂量的塞络通（16.5，33.0mg·kg-1），每日1次，连续60d；检测塞络通不同剂量对模型大鼠Morris水迷宫潜伏期、路径长度，以及脑组织胆碱乙酰转移酶（ChAT）和乙酰胆碱酯酶（AchE）活性的影响。

结果：与假手术组比较，多发梗死性痴呆大鼠在Morris水迷宫实验中的潜伏期及路径长度均明显延长（P＜0.05或P ＜0.01），脑组织ChAT活性明显降低（P＜0.05）；塞络通干预60d后明显缩短模型大鼠在Morris水迷宫实验中的潜伏期及路径长度（P＜0.05或P＜0.01）；并且明显降低脑组织AchE活性而升高ChAT活性（P＜0.05或P＜0.01）。

结论：塞络通对多发梗死性痴呆大鼠认知功能障碍具有一定程度的改善作用，作用机制可能与其对脑组织ChAT活性以及AchE活性不同的调节相关。

标签：塞络通胶囊；多发梗死性痴呆；认知障碍
1材料
1.1动物SD种大鼠，55只，雄性，230～260g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）20070001。

1.2药物与试剂塞络通胶囊由神威药业集团提供，批号090914；盐酸美金刚片（易倍申）由丹麦灵北制药厂生产，批号200809；海藻酸钠微球血管栓塞剂（KMG），规格100～200μm，由北京圣医耀科技发展有限责任公司提供，批号20020606。

胆碱乙酰转移酶（ChAT）试剂盒、乙酰胆碱酯酶（AchE）试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所生产，批号分别为20100901，20100826，20100831；水合氯醛由国药集团化学试剂公司生产，批号20081027。

1.3仪器Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所）；Synergy4型酶标仪（美国BioTek公司）；IEC低温冷冻离心机（美国Thermo公司）；奥豪斯AR2130型电子天平（美国）。

2方法
2.1分组及给药将大鼠按体重随机分为假手术组、多发梗死性痴呆模型组、盐酸美金刚治疗组（20mg·kg-1），以及塞络通低、高剂量治疗组（16.5，3
3.0mg·kg-1）。

各组动物在适应性喂养3d后进行手术。

手术制作成功后10 d，分别灌胃给予蒸馏水（假手术组和模型组动物）及药物，灌胃体积均为10 mL·kg-1。

每日1次，连续给药60d。

2.2模型制备参照文献方法改进[3]，各组大鼠用
3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉（350mg·kg-1），颈部备毛、消毒，做正中切口，分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉。

结扎颈外动脉的远心端，动脉夹夹闭颈总动脉，行颈外动脉插管，以注射器从颈外动脉向颈内动脉注入0.1mL KMG，使栓子通过颈内动脉进入颅内至大脑各动脉，假手术组动物则从颈外动脉向颈内动脉注入0.1mL生理盐水。

松开动脉夹，结扎颈外动脉近心端，缝合伤口，回笼饲养。

注射用青霉素钠抗感染4d。

手术次日观察除假手术组之外各组动物行为表现，以前肢有行为学改变者判定为缺血模型成立（否则弃去不用）。

术后8周可形成多发梗死性痴呆模型。

2.3Morris水迷宫测定水缸宽120cm，平台高60cm，放入自来水，并调整水温至25℃，当温度低于23℃时，加热水调整水温。

水中放入墨汁，以不能看到平台为宜。

平台放入第IV象限，大鼠从第II象限面朝水缸壁入水。

训练时间为180s，若大鼠在规定时间内不能寻找到平台，则引导大鼠到平台，站立30s，使其熟悉环境。

每日每只大鼠训练1次，记录大鼠Morris水迷宫寻找平台的持续时间和路径长度等指标，共5d。

每组动物于造模后40，70d （药后30，60d）各测定2次。

2.4脑组织ChAT和AchE活性测定实验结束后快速断头取脑，称取脑组织质量加9倍生理盐水制成10%匀浆，3500r·min-1离心10min，取上清测定ChAT和AchE含量（比色法），具体操作按照试剂盒说明书进行。

2.5统计学分析实验结果以±s表示，采用单因素方差分析（OneWay ANOV A）方法，方差齐性用StudentNewmanKeuls检验，方差不齐用Tamhane′s T2检验，P＜0.05为有统计学意义。

3结果
3.1塞络通对MID大鼠Morris水迷宫潜伏期的影响给药4周时，MID 模型组大鼠经过5d训练寻找平台的时间（潜伏期）明显长于假手术组（P＜0.05）。

与模型组比较，美金刚组、塞络通高、低剂量组大鼠潜伏期均有一定程度的缩短，但无统计学意义。

给药第8周训练第1天，MID模型组大鼠水迷宫潜伏期明显长于假手术组（P＜005）。

与模型组比较，美金刚组、塞络通高、低剂量组大鼠水迷宫潜伏期均明显缩短（P＜0.05或P＜0.01）。

给药第8周训练第5天，MID模型组大鼠水迷宫潜伏期明显长于假手术组（P＜0.01）；与模型组比较，塞络通高、低剂量组大鼠水迷宫潜伏期均明显缩短（P＜0.05）；美金刚组大鼠水迷宫潜伏期也有一定程度的缩短趋势，见表1。

32塞络通对MID大鼠Morris水迷宫路径长度的影响给药4周时MID 模型组大鼠经过5d训练寻找平台的路径长度明显长于假手术组（P＜005）。

与模型组比较，美金刚组以及塞络通高、低剂量组大鼠的路径长度均有一定程度的缩短，但无统计学意义。

给药第8周训练第1天以及训练第5天，MID模型组大鼠Morris水迷宫寻找平台路径长度均明显长于假手术组（P＜005或P＜
001）。

与模型组比较，塞络通高、低剂量组大鼠寻找平台路径长度均明显缩短（P ＜005）；美金刚组路径长度也有一定程度的缩短趋势，见表2。

33塞络通对MID大鼠脑组织ChAT和AchE活性的影响MID模型组动物脑组织ChAT活性明显降低，与假手术组比较有明显的统计学意义（P＜005）。

与模型组比较，美金刚组以及塞络通高、低剂量组大鼠脑组织ChAT活性均显著升高（P＜001）；同时塞络通高、低剂量组大鼠脑组织AchE活性明显降低（P＜005或P＜001），见表3。

4讨论
MID是由于广泛的血栓或栓塞性脑血管病引起的多发性脑血管闭塞，累及脑部重要功能区域而出现坏死灶，导致认知功能障碍；是制约缺血性脑血管疾病远期疗效的重要因素。

近年来的研究显示，认知功能的下降与脑组织中广泛的小缺血灶或微梗死灶相关[1]。

多发性脑梗死动物模型的研究目前报道较多的是采用Kaneko[4]及陈俊抛[5]的方法，即由颈外动脉逆行至颈内动脉入口注入动物自体血栓。

自体血栓虽然有成本低、不排异等优点，但栓子需自行制备，带来很多难于控制的因素，并且造模时间最短的1d，最长的12d，同时仅造成动物脑组织梗死，没有达到液化坏死继而萎缩的程度，与临床病理过程尚有距离。

因此作者进行了方法改进，注射无菌、标准化、粒度均匀、已批量生产的直径100～200μm微球——海藻酸钠微球血管栓塞剂（KMG）形成多发性脑梗死，并经2个月形成脑萎缩，进而形成MID模型。

从而模拟与临床血管性痴呆发生密切相关的大脑深小部位和腔隙的梗死，而不是大范围的梗死[6]。

水迷宫研究结果显示，MID大鼠给药4周和8周时训练第5天以及给药8周训练第1天时，MID模型组大鼠水迷宫潜伏期及路径长度仍均明显长于假手术组，提示在颈动脉注射微球诱导多发性脑梗死后，大鼠出现认知功能障碍，同时也说明小的局灶性脑梗死后，广泛脑内小动脉的病变限制了功能恢复；而在给药8周训练第1天和第5天时，塞络通高、低剂量干预的MID大鼠水迷宫潜伏期及路径长度均明显缩短，则提示塞络通对MID大鼠空间的学习和记忆能力有明显的改善作用。

尽管目前对于MID的确切病理机制尚不清楚，但是越来越多的脑缺血动物实验提示胆碱能神经系统的缺失，缺血损伤后的炎症反应可导致延迟性脑损伤的发生[7]。

ACh作为胆碱能神经元传递信号的神经递质，与认知、学习及记忆有关；VD患者40%胆碱能神经元丢失，伴有皮层、海马和脑脊液中ACh活性下降。

MID患者脑脊液ACh含量显著降低[8]。

AchE是ACh的水解酶，也可作为乙酰胆碱活性的标志反映胆碱能神经元受损情况。

本研究结果显示MID模型大鼠脑组织AchE活性并未明显升高，作者认为在MID病理过程中AchE存在2个方面的变化：一方面脑缺血后，使血氧供应下降，抑制了三羧酸循环，AchE合成减少[9]；另一方面脑缺血时胆碱能神经元蜕变，使AchE释出，脑组织中可溶性AchE活性升高[10]。

因此脑缺血时脑组织AchE活性的变化是以上二者相互叠加的结果。

ChAT在胆碱能神经元细胞体内促进ACh合成，与ACh 的分布几乎平行，是胆碱能神经元的特殊标志。

尸检结果显示，血管性痴呆患者海马与颞叶皮层ChAT活性明显降低[11]。

本研究也显示MID模型大鼠脑组织
ChAT活性明显下降。

这些结果都提示MID病理过程中外在因素如缺血缺氧和自由基等干预胆碱能神经元功能，表现在ACh的生物活性平衡破坏，从而影响MID 认知能力。

而盐酸美金刚则可阻止LPS诱导慢性炎症引起的胆碱能神经元丢失，表现在盐酸美金刚组大鼠脑组织ChAT水平较模型组明显升高[12]。

因此从ACh 生物合成与分解的不同角度采取多种治疗方法增加脑组织ACh活性是改善学习记忆能力的一个重要途径。

塞络通具有益气化瘀、活血通络的功效，主要针对MID络脉瘀阻证的治疗。

既往研究显示其可以抑制慢性脑低灌注大鼠AchE活性，增加ACh含量水平[2]。

在本研究中观察塞络通对MID大鼠脑组织中影响ACh合成与分解的ChAT和AchE活性的作用，结果发现塞络通高、低剂量均能够明显促进MID大鼠脑组织ChAT活性，同时抑制AchE活性。

提示塞络通对MID大鼠认知功能的改善作用与调节脑组织中ChAT和AchE活性平衡有关，并呈现一定的量效关系。

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